具有brd4抑制活性的异噁唑磺酰胺类化合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 具有brd4抑制活性的异噁唑磺酰胺类化合物及其制备方法和应用 (Isoxazole sulfonamide compound with BRD4 inhibitory activity and preparation method and application thereof ) 是由 张茂风 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种具有BRD4抑制活性的异噁唑磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐,所述化合物具有如通式(I)所示的结构式。本发明还提供了所述的化合物或其药学上可接受的盐或所述的药物组合物在制备用于预防或治疗与BRD4相关的癌症药物中的应用,所述的癌症包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌和胃癌等。本发明提供了一种新型BRD4抑制剂,并通过实验证明该类具有3-乙基苯并[d]异噁唑磺酰胺结构的新化合物,具有很好的BRD4蛋白抑制效果和体外抑制肿瘤细胞的效果,尤其是针对白血病细胞,部分化合物的抑制活性达到或优于阳性对照化合物。化合物还可以有效抑制c-Myc癌基因的表达。(The invention provides an isoxazole sulfonamide compound with BRD4 inhibitory activity or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the compound has a structural formula shown as a general formula (I). The invention also provides application of the compound or the pharmaceutically acceptable salt thereof or the pharmaceutical composition in preparing a medicament for preventing or treating BRD 4-related cancers, wherein the cancers comprise leukemia, lymphoma, myeloma, lung cancer, prostate cancer, pancreatic cancer, colon cancer, breast cancer, liver cancer, gastric cancer and the like. The invention provides a novel BRD4 inhibitor, and experiments prove that the novel compound with a 3-ethylbenzo [ d ] isoxazole sulfonamide structure has good BRD4 protein inhibition effect and in-vitro tumor cell inhibition effect, and especially aiming at leukemia cells, the inhibition activity of part of compounds reaches or is superior to that of a positive control compound. The compounds are also effective in inhibiting the expression of the c-Myc oncogene.)
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种具有BRD4抑制作用的异噁唑磺酰胺类化合物的制备方法、含有这些化合物的组合物及其用途。
背景技术
组蛋白赖氨酸的乙酰化修饰是重要的翻译后修饰之一。溴结构域是一类蛋白质结构域，可以识别组蛋白上的乙酰化赖氨酸，进而使染色质结构开放，促进转录激活，并与肿瘤或炎症等疾病的发生密切相关。目前，已发现61个溴结构域，存在于46个蛋白质，可以分为八个家族。BRD4是BET(Bromodomain and Extra-Terminal，溴结构域及外末端结构域)家族成员之一，含有两个溴结构域分别为BD1和BD2，通过BD1和BD2与乙酰化赖氨酸结合。
BRD4可以将正转录延伸因子b(P-TEFb)募集到启动子并激活RNA聚合酶II。此外，BRD4可以促进关键基因(Bcl-2、c-Myc和CDK6)的转录，在肿瘤细胞的增殖和细胞周期进程中起着至关重要的作用。因此，可以通过从染色质中置换BRD4来抑制关键癌基因的表达。BRD4蛋白与多种人类疾病和病症有关，包括癌症，例如急性髓性白血病(AML)、MLL、胃肠道间质瘤(GIST)、三阴性乳腺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、胆管癌、结肠癌以及炎症。
BRD4在多种肿瘤中被发现是过表达的，其功能是促进多种癌基因的表达。通过小分子化合物结合到BRD4的溴结构域口袋，可以有效抑制BRD4的功能，抑制癌基因的表达，从而起到抗癌效果。在本领域内有大量的研究文献对该机理进行了证明，一些综述文献如下：
[1]Filippakopoulos,P.,Knapp,S.Targeting bromodomains:epigeneticreaders of lysine acetylation.Nat Rev Drug Discov,13:337–356(2014).
[2]Fujisawa T,Filippakopoulos P.Functions of bromodomain-containingproteins and their roles in homeostasis and cancer.Nat Rev Mol Cell Biol,18(4):246-262(2017).
此外，还有多个BRD4抑制剂作为抗肿瘤新药在开展临床研究。
中国专利申请CN105085427A具体公开了通式(A)所示的一类苯并[d]异恶唑类化合物及其应用。该类化合物可有效抑制BET家族蛋白的溴结构域(bromodomain)，从而阻断BET家族蛋白与染色质组蛋白之间的相互作用，进而调节基因转录，引起下游信号通路的变化，并对多种疾病产生重要影响。因此本发明提供的化合物及组合物可用于制备治疗或预防肿瘤形成、炎症、病毒感染、细胞增值性紊乱、自身免疫性疾病、败血症等疾病的药物。另外，此专利中的最优化合物也在论文(Journal of Medicinal Chemistry,2018,61(7):3037-3058)中被报道，在细胞水平抗肿瘤活性评价中，该化合物对特定肿瘤细胞的选择性抑制不强，对多种肿瘤细胞都具有抑制效果，除了对白血病细胞(IC50 0.69μΜ)，对几种前列腺癌细胞和乳腺细胞，也有一定的效果(IC50 1-2μΜ)。
由于BRD4与多种肿瘤的发生与发展相关，抑制BRD4有望抑制多种肿瘤增殖。但是，对于不同的BRD4抑制剂，尽管在体外蛋白水平与BRD4有很好的结合活性，但在细胞层面，由于各化合物自身的理化性质差异(如溶解性、透膜性、代谢性质差异)，可能导致在细胞层面的活性与蛋白水平活性存在一定的差异。
因此，上述现有专利存在如下技术问题：
一、对肿瘤细胞选择性抑制效果不高，在靶向治疗单一肿瘤时可能带来潜在的副作用，即在杀伤特定肿瘤细胞的同时，也可能对其他组织细胞产生抑制影响。
二、上述现有专利的最优化合物，其与BRD4的结合活性仍需要进一步提高。化合物如果在体外靶点水平的活性不够高(即与BRD4的结合活性不够高)，在进入环境更复杂的细胞后，通过结合并抑制该靶标，进而抑制相关通路达到抑制肿瘤增殖的效果也会下降。在该情况下，为达到相同效果，则需要提高剂量，高剂量会带来高的毒副作用风险。此外，如果不先基于靶标进行筛选，直接开展细胞毒性筛选，那么化合物的靶点不明确，安全风险更大。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明目的在于提供一类新型具有BRD4抑制作用的异噁唑磺酰胺类化合物及其制备方法，另一目的在于提供其作为抗肿瘤药物的应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种异噁唑磺酰胺类化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物具有如通式(I)所示的结构式：
