一种酶法制备嘌呤霉素的方法
阅读说明：本技术 一种酶法制备嘌呤霉素的方法 (Method for preparing puromycin by enzyme method ) 是由 赵弘 于铁妹 潘俊锋 刘建 于 2021-08-04 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物合成技术领域,特别涉及一种酶法制备嘌呤霉素的方法。该方法包括如下步骤：3-氨基-D-核糖在甲基硫核糖激酶与ATP作用下,生成β-氨基核糖-1-磷酸；β-氨基核糖-1-磷酸和N,N-二甲基嘌呤在嘌呤核苷磷酸化酶作用下,生成3-氨基-N,N-二甲基腺苷；3-氨基-N,N-二甲基腺苷和甲基酪氨酸在氨基酸连接酶与ATP作用下,生成嘌呤霉素。本发明针对嘌呤霉素发酵及化学制备方法局限,开发了其酶法制备工艺。相对于传统路线,该工艺具有路线短、转化率高、反应条件温和、环保等优点,这不仅显著的降低了嘌呤霉素生产成本,同时也提高了其工业生产中安全及绿色指数。(The invention relates to the technical field of drug synthesis, in particular to a method for preparing puromycin by an enzyme method. The method comprises the following steps: the 3-amino-D-ribose generates beta-aminoribose-1-phosphate under the action of methyl thioribose kinase and ATP; the 3-amino-N, N-dimethyl adenosine is generated by the beta-amino ribose-1-phosphate and the N, N-dimethyl purine under the action of purine nucleoside phosphorylase; the puromycin is generated by the action of 3-amino-N, N-dimethyl adenosine and methyl tyrosine under the action of amino acid ligase and ATP. Aiming at the limitation of fermentation and chemical preparation methods of puromycin, the invention develops an enzymatic preparation process of puromycin. Compared with the traditional route, the process has the advantages of short route, high conversion rate, mild reaction conditions, environmental protection and the like, so that the production cost of puromycin is remarkably reduced, and the safety and green index in industrial production are improved.)
技术领域
本发明涉及药物合成技术领域，特别涉及一种酶法制备嘌呤霉素的方法。
背景技术
嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌、各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌；常用于筛选通过质粒转染/转化、病毒感染等方法能表达pac基因(puror)的真核或原核多克隆或单克隆细胞。嘌呤霉素不仅用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。嘌呤霉素的特点是快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99％的不表达pac基因的细胞。在革兰氏阳性菌、动物或昆虫细胞中，嘌呤霉素通过抑制蛋白质合成而抑制或杀死细胞。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端。
嘌呤霉素的传统制备方法包含发酵法以及化学合成法：
1)发酵法：用白黑链霉菌发酵生产，但是产率太低，并且由于副产物多，所以纯化工艺复杂，生产成本高。
2)化学合成法：Morris J.Robins报道了化学法合成嘌呤霉素，用3-叠氮-腺苷作为原料，6步化学催化制备嘌呤霉素，总收率约为26％。嘌呤霉素的化学合成法制备需要对多个官能团进行保护及脱保护，整体路线长，化学制备过程中需要用到多种有毒有害试剂(如：TMSCl、吡啶、DCC等)，所以生产过程中安全系数低，环境兼容性低，再加上整体收率并不高，所以最终生产成本高。
随着大众对工业生产中的个人安全、自然环境保护的重视，绿色化学工业是其发展的必然趋势。作为生物催化的一部分，酶催化同时兼容了化学催化浓度高以及发酵生产的环保、条件温和等特点，现正逐渐成为绿色化学发展的重要方向。而酶法制备嘌呤霉素鲜有报道。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种酶法制备嘌呤霉素的方法。该方法通过利用三步酶反应就能实现氨基核糖到嘌呤霉素的高效转化，因此在生产成本、环境保护、废气废水排放等各个方面都具有突出的优势。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种酶法制备嘌呤霉素的方法，包括如下步骤：
3-氨基-D-核糖在甲基硫核糖激酶与ATP作用下，生成β-氨基核糖-1-磷酸；
β-氨基核糖-1-磷酸和N,N-二甲基嘌呤在嘌呤核苷磷酸化酶作用下，生成3-氨基-N,N-二甲基腺苷；
3-氨基-N,N-二甲基腺苷和甲基酪氨酸在氨基酸连接酶与ATP作用下，生成嘌呤霉素。
本发明利用甲基硫核糖激酶(Kinase,EC 2.7.1.100)能磷酸化3-氨基-D-核糖得到相应的β-氨基核糖-1-磷酸，随后再嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，EC 2.4.2.1)作用下与N,N-二甲基嘌呤作用下转化成3-氨基-N,N-二甲基腺苷，最后在氨基酸连接酶的作用下(aaLigase，EC 6.3.2.28)与甲基化的酪氨酸缩合得到最终的嘌呤霉素。
在本发明中，嘌呤核苷磷酸化酶为PNP-a和/或PNP-b。
在本发明中，氨基酸连接酶为aaligase-1和/或aaligase-2。
作为优选，嘌呤核苷磷酸化酶为PNP-b，氨基酸连接酶为aaligase-1。
作为优选，在ATP参与的反应体系中，还包括由醋酸激酶和乙酰磷酸构成的ATP循环体系。
第一、三步反应中由于需要使用到三磷酸腺苷(ATP)，所以在整个系统中添加了由醋酸激酶(AK,EC 2.7.2.1)/乙酰磷酸(AcP)构成的ATP循环体系，从而大大降低了昂贵的三磷酸腺苷的用量，进一步降低了生产成本。
作为优选，本发明制备方法为多组分一锅法。
作为优选，多组分一锅法反应体系中，3-氨基-D-核糖、N,N-二甲基嘌呤、甲基酪氨酸、ATP、甲基硫核糖激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、氨基酸连接酶的比例为(50～150)mM：(50～150)mM：(50～150)mM：(1～2)mM：(1000～1500)U：(800～1500)U：(800～1500)U；
或者，3-氨基-D-核糖、N,N-二甲基嘌呤、甲基酪氨酸、ATP、乙酰磷酸、甲基硫核糖激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、氨基酸连接酶、醋酸激酶的比例为(50～150)mM：(50～150)mM：(50～150)mM：(1～2)mM：(100～300)mM：(1000～1500)U：(800～1500)U：(800～1500)U：(2000～4000)U。
优选地，多组分一锅法反应体系中，3-氨基-D-核糖、N,N-二甲基嘌呤、甲基酪氨酸、ATP、甲基硫核糖激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、氨基酸连接酶的比例为(50～150)mM：(50～150)mM：(50～150)mM：1.5mM：(1000～1500)U：(800～1500)U：(800～1500)U；
或者，3-氨基-D-核糖、N,N-二甲基嘌呤、甲基酪氨酸、ATP、乙酰磷酸、甲基硫核糖激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、氨基酸连接酶、醋酸激酶的比例为(50～150)mM：(50～150)mM：(50～150)mM：1.5mM：(100～300)mM：(1000～1500)U：(800～1500)U：(800～1500)U：(2000～4000)U。
作为优选，多组分一锅法反应体系中还包括激活剂和底物助溶剂；
作为优选，激活剂为氯化镁，底物助溶剂为异丙醇。
作为优选，多组分一锅法反应体系中，3-氨基-D-核糖、N,N-二甲基嘌呤、甲基酪氨酸、ATP、激活剂、底物助溶剂、甲基硫核糖激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、氨基酸连接酶的比例为(50～150)mM：(50～150)mM：(50～150)mM：(1～2)mM：(5～15)mM：(100～150)mL：(1000～1500)U：(800～1500)U：(800～1500)U；
或者，3-氨基-D-核糖、N,N-二甲基嘌呤、甲基酪氨酸、ATP、乙酰磷酸、激活剂、底物助溶剂、甲基硫核糖激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、氨基酸连接酶、醋酸激酶的比例为(50～150)mM：(50～150)mM：(50～150)mM：(1～2)mM：(100～300)mM：(5～15)mM：(100～150)mL：(1000～1500)U：(800～1500)U：(800～1500)U：(2000～4000)U。