其中，R选自杂环基和C1-C6烷基中的任意一种；
其中，R1-R5选自H、卤素、甲氧基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基或2,3-二氢苯并呋喃基；杂环基选自噻吩或吡啶。
“烷基”是指完全饱和的烃链，该烃链可以是直链或支链的。
本发明通式(I)优选以下结构化合物：
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)乙磺酰胺(7a)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)丙烷-1-磺酰胺(7b)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)丁烷-1-磺酰胺(7c)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7d)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-氟苯磺酰胺(7e)
2-氯-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7f)
2-溴-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7g)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-甲氧基苯磺酰胺(7h)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-(三氟甲氧基)苯磺酰胺(7i)
3-氯-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7j)
3-溴-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7k)
5-氯-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-甲氧基苯磺酰胺(7l)
5-溴-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-甲氧基苯磺酰胺(7m)
5-溴-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2,3-二氢苯并呋喃-7-磺酰胺(7n)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-4-氟苯磺酰胺(7o)
4-氯-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7p)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-4-硝基苯磺酰胺(7q)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-4-甲氧基苯磺酰胺(7r)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-4-(三氟甲氧基)苯磺酰胺(7s)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2,4-二甲氧基苯磺酰胺(7t)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-甲氧基-4-硝基苯磺酰胺(7u)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-3-氟-4-甲氧基苯磺酰胺(7v)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-3,4-二甲氧基苯磺酰胺(7w)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2,3-二氢苯并呋喃-5-磺酰胺(7x)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)噻吩-2-磺酰胺(7y)
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)吡啶-3-磺酰胺(7z)
各个化合物的具体结构如表1所示：
表1优选化合物结构
更优选地，
所述的异噁唑磺酰胺类化合物为如下化合物中的任意一种：
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-4-甲氧基苯磺酰胺(7r)。
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-甲氧基苯磺酰胺(7h)。
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2,4-二甲氧基苯磺酰胺(7t)。
N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-甲氧基-4-硝基苯磺酰胺(7u)。
本发明中，药学上可接受的盐，可以包括通式(I)化合物与下列酸形成的酸加成盐：氢溴酸、盐酸、硫酸、磷酸、硼酸盐、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、苯磺酸、柠檬酸、乳酸、丙酮酸、酒石酸、乙酸、马来酸或琥珀酸、杏仁酸、富马酸、水杨酸或苯基乙酸。此外，还包括无机碱的酸式盐，如：含有碱性金属阳离子、碱土金属阳离子或铵阳离子盐。
本发明进一步提供通式(I)所示的化合物或其可药用盐或包含其的药物组合物在制备抑制BRD4的药物中的用途。
本发明进一步涉及通式(I)所示的化合物或其可药用盐或包含其的药物组合物在制备用于预防或治疗与BRD4相关的癌症药物中的应用，其中所述的癌症选自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等。更优选地，所述的癌症为白血病。
为了完成本发明的合成目的，本发明采用如下的合成技术方案制备通式(I)化合物：
其中，R选自杂环基和C1-C6烷基中的任意一种；
其中，R1-R5选自H、卤素、甲氧基、硝基、三氟甲基、三氟甲氧基或2,3-二氢苯并呋喃基；杂环基选自噻吩或吡啶。
“烷基”是指完全饱和的烃链，该烃链可以是直链或支链的。
所述的通式(I)化合物的制备方法，具体包括如下步骤：
1)取2,4-二甲氧基苯胺、乙酸酐和三乙胺进行N-乙酰化反应，得到化合物2；2,4-二甲氧基苯胺、乙酸酐、三乙胺的摩尔比为1：(1.5-2)：(1.5-3)，溶剂为二氯甲烷，反应温度为室温，反应时间为4～12h；
2)取化合物2、丙酰氯、无水三氯化铝进行傅克反应，得到化合物3；化合物2、丙酰氯、无水三氯化铝的摩尔比为1：3：(3.5-4)，溶剂为二氯甲烷，反应温度为40～43℃，反应时间为2～3h；
3)取化合物3、盐酸羟胺、无水乙酸钠进行肟化反应，得到化合物4；化合物3、盐酸羟胺、无水乙酸钠的摩尔比为1：(1.5-2)：(1.5-2)，溶剂为乙醇-水混合溶剂，反应温度为80℃，反应时间为1.5～3h；
4)取化合物4和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛进行脱水环合反应，得到化合物5；化合物4、N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛的摩尔比为1：(4-5)，溶剂为1,4-二氧六环，反应温度为100℃，反应时间为10min；
5)取化合物5与稀盐酸进行水解反应，得到化合物6；化合物5与稀盐酸(3mol/L)的重量/体积比(g/ml)为1：20-30，反应温度为90℃，反应时间为3-4h；
6)取化合物6与不同磺酰氯进行N-磺酰化反应，得到最终产物；化合物6与磺酰氯的摩尔比为1：(1.1-2)，吡啶加入量为0.005ml每mg化合物6，溶剂为二氯甲烷，反应温度为40-43℃，反应时间为1.5-3h。
优选地，
所述的步骤1)中，所述的2,4-二甲氧基苯胺、乙酸酐、三乙胺的摩尔比为1：1.8：1.6。
所述的步骤2)中，所述的化合物2、丙酰氯、无水三氯化铝的摩尔比为1：3：4。
所述的步骤3)中，所述的化合物3、盐酸羟胺、无水乙酸钠的摩尔比为1：2：1.6。