优选地，多组分一锅法反应体系中，3-氨基-D-核糖、N,N-二甲基嘌呤、甲基酪氨酸、ATP、激活剂、底物助溶剂、甲基硫核糖激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、氨基酸连接酶的比例为(50～150)mM：(50～150)mM：(50～150)mM：1.5mM：10mM：(100～150)mL：(1000～1500)U：(800～1500)U：(800～1500)U；
或者，3-氨基-D-核糖、N,N-二甲基嘌呤、甲基酪氨酸、ATP、乙酰磷酸、激活剂、底物助溶剂、甲基硫核糖激酶、嘌呤核苷磷酸化酶、氨基酸连接酶、醋酸激酶的比例为(50～150)mM：(50～150)mM：(50～150)mM：1.5mM：(100～300)mM：10mM：(100～150)mL：(1000～1500)U：(800～1500)U：(800～1500)U：(2000～4000)U。
作为优选，多组分一锅法的反应条件为：pH 7.0～8.5，15～30℃搅拌2～10小时。
在本发明提供的具体实施例中，多组分一锅法的反应条件为：pH 7.0～8.5，室温搅拌4小时。
在本发明中，反应结束后还包括去除酶、采用非极性柱Seplite D101分离纯化、结晶的步骤。
作为优选，结晶为在乙醇水溶液中结晶。
在本发明提供的具体实施例中，结晶为在乙醇/水(3:2，v:v)中结晶。
本发明提供了一种酶法制备嘌呤霉素的方法。该方法包括如下步骤：3-氨基-D-核糖在甲基硫核糖激酶与ATP作用下，生成β-氨基核糖-1-磷酸；β-氨基核糖-1-磷酸和N,N-二甲基嘌呤在嘌呤核苷磷酸化酶作用下，生成3-氨基-N,N-二甲基腺苷；3-氨基-N,N-二甲基腺苷和甲基酪氨酸在氨基酸连接酶与ATP作用下，生成嘌呤霉素。本发明具有的技术效果如下：
本发明针对嘌呤霉素发酵及化学制备方法局限，开发了其酶法制备工艺。相对于传统路线，该工艺具有路线短、转化率高、反应条件温和、环保等优点，这不仅显著的降低了嘌呤霉素生产成本，同时也提高了其工业生产中安全及绿色指数。
附图说明
图1示本发明多步酶法制备嘌呤霉素的路线；
如图1所示，该路线利用3-氨基-D-核糖作为原料，在激酶(kinase)作用下磷酸化得氨基核糖-1-磷酸，然后在嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)的作用下生成3-氨基-N,N-二甲基腺苷类似物，最后在氨基酸连接酶的作用下(aaLigase)生成嘌呤霉素。
具体实施方式
本发明公开了一种酶法制备嘌呤霉素的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
酶相关信息：
甲基硫核糖激酶(Kinase)：来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(UniprotID:O31663,EC 2.7.1.100)；
嘌呤核苷磷酸化酶PNP(PNP-a&PNP-b):是以大肠杆菌(Escherichia coli)体内一个嘌呤核苷磷酸化酶2改造而来(Uniprot ID:P45563,EC 2.4.2.1)；
氨基酸连接酶aaLigase(aaligase-1&aaligase-2)：是以丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)体内的一个催化底物很宽的L-氨基酸连接酶突变而来(UniprotID:Q842E2,EC 6.3.2.28)；
醋酸激酶AK：来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(Uniprot ID:Q9WYB1,EC2.7.2.1)。
酶的氨基酸序列及DNA序列如下：
酶的发酵生产：
本专利所需的酶都是通过公司合成相应基因后构建在特定的表达质粒上再通过大肠杆菌发酵生产制得。其具体包含以下步骤：
将以上酶所对应的基因进行序列优化后在下单到通用生物公司合成(安徽滁州)，再引进NdeI/XhoI酶切位点并亚克隆到pET 28a表达载体上。确认序列正确的质粒转入E.coli(BL21)感受态细胞进行平板培养(擎科生物)以及单克隆小量液体培养，蛋白表达正确的菌最终进行逐级放大液体培养。其具体包含单菌落转入5mL含50μM卡那霉素的LB培养液中(37℃)进行培养，当细胞生长至对数期后接种到250mL含同样抗菌素的LB培养液中，同样生长到对数期时转入5L培养发酵罐里进行培养并进行最终的蛋白表达。在5L发酵罐培养中，当细胞OD约为20时加入0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)25℃诱导蛋白表达6小时，最后高速离心收集细胞(4000rpm，20min)获得酶过量表达湿细胞30-65g。取少量细胞先与三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)缓冲液(50mM，pH 8.0)在冰盆上混合均匀，然后利用冻融法破碎细胞、高速离心除细胞壁后清液跑SDS-PAGE凝胶电泳(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)确定蛋白表达。蛋白表达正确的菌体细胞用以进行下一步催化实验。具体来说，将剩余细胞与Tris.HCl缓冲液(50mM，pH 8.0)在低温混合均匀(以大约10克湿细胞:200mL缓冲液混合)，然后进行低温高压破碎细胞壁，高速离心(16000rpm，45min)除细胞壁后获得含酶清液备用(得到的酶活力在100～220U/mL，U是室温一分钟转化1μmol的底物所需酶量)。LB培养基构成为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl，1％磷酸氢二钾、1％磷酸氢二钾以及5％的甘油。