所述的步骤4)中，所述的化合物4、N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛的摩尔比为1：4.6。
所述的步骤5)中，所述的化合物5与稀盐酸(3mol/L)的重量/体积比(g/ml)为1：26。
所述的步骤6)中，所述的化合物6与磺酰氯的摩尔比为1：1.2。
本发明的技术效果在于：
1)本发明通过在化合物骨架的3位引入乙基，提高了该位置与蛋白的结合效果，并将上部取代基进行筛选，得到的最优化合物活性高于现有技术化合物。此外，在肿瘤细胞活性评价层面，新化合物对白血病细胞具有更好的选择性，对前列腺癌和乳腺癌等其他细胞的活性较差(>20μΜ)。
2)本发明提供的新型BRD4抑制剂，实验证明该类具有3-乙基苯并[d]异噁唑磺酰胺结构的新化合物，具有很好的BRD4蛋白抑制效果和体外抑制肿瘤细胞的效果，尤其是针对白血病细胞，部分化合物的抑制活性达到或优于阳性对照化合物。化合物还可以有效抑制c-Myc癌基因的表达。作为新型BRD4抑制剂，为肿瘤等疾病的治疗提供新的候选药物。
3)本发明还提供了此BRD4抑制剂的合成方法，通过设计合成路线，高效制备得到目标化合物。
附图说明
图1为本发明的部分代表性化合物的抑制曲线。
图2为本发明的化合物7r对癌基因抑制活性测试结果。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本发明，这些实施例仅用于说明本发明并非限制本发明的范围。
实施例1N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)乙磺酰胺(7a)
步骤1N-(2,4-二甲氧基苯基)乙酰胺(2)的制备在干燥的250mL反应瓶中依次加入2,4-二甲氧基苯胺(15g,97.9mmol)，二氯甲烷(40mL)，冷却至0℃，在搅拌下加入乙酸酐(18.0g,176.3mmol)，后缓慢滴加三乙胺(15.9g,156.7mmol)，室温搅拌4h后，TLC检测反应结束。减压蒸除溶剂，加稀盐酸，抽滤，滤饼用稀盐酸洗涤2次，干燥，得白色固体16.5g，收率86.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:8.99(s,1H),7.64(d,J＝8.7Hz,1H),6.59(s,1H),6.45(d,J＝8.8Hz,1H),3.79(s,3H),3.73(s,3H),2.01(s,3H)；MS-ESI,m/z:196.1(M+H)+。.
步骤2N-(4-羟基-2-甲氧基-5-丙酰基苯基)乙酰胺(3)的制备在干燥的250mL反应瓶中加入N-(2,4-二甲氧苯基)乙酰胺(2)(15.0g,76.8mmol)，二氯甲烷(40mL)，置冰浴，加入丙酰氯(21.3g,230.5mmol)，剧烈搅拌，随后分批加无水三氯化铝(41.0g,307.4mmol)。升温至43℃，搅拌3h，TLC检测反应完毕。将混合物滴至碎冰中淬灭，分离有机层，减压浓缩，向剩余物中滴加稀盐酸(80mL)，搅拌0.5h，抽滤，用水洗涤滤饼，干燥，得到目标化合物为淡绿色固体14.5g，收率79.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:12.57(s,1H),9.19(brs,1H),8.30(s,1H),6.58(s,1H),3.87(s,3H),2.95(q,J＝7.2Hz,2H),2.05(s,3H),1.09(t,J＝7.2Hz,3H)；MS-ESI,m/z:238.1(M+H)+。
步骤3N-(4-羟基-5-(1-(羟基亚氨基)丙基)-2-甲氧基苯基)乙酰胺(4)的制备在干燥的250mL反应瓶中加入化合物(3)(12.0g,50.6mmol)，乙醇-水混合溶剂(135mL，无水乙醇:水＝7:3,v/v)，盐酸羟胺(7.0g,101.2mmol)和无水乙酸钠(6.6g,80.9mmol)，升温至80℃搅拌2h。TLC检测反应完毕，冷却，减压浓缩溶剂至剩余体积的三分之一，加水(125mL)，将析出的固体抽滤，水洗，干燥，得到目标化合物为淡绿色固体10.5g，收率82.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:11.80(s,1H),11.31(s,1H),9.07(brs,1H),7.87(s,1H),6.55(s,1H),3.80(s,3H),2.70(q,J＝7.5Hz,2H),2.03(s,3H),1.08(t,J＝7.5Hz,3H)；MS-ESI,m/z:253.1(M+H)+。
步骤4N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)乙酰胺(5)的制备在干燥的250mL反应瓶中加入化合物(4)(10.0g,39.6mmol)和1,4-二氧六环(50mL)，在剧烈搅拌下滴加N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(DMF-DMA)(24mL)。升温至100℃，反应10min。TLC检测反应完毕，加入稀盐酸(80mL)和水(200mL)，搅拌，将析出的固体抽滤，水洗，干燥，得到目标化合物为淡绿色固体5.1g，收率54.9％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ:9.29(brs,1H),8.27(s,1H),7.37(s,1H),3.93(s,3H),2.91(q,J＝7.6Hz,2H),2.11(s,3H),1.30(t,J＝7.6Hz,3H)；MS-ESI,m/z:235.1(M+H)+。
步骤5 3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-胺(6)的制备在250mL反应瓶中加入化合物(5)(3.7g,15.8mmol)以及盐酸(3mol/L,95mL)，90℃加热搅拌3h，TLC检测反应完毕。用氢氧化钠溶液调节pH至7～9，将析出的沉淀抽滤，水洗，干燥，得到目标化合物为黄褐色固体2.9g，收率95.5％。1H NMR(400MHz,CDCl3),δ:6.92(s,1H),6.82(s,1H),3.92(s,3H),3.85(brs,2H),2.89(q,J＝7.6Hz,2H),1.38(t,J＝7.6Hz,3H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ159.00,158.75,151.19,133.75,113.77,102.82,91.52,77.38,77.06,76.74,55.91,18.90,12.19；MS-ESI,m/z:193.1(M+H)+。
步骤6N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)乙磺酰胺(7a)的制备在干燥的100mL反应瓶中，加入二氯甲烷(6mL)，化合物6(60mg,0.31mmol)和乙基磺酰氯(47.6mg,0.37mmol)，最后滴入吡啶(0.3mL)。混合物加热回流搅拌2h，TLC监测反应。加入稀盐酸(10mL)和水(20mL)，用乙酸乙酯(15mL×2)萃取，有机层用水洗一次，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，剩余物通过硅胶柱层析纯化，得到目标化合物。White solid；yield:54.9％；m.p.:122–123℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(s,1H,7-ArH),7.05(s,1H,4-ArH),6.78(brs,1H,SO2NH),3.99(s,3H,OCH3),3.04(q,J＝7.4Hz,2H,SO2CH 2CH3),2.96(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.41(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3),1.34(t,J＝7.4Hz,3H,SO2CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.35,159.85,152.37,123.45,114.51,112.75,92.22,56.51,45.51,18.84,12.11,8.12；LC-MS(ESI)m/z calcd for C12H16N2O4S[M+H]+:285.0831；found:285.0.
实施例2N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)丙烷-1-磺酰胺(7b)
参照实施例1方法制备，用化合物6与丙基磺酰氯作为反应物。White solid；yield:39.4％；m.p.:108–109℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(s,1H,7-ArH),7.05(s,1H,4-ArH),6.76(s,1H,SO2NH),3.99(s,3H,OCH3),3.05–2.90(m,4H,SO2CH 2,3-CH 2CH3),1.88–1.76(m,2H,SO2CH2CH 2),1.41(t,J＝7.5Hz,3H,3-CH2CH 3),0.99(t,J＝7.4Hz,3H,CH2CH2CH 3)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ161.35,159.87,152.40,123.49,114.53,112.75,92.22,56.52,52.94,18.85,17.20,12.92,12.11；LC-MS(ESI)m/z calcd for C13H18N2O4S[M+H]+:299.0987；found:299.1.
实施例3N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)丁烷-1-磺酰胺(7c)
参照实施例1方法制备，用化合物6与1-丁磺酰氯作为反应物。White solid；yield:48％；m.p.:100–102℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(s,1H,7-ArH),7.05(s,1H,4-ArH),6.76(s,1H,SO2NH),3.99(s,3H,OCH3),3.10–2.85(m,4H,SO2CH 2,3-CH 2CH3),1.85–1.75(m,2H,SO2CH2CH 2),1.51–1.28(m,5H,3-CH2CH 3,SO2CH2CH2CH 2),0.88(t,J＝7.0Hz,3H,CH2CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.36,159.88,152.39,123.49,114.53,112.79,92.21,56.48,50.94,25.41,21.44,18.85,13.56,12.11；LC-MS(ESI)m/z calcd forC14H20N2O4S[M+H]+:313.1144；found:313.1.
实施例4 N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7d)
参照实施例1方法制备，用化合物6与苯磺酰氯作为反应物。White solid；yield:47.8％；m.p.:169–170℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(s,1H,ArH),7.74–7.56(m,2H,phenyl ArH),7.56–7.30(m,3H,phenyl ArH),6.91(brs,1H,SO2NH),6.81(s,1H,4-ArH),3.62(s,3H,OCH3),2.97(d,J＝5.5Hz,2H,3-CH 2CH3),1.42(s,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.74,159.90,153.16,138.80,133.05,128.77(2×C),127.22(2×C),122.92,114.87,114.36,91.94,56.12,18.88,12.121；LC-MS(ESI)m/z calcd forC16H16N2O4S[M+H]+:333.0831；found:333.0.
实施例5N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-氟苯磺酰胺(7e)
参照实施例1方法制备，用化合物6与2-氟苯磺酰氯作为反应物。White solid；yield:54.4％；m.p.:179–180℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.73(d,J＝7.4Hz,2H,6'-ArH,7-ArH),7.58–7.43(m,1H,4'-ArH),7.29(brs,1H,SO2NH),7.20–7.07(m,2H,3',5'-ArH),6.85(s,1H,4-ArH),3.77(s,3H,OCH3),2.94(q,J＝7.5Hz,2H,3-CH 2CH3),1.39(t,J＝7.5Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.60,160.36(d,J＝257.6Hz,F-2'-ArC),159.83,157.81(d,J＝257.6Hz,F-2'-ArC),153.03,135.54(d,J＝9.1Hz,F-4'-ArC),135.45(d,J＝9.1Hz,F-4'-ArC),130.90,126.83(d,J＝13.1Hz,F-1'-ArC),126.70(d,J＝13.1Hz,F-1'-ArC),124.17(d,J＝4.0Hz,F-6'-ArC),124.13(d,J＝4.0Hz,F-6'-ArC),122.48,116.87(d,J＝21.2Hz,F-3'-ArC),116.66(d,J＝21.2Hz,F-3'-ArC),114.26,114.23,91.90,56.18,18.82,12.09；LC-MS(ESI)m/z calcd for C16H15FN2O4S[M+H]+:351.0737；found:351.0.
实施例6 2-氯-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7f)
参照实施例1方法制备，用化合物6与2-氯苯磺酰氯作为反应物。White solid；yield:54.4％；m.p.:121–122℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.93(dd,J＝7.9,1.3Hz,1H,6'-ArH,),7.70(s,1H,7-ArH),7.55(brs,1H,SO2NH),7.51–7.46(m,1H,3'-ArH),7.43(td,J＝7.7,1.4Hz,1H,4'-ArH),7.30–7.24(m,1H,5'-ArH),6.85(s,1H,4-ArH),3.78(s,3H,OCH3),2.93(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.38(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.45,159.78,152.83,136.24,134.10,132.06,131.81,131.61,126.81,122.62,114.19,113.57,91.93,56.13,18.81,12.10；LC-MS(ESI)m/z calcd for C16H15ClN2O4S[M+H]+:367.0441；found:367.0.