本发明中所用原料或试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：乙酰磷酸水溶液的制备
将135mL磷酸(85％，2.0mol)溶解到1.2L的乙酸乙酯中，然后冷却到0℃；往该溶液中缓慢滴加376mL冷却的醋酐(4.0mol)。上述混合液在0℃搅拌反应6小时，倒入含1升水、500克冰以及168克碳酸氢钠的5升反应瓶。混合液继续在低温搅拌直到无气泡产生。上层乙酸乙酯相分离后扔掉，剩下的水相pH值调到3左右后用2.0L、1.0L乙酸乙酯萃取两次除去大部分残余的乙酸。最后用氢氧化纳将含乙酰磷酸的水溶液pH调节至中性备用，通过酶活测试证明得到1.5L 1.2N的乙酰磷酸水溶液。
实施例2：液体酶(Kinase,PNP-a,aaligase-1,AK)一锅法制备嘌呤霉素
在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入14.9克3-氨基-D-核糖(100mM)，16.2克N,N-二甲基嘌呤烟酸(100mM)，19.5克甲基酪氨酸，0.95克MgCl2(10mM)，0.79克三磷酸腺苷单钠盐(1.5mM)，170mL上述制备的1.2N乙酰磷酸水溶液(200mM)以及100mL异丙醇(底物助溶剂)。在酶加入之前，先将溶液pH调节到8.0，然后加入1500U kinase、1500UPNP-a、800U aaligase-1以及3000U AK启动酶反应，反应过程中维持反应液在pH 7.0～8.5之间，室温搅拌4小时后酸化溶液pH至3.0变性沉淀反应液中的酶，然后pH值调回7.0后上非极性柱Seplite D101(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)分离纯化，产物嘌呤霉素粗品进一步在乙醇/水(3:2，v:v)中结晶得29.2克淡黄色固体(总收率62％)。
实施例3：液体酶(Kinase,PNP-b,aaligase-2,AK)一锅法制备嘌呤霉素
于实施例2相似，实施例3利用PNP-b和aaligase-2，而非PNP-a和aaligase-1。
在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入7.45克3-氨基-D-核糖(50mM)，8.1克N,N-二甲基嘌呤烟酸(50mM)，9.75克甲基酪氨酸，0.95克MgCl2(10mM)，0.79克三磷酸腺苷单钠盐(1.5mM)，85mL上述制备的1.2N乙酰磷酸水溶液(100mM)以及100mL异丙醇(底物助溶剂)。在酶加入之前，先将溶液pH调节到8.0，然后加入1000U kinase、800U PNP-b、1500U aaligase-2以及2000U AK启动酶反应，反应过程中维持反应液在pH 7.0～8.5之间，室温搅拌6小时后酸化溶液pH至3.0变性沉淀反应液中的酶，然后pH值调回7.0后上非极性柱Seplite D101(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)分离纯化，产物嘌呤霉素粗品进一步在乙醇/水中结晶得15.4克淡黄色固体(总收率65％)。
实施例4：液体酶(Kinase,PNP-b,aaligase-1,AK)一锅法制备嘌呤霉素
与上述实施例2、3类似，催化效果最好的PNP-b,aaligase-1被用来进行后续催化。
在1L 100mM pH 8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris.HCl)溶液中先后加入22.4克3-氨基-D-核糖(150mM)，24.3克N,N-二甲基嘌呤烟酸(150mM)，29.3克甲基酪氨酸，0.95克MgCl2(10mM)，0.79克三磷酸腺苷单钠盐(1.5mM)，255mL上述制备的1.2N乙酰磷酸水溶液(300mM)以及150mL异丙醇(底物助溶剂)。在酶加入之前，先将溶液pH调节到8.0，然后加入1200U kinase、1200U PNP-b、1200U aaligase-1以及4000U AK启动酶反应，反应过程中维持反应液在pH 7.0～8.5之间，室温搅拌6小时后酸化溶液pH至3.0变性沉淀反应液中的酶，然后pH值调回7.0后上非极性柱Seplite D101(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)分离纯化，产物嘌呤霉素粗品进一步在乙醇/水中结晶得60克浅黄色固体(总收率82％)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。