实施例7 2-溴-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7g)
参照实施例1方法制备，用化合物6与2-溴苯磺酰氯作为反应物。White solid；yield:64.7％；m.p.:141–143℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.00–7.93(m,1H,3'-ArH),7.73–7.67(m,2H,7-ArH,6'-ArH),7.64(brs,1H,SO2NH),7.38–7.28(m,2H,4',5'-ArH),6.85(s,1H,4-ArH),3.78(s,3H,OCH3),2.93(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.38(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.46,159.78,152.84,137.96,135.14,134.04,132.04,127.39,122.63,120.31,114.18,113.61,91.94,56.08,18.82,12.11；LC-MS(ESI)m/zcalcd for C16H15BrN2O4S[M+H]+:410.9936；found:411.0.
实施例8N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-甲氧基苯磺酰胺(7h)
参照实施例1方法制备，用化合物6与2-甲氧基苯磺酰氯作为反应物。Whitesolid；yield:71.7％；m.p.:142–143℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(d,J＝7.6Hz,1H,6'-ArH),7.72(s,1H,7-ArH),7.59(brs,1H,SO2NH),7.45(t,J＝7.7Hz,1H,4'-ArH),7.00–6.90(m,2H,3',5'-ArH),6.86(s,1H,4-ArH),3.96(s,3H,2'-OCH3),3.83(s,3H,6-OCH3),2.91(q,J＝7.5Hz,2H,3-CH 2CH3),1.36(t,J＝7.5Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ160.91,159.81,156.45,152.21,135.05,130.94,126.20,123.72,120.27,114.21,111.97,111.80,91.81,56.35,56.10,18.79,12.10；LC-MS(ESI)m/z calcd for C17H18N2O5S[M+H]+:363.0936；found:363.1.
实施例9N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-(三氟甲氧基)苯磺酰胺(7i)
参照实施例1方法制备，用化合物6与2-(三氟甲氧基)苯磺酰氯作为反应物。Whitesolid；yield:67.9％；m.p.:92–93℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H,6'-ArH),7.73(s,1H,7-ArH),7.55(td,J＝8.4,1.6Hz,1H,4'-ArH),7.38–7.30(m,2H,SO2NH,3'-ArH),7.26(td,J＝8.0,0.8Hz,1H,5'-ArH),6.87(s,1H,4-ArH),3.79(s,3H,OCH3),2.93(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.38(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.43,159.82,152.61,146.22,134.92,131.69,130.09,125.90,124.16(q,J＝262.6Hz,OCF3),122.56,121.56(q,J＝262.6Hz,OCF3),118.97(q,J＝262.6Hz,OCF3),118.95,116.37(q,J＝262.6Hz,OCF3),114.24,113.24,91.89,56.13,18.81,12.10；LC-MS(ESI)m/z calcd for C17H15F3N2O5S[M+H]+:417.0654；found:417.0.
实施例10 3-氯-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7j)
参照实施例1方法制备，用化合物6与3-氯苯磺酰氯作为反应物。White solid；yield:53.5％；m.p.:152–153℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(s,1H,7-ArH),7.73(s,1H,2'-ArH),7.51(d,J＝7.8Hz,1H,6'-ArH),7.47(d,J＝8.1Hz,1H,4'-ArH),7.30(t,J＝7.9Hz,1H,5'-ArH),6.95(brs,1H,SO2NH),6.85(s,1H,4-ArH),3.68(s,3H,OCH3),2.98(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.43(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.91,159.89,153.22,140.49,135.01,133.12,130.00,127.35,125.39,122.34,115.35,114.45,92.06,56.19,18.87,12.12；LC-MS(ESI)m/z calcd for C16H15ClN2O4S[M+H]+:367.0441；found:367.0.
实施例11 3-溴-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7k)
参照实施例1方法制备，用化合物6与3-溴苯磺酰氯作为反应物。White solid；yield:70.7％；m.p.:160–161℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.89(s,1H,2'-ArH),7.77(s,1H,7-ArH),7.62(d,J＝7.8Hz,1H,6'-ArH),7.55(d,J＝7.7Hz,1H,4'-ArH),7.23(t,J＝8.0Hz,1H,5'-ArH),6.96(brs,1H,SO2NH),6.85(s,1H,4-ArH),3.68(s,3H,OCH3),2.98(q,J＝7.5Hz,2H,3-CH 2CH3),1.43(t,J＝7.5Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.93,159.88,153.25,140.61,136.00,130.20,130.19,125.82,122.71,122.31,115.45,114.44,92.06,56.21,18.87,12.13；LC-MS(ESI)m/z calcd for C16H15BrN2O4S[M+H]+:410.9936；found:411.0.
实施例12 5-氯-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-甲氧基苯磺酰胺(7l)
参照实施例1方法制备，用化合物6与2-甲氧基苯磺酰氯作为反应物。Whitesolid；yield:71.4％；m.p.:157–158℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝2.4Hz,1H,6'-ArH),7.72(s,1H,7-ArH),7.57(brs,1H,SO2NH),7.40(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H,4'-ArH),6.94–6.84(m,2H,4-ArH,3'-ArH),3.95(s,3H,2'-OCH3),3.84(s,3H,6-OCH3),2.94(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.38(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.07,159.85,155.03,152.24,134.64,130.52,127.69,125.57,123.21,114.34,113.20,112.46,91.96,56.50,56.39,18.81,12.10；LC-MS(ESI)m/z calcd for C17H17ClN2O5S[M+H]+:397.0547；found:397.0.
实施例13 5-溴-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-甲氧基苯磺酰胺(7m)
参照实施例1方法制备，用化合物6与5-溴-2-甲氧基苯磺酰氯作为反应物。Whitesolid；yield:43.5％；m.p.:167–168℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝2.4Hz,1H,6'-ArH),7.72(s,1H,7-ArH),7.60–7.50(m,2H,SO2NH,4'-ArH),6.89(s,1H,4-ArH),6.83(d,J＝8.8Hz,1H,3'-ArH),3.94(s,3H,2'-OCH3),3.84(s,3H,6-OCH3),2.94(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.39(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.07,159.87,155.53,152.21,137.59,133.31,128.05,123.21,114.38,113.63,112.43(2×C),91.98,56.46,56.40,18.84,12.15；LC-MS(ESI)m/z calcd for C17H17BrN2O5S[M+H]+:441.0042；found:441.0.
实施例14 5-溴-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2,3-二氢苯并呋喃-7-磺酰胺(7n)
参照实施例1方法制备，用化合物6与5-溴苯-2,3-二氢苯并呋喃-7-磺酰氯作为反应物。White solid；yield:84.0％；m.p.:152–153℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.70(s,1H,7-ArH),7.64(d,J＝1.5Hz,1H,6'-ArH),7.41(brs,1H,SO2NH),7.39(d,J＝1.5Hz,1H,4'-ArH),6.90(s,1H,4-ArH),4.70(t,J＝8.8Hz,2H,OCH 2CH2),3.84(s,3H,OCH3),3.21(t,J＝8.8Hz,2H,OCH2CH 2),2.94(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.39(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ161.11,159.87,156.13,152.23,132.86,131.98,130.16,123.08,121.76,114.26,112.09,111.71,91.98,73.60,56.36,28.88,18.83,12.16；LC-MS(ESI)m/zcalcd for C18H17BrN2O5S[M+H]+:453.0042；found:453.0.
实施例15 N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-4-氟苯磺酰胺(7o)
参照实施例1方法制备，用化合物6与4-氟苯磺酰氯作为反应物。White solid；yield:61.0％；m.p.:140–142℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(s,1H,7-ArH),7.73–7.64(m,2H,2',6'-ArH),7.10–7.00(m,2H,3',5'-ArH),6.91(brs,1H,SO2NH),6.85(s,1H,4-ArH),3.67(s,3H,OCH3),2.97(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.42(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ166.52,163.98,161.85(d,J＝199.0Hz,F-4'-ArC),159.88(d,J＝199.0Hz,F-4'-ArC),153.18,134.89(d,J＝4.0Hz,F-1'-ArC),134.85(d,J＝4.0Hz,F-1'-ArC),130.03(d,J＝9.1Hz,F-3',5'-ArC),129.94(d,J＝9.1Hz,F-2',6'-ArC),122.64,116.14(d,J＝22.2Hz,F-2',6'-ArC),115.92(d,J＝22.2Hz,F-3',5'-ArC),115.19,114.46,92.02,56.16,18.87,12.11；LC-MS(ESI)m/z calcd for C16H15FN2O4S[M+H]+:351.0737；found:351.0.
实施例16 4-氯-N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)苯磺酰胺(7p)
参照实施例1方法制备，用化合物6与4-氯苯磺酰氯作为反应物。White solid；yield:55.3％；m.p.:177–178℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(s,1H,7-ArH),7.60(d,J＝7.4Hz,2H,2',6'-ArH),7.35(d,J＝7.4Hz,2H,3',5'-ArH),6.92(brs,1H,SO2NH),6.85(s,1H,4-ArH),3.66(s,3H,OCH3),2.98(d,J＝7.1Hz,2H,3-CH 2CH3),1.43(d,J＝6.7Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.84,159.86,153.15,139.62,137.31,129.07(2×C),128.66(2×C),122.51,115.18,114.45,92.07,56.18,18.88,12.11；LC-MS(ESI)m/z calcdfor C16H15ClN2O4S[M+H]+:367.0441；found:367.0.
实施例17 N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-4-硝基苯磺酰胺(7q)
参照实施例1方法制备，用化合物6与对硝基苯磺酰氯作为反应物。White solid；yield:71.4％；m.p.:168–169℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.23(d,J＝8.8Hz,2H,3',5'-ArH),7.87(d,J＝8.8Hz,2H,2',6'-ArH),7.82(s,1H,7-ArH),7.02(brs,1H,SO2NH),6.86(s,1H,4-ArH),3.66(s,3H,OCH3),2.99(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.44(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.02,159.83,153.11,150.24,144.62,128.52(2×C),123.99(2×C),121.77,115.71,114.62,92.26,56.24,18.88,12.10；LC-MS(ESI)m/zcalcd for C16H15N3O6S[M+H]+:378.0682；found:378.0.
实施例18 N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-4-甲氧基苯磺酰胺(7r)
参照实施例1方法制备，用化合物6与对甲氧基苯磺酰氯作为反应物。Whitesolid；yield:85.0％；m.p.:145–146℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(s,1H,7-ArH),7.61(d,J＝8.9Hz,2H,2',6'-ArH),6.92(brs,1H,SO2NH),6.85–6.79(m,3H,4-ArH,3',5'-ArH),3.79(s,3H,6-OCH3),3.68(s,3H,4'-OCH3),2.97(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.42(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.13,161.58,159.88,153.01,130.33,129.41(2×C),123.24,114.29,114.22,113.89(2×C),91.91,56.18,55.59,18.86,12.13；LC-MS(ESI)m/z calcd for C17H18N2O5S[M+H]+:363.0936；found:363.1.
实施例19N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-4-(三氟甲氧基)苯磺酰胺(7s)
参照实施例1方法制备，用化合物6与4-(三氟甲氧基)苯磺酰氯作为反应物。Whitesolid；yield:83.1％；m.p.:127–128℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(s,1H,7-ArH),7.71(d,J＝8.8Hz,2H,2',6'-ArH),7.21(d,J＝8.4Hz,2H,3',5'-ArH),6.88(brs,1H,SO2NH),6.84(s,1H,4-ArH),3.62(s,3H,OCH3),2.98(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.43(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.00,159.89,153.38,152.33,137.19,129.38(2×C),124.03(q,J＝260.6Hz,OCF3),122.33,121.45(q,J＝260.6Hz,OCF3),120.64(2×C),118.87(q,J＝260.6Hz,OCF3),116.29(q,J＝260.6Hz,OCF3),115.91,114.52,92.03,56.04,18.88,12.09；LC-MS(ESI)m/z calcd for C17H15F3N2O5S[M+H]+:417.0654；found:417.0.
实施例20 N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2,4-二甲氧基苯磺酰胺(7t)
参照实施例1方法制备，用化合物6与2,4-二甲氧基苯磺酰氯作为反应物。Whitesolid；yield:78.2％；m.p.:151–152℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80–7.72(m,1H,6'-ArH),7.70(s,1H,7-ArH),7.53(brs,1H,SO2NH),6.87(s,1H,4-ArH),6.45–6.35(m,2H,3',5'-ArH),3.90(s,3H,2'-OCH3),3.86(s,3H,6-OCH3),3.78(s,3H,4'-OCH3),2.91(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.36(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.12,160.80,159.82,157.94,152.08,132.80,124.03,118.28,114.19,111.47,103.99,99.21,91.78,56.37,56.05,55.68,18.80,12.13；LC-MS(ESI)m/z calcd for C18H20N2O6S[M+H]+:393.1042；found:393.1.
实施例21N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2-甲氧基-4-硝基苯磺酰胺(7u)
参照实施例1方法制备，用化合物6与2-甲氧基-4-硝基苯磺酰氯作为反应物。White solid；yield:57.7％；m.p.:215–216℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.99(d,J＝8.7Hz,1H,6'-ArH),7.85–7.77(m,2H,3',5'-ArH),7.74(s,1H,7-ArH),7.59(brs,1H,SO2NH),6.89(s,1H,4-ArH),4.10(s,3H,2'-OCH3),3.84(s,3H,6-OCH3),2.93(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.38(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.28,159.76,157.03,152.38,151.73,132.38,131.82,122.60,115.17,114.46,113.21,107.04,92.12,56.99,56.49,18.81,12.08；LC-MS(ESI)m/z calcd for C17H17N3O7S[M+H]+:408.0787；found:408.0.
实施例22 N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-3-氟-4-甲氧基苯磺酰胺(7v)
参照实施例1方法制备，用化合物6与3-氟-4-甲氧基苯磺酰氯作为反应物。Whitesolid；yield:74.6％；m.p.:203–205℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(s,1H,7-ArH),7.55–7.33(m,2H,2',6'-ArH),6.94(brs,1H,SO2NH),6.91–6.80(m,2H,4-ArH,5'-ArH),3.88(s,3H,4'-OCH3),3.73(s,3H,6-OCH3),2.97(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.42(t,J＝7.4Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.68,159.88,152.96,152.70(d,J＝252.5Hz,F-3'-ArC),151.74(d,J＝10.1Hz,F-4'-ArC),151.64(d,J＝10.1Hz,F-4'-ArC),150.20(d,J＝252.5Hz,F-3'-ArC),130.65(d,J＝6.1Hz,F-1'-ArC),130.59(d,J＝6.1Hz,F-1'-ArC),124.73(d,J＝4.0Hz,F-5'-ArC),124.69(d,J＝4.0Hz,F-5'-ArC),122.82,115.39(d,J＝21.2Hz,F-2'-ArC),115.18(d,J＝21.2Hz,F-2'-ArC),114.40,112.38,112.36,92.05,56.40,56.26,18.88,12.13；LC-MS(ESI)m/z calcd for C17H17FN2O5S[M+H]+:381.0842；found:381.0.
实施例23 N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-3,4-二甲氧基苯磺酰胺(7w)
参照实施例1方法制备，用化合物6与3,4-二甲氧基苯磺酰氯作为反应物。Whitesolid；yield:57.9％；m.p.:144–145℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(s,1H,7-ArH),7.31–7.26(m,1H,5'-ArH),7.14(d,J＝2.1Hz,1H,2'-ArH),6.95(brs,1H,SO2NH),6.84(s,1H,4-ArH),6.77(d,J＝8.5Hz,1H,6'-ArH),3.86(s,3H,6-OCH3),3.76(s,3H,3'-OCH3),3.69(s,3H,4'-OCH3),2.96(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.41(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.58,159.83,153.05,152.78,148.79,130.32,123.27,121.36,114.25,114.21,110.10,109.48,91.94,56.22,56.15,56.10,18.87,12.17；LC-MS(ESI)m/zcalcd for C18H20N2O6S[M+H]+:393.1042；found:393.1.
实施例24 N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)-2,3-二氢苯并呋喃-5-磺酰胺(7x)
参照实施例1方法制备，用化合物6与2,3-二氢苯并呋喃-5-磺酰氯作为反应物。White solid；yield:58.3％；m.p.:207–208℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.75(s,1H,7-ArH),7.54–7.46(m,2H,2',6'-ArH),6.92(brs,1H,SO2NH),6.86(s,1H,4-ArH),6.70(d,J＝8.2Hz,1H,3'-ArH),4.61(t,J＝8.8Hz,2H,OCH 2CH2),3.15(t,J＝8.8Hz,2H,OCH2CH 2),2.97(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.41(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.09,161.47,159.87,152.87,130.32,128.94,128.00,124.57,123.39,114.29,113.72,109.28,91.93,72.28,56.23,28.93,18.88,12.15；LC-MS(ESI)m/z calcd for C18H18N2O5S[M+H]+:375.0936；found:375.1.
实施例25 N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)噻吩-2-磺酰胺(7y)
参照实施例1方法制备，用化合物6与噻吩-2-磺酰氯作为反应物。White solid；yield:71.4％；m.p.:171–172℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(s,1H,7-ArH),7.50(dd,J＝5.0,1.2Hz,1H,thiophen 5-H),7.40(dd,J＝3.7,1.2Hz,1H,thiophen 3-H),7.04(brs,1H,SO2NH),6.96(t,J＝4.0Hz,1H,thiophen 4-H),6.88(s,1H,4-ArH),3.72(s,3H,OCH3),2.98(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.43(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.79,159.93,153.21,139.10,132.70,132.51,127.16,122.79,114.66,114.35,91.98,56.24,18.87,12.14；LC-MS(ESI)m/z calcd for C14H14N2O4S2[M+H]+:339.0395；found:339.0.
实施例26 N-(3-乙基-6-甲氧基苯并[d]异噁唑-5-基)吡啶-3-磺酰胺(7z)
参照实施例1方法制备，用化合物6与吡啶-3-磺酰氯作为反应物。White solid；yield:69.2％；m.p.:171–173℃；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.91(s,1H,pyridine 2-H),8.72(d,J＝4.0Hz,1H,pyridine 4-H),7.92(d,J＝8.1Hz,1H,pyridine 6-H),7.81(s,1H,7-ArH),7.38–7.30(m,1H,pyridine 5-H),7.12(s,1H,SO2NH),6.84(s,1H,4-ArH),3.63(s,3H,OCH3),2.98(q,J＝7.6Hz,2H,3-CH 2CH3),1.43(t,J＝7.6Hz,3H,3-CH2CH 3)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.09,159.85,153.33,153.20(2×C),147.92,135.06,123.41,121.88,116.21,114.57,92.18,56.19,18.86,12.09；LC-MS(ESI)m/z calcd for C15H15N3O4S[M+H]+:334.0783；found:334.0.
实施例27 BRD4蛋白抑制活性测试(TSA实验)
使用Bio-Rad CFX96实时PCR系统进行热迁移分析。加入10μL的生化反应体系，包含1μL BRD4 BD1蛋白(100μM)，1μL荧光染料(100倍稀释液，SYPRO Orange，ABI，Sigma)和1μL缓冲液(100mM HEPES，1500mM NaCl，50％(v/v)甘油，pH值7.5)，3μL去离子水和4μL化合物(500μM)。将上述反应混合物添加至96孔板，贴膜，室温下以1000r/min离心1分钟，然后在黑暗条件下冰上孵育30分钟。将孵育好的96孔反应板放入实时定量PCR仪，SYPRO Orange染料的激发和发射波长分别设置在465nm和590nm，设置程序升温范围30℃～80℃，温度变化间隔为0.3℃，每5秒检测一次，保存文件。使用GraphPad Prism拟合熔融曲线，计算熔融温度(Tm)。ΔTm代表测试反应和空白反应的Tm值之差。所有实验采用三个复孔进行测试。结果见表2。蛋白表达与纯化参照现有技术完成，所用的质粒cDNA(pET24a-H6-Thr-BRD4(1)(residues N44-E168))由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
表2 TSA法测定化合物与BRD4(1)蛋白的结合活性
注：对照药物选自CN 105085427A中的最优化合物(实施例37化合物)，该化合物也是Journal of Medicinal Chemistry,2018,61(7):3037-3058中的化合物6i。
生物活性测试结果表明，本发明所提供的通式(I)化合物具有很好的BRD4蛋白结合效果(抑制效果)，大部分化合物对BRD4的结合活性达到或优于阳性对照化合物。
实施例28 CellTiter法肿瘤细胞抑制活性测试
MV4-11细胞(ATCC,Rockville,MD,USA)在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的IMDM中(威佳试剂公司)，于37℃下在含有5％CO2的加湿培养箱中培养。将细胞以每孔1500个细胞接种在384孔板中，加入20μL培养基并培养12小时。将不同浓度的稀释化合物或DMSO对照加入孔中，体积为10μL，终浓度为5nM至100μM，培养96小时。然后，在每个孔中加入25μLCellTiter-GLO试剂(Promega)并在定轨振荡器上混合10分钟以诱导细胞裂解。将裂解物再孵育10分钟并离心1分钟。根据制造商的说明，在GLOMAX微孔板光度计(Promega)上测量发光。每个浓度点一式三份进行。荧光信号针对DMSO处理的细胞进行归一化，并使用GraphPadPrism 7软件通过非线性回归和剂量反应抑制方程分析计算抑制曲线和IC50值。
细胞活性测试结果显示，除了7q和7u，其他化合物IC50均小于10μM，7q和7u小于35μM，故本发明所提供的通式(I)化合物具有很好的白血病肿瘤细胞抑制效果。部分代表性化合物的抑制曲线见图1，其中，化合物7r的IC50值为0.39μM，优于对照化合物(Journal ofMedicinal Chemistry,2018,61(7):3037-3058中的化合物6i，IC50值为0.69μM)。
实施例29癌基因抑制活性测试
将处于对数生长期的MV4-11细胞用不同浓度的化合物处理，培养48h。通过TRIzol试剂盒(Beyotime)提取总RNA。实验前用Nanodrop 2000(Thermo fisher公司)检测样本浓度。20μL系统用于cDNA合成，包括2μL RNA、4μL 5×iScript反应混合物(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)、1μL iScript逆转录酶(Bio-Rad)和13μL无核酸酶水。使用AppliedBiosystems96孔热循环仪仪器(Life Technology)进行逆转录，反应在25℃5分钟、42℃30分钟和85℃5分钟以获得cDNA。然后，在LightCycler 480Real-Time PCR System(Roche Applied Science)上进行qRT-PCR检测，反应体系为20μL，包括1μL cDNA、7.4μLNuclease-free水、10μL SsofastEvaGreenSupermix(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)、0.8μL正向引物、0.8μL反向引物。使用2-ΔΔCt方法对目标mRNA表达进行量化，并归一化为GAPDH表达。使用的qPCR引物(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)序列如下：
c-Myc_fwd：5'-CACTAACATCCCACGCTCTGA-3'(SEQ No.1)
c-Myc_rev：5’-AAATCATCGCAGGCGGAACA-3’(SEQ No.2)
GAPDH_fwd：5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'(SEQ No.3)
GAPDH_rev：5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'(SEQ No.4)
测试结果如图2所示。从图2可以看出，用不同浓度的化合物7r(1μM,5μM,10μM)处理白血病MV4-11细胞后，化合物7r可以有效抑制细胞中癌基因c-Myc的转录，且抑制效果随着化合物浓度的增加而增强。各给药组与空白对照组相比，具有显著性差异。该实验进一步阐明化合物的抗肿瘤机制与效果。
结论：本发明所提供的通式(I)化合物，特别是化合物7r，对白血病肿瘤细胞MV4-11中重要的癌基因c-Myc具有显著的抑制效果。
序列表
<110> 泰州职业技术学院
<120> 具有BRD4抑制活性的异噁唑磺酰胺类化合物及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cactaacatc ccacgctctg a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaatcatcgc aggcggaaca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatgggcagc cgttaggaaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgcccaata cgaccaaatc 20
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