一种吡啶喹唑啉中未知杂质的分离纯化与结构鉴定方法
阅读说明：本技术 一种吡啶喹唑啉中未知杂质的分离纯化与结构鉴定方法 (Separation and purification and structure identification method for unknown impurities in pyridine quinazoline ) 是由 吴宏霞 杨彬 刘鹏 王宇 于 2020-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种吡啶喹唑啉中未知杂质的分离纯化与结构鉴定方法,先将吡啶喹唑啉原药结晶母液经硅胶柱初步分离,采用制备级制备液相色谱梯度分离得到含量大于98%未知杂质,并通过LC-MS、～1H NMR等分析手段对其进行结构鉴定,确定了吡啶喹唑啉原药中该未知杂质的结构为1-(5-(全氟丙烷-2-基)苯并异噁唑-1(3H)-基)乙烷-1-酮并分析了其产生原因。该杂质为首次发现的新杂质,为吡啶喹唑啉的合成工艺研究提供了杂质对照品。(The invention discloses a method for separating, purifying and identifying the structure of unknown impurities in pyridine quinazoline, which comprises the steps of firstly, preliminarily separating the mother liquor of pyridine quinazoline original drug crystallization by a silica gel column, adopting preparative liquid chromatography gradient separation to obtain the unknown impurities with the content of more than 98%, and performing LC-MS, 1 The unknown impurity in the pyridine quinazoline original drug is determined to be 1- (5- (perfluoropropane-2-yl) benzisoxazol-1 (3H) -yl) ethane-1-ketone by analyzing means such as H NMR and the like to carry out structural identification, and the generation reason is analyzed. The impurity is a new impurity discovered for the first time, and provides an impurity reference substance for the research of the synthetic process of the pyridine quinazoline.)
技术领域
本发明涉及一种农药原药中未知杂质的分离提纯的方法，以及对该未知杂质进行结构鉴定。
背景技术
吡啶喹唑啉是一种新型喹唑啉类杀虫剂，该药剂对蝽科害虫有效，更对蚜虫类、粉虱类、粉蚧类、叶蝉类和蓟马类的效果卓越。分子式：C19H15F7N4O2，合成工艺路线如下：
由于其合成工艺比较复杂，因此不可避免地会产生一些副反应，这些副反应杂质又会直接影响原药的品质，为了更好地控制杂质的含量提高原药品质，就需要解析这些杂质结构并分析其产生原因，然而这些杂质的分离提纯以及结构鉴定方面又存在一定难度，且目前这方面的研究报道比较少。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离提纯吡啶喹唑啉原药中微量未知杂质的方法，利用硅胶柱初步分离，再用全自动制备液相色谱仪进行进一步梯度洗脱实现分离纯化，能够得到98%含量的该杂质。
本发明的另一个目的，采用多色谱解析鉴定了该未知杂质的化学结构。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
0.2%含量的未知杂质存在于吡啶喹唑啉原药中，该未知杂质首先通过重结晶吡啶喹唑啉原药得到结晶母液，经硅胶柱初步分离，分离浓缩后采用制备液相色谱仪实现分离，得到98%含量的该未知杂质。
其中母液提取步骤包括：称取20g吡啶喹唑啉原药，在加热搅拌条件下溶于乙腈直至饱和，冷却后抽滤进行固液分离，滤液减压浓缩至干。
采用硅胶柱初步分离包括：取一直径3.3cm的玻璃色谱柱，装柱高度约20cm，将重结晶母液的浓缩固体样加入10mL二氯甲烷溶解，再加入200目硅胶8g，减压浓缩至干，然后采用干法制样，上柱，石油醚-乙酸乙酯（20：1-0：1）冲柱，收集Rf为0.5的组分，减压浓缩至干后得到10%该未知杂质粗品2g。
制备液相色谱分离步骤包括：将上述含10%该未知杂质粗品加10mL乙腈溶解，配制成200mg/mL的溶液，用制备液相色谱进行分离，分10次进样，进样量1mL，柱温：40℃，流动相：以乙腈为流动相A，纯水为流动相B，进行梯度洗脱脱( 0～40min，10% A→50% A；40～60min，50% A→10% A) ；流速5mL/min，检测波长254nm的制备分离条件下收集19.5min的色谱峰馏分，减压浓缩至干，得到100mg98%的未知杂质。
对该未知杂质的化学结构鉴定采用以下方法：
首先采用高效液相色谱仪根据保留时间以及紫外吸收光谱确定该杂质是吡啶喹唑啉制备过程中的杂质，由其液相色谱图以及紫外吸收光谱图可以确认。
然后通过LC-MS确定该未知杂质的分子量：由LC-MS谱图得到准分子离子峰m/z:330[M-H]-，则该未知杂质分子量为331，则分子中应含奇数个N原子，根据合成工艺推断其分子式为：C11H8F7NO2。
元素分析结果：实验值C43.46%,H2.41%,F40.06%,N4.33%,O9.74%,理论值C43.52%,H 2.43%,F40.15%,N4.23%,O9.66%
最后通过1H NMR分析确定其化学结构，1H NMR谱图结构分析如下：δ7.933（d，1H，H-3），δ7.589（d，1H，H-2），δ7.442（s，1H，H-1），δ4.638（s，2H，H-4），δ2.606（s，3H，H-5）。
分析产生原因：在酸性和钯碳催化剂存在下，少量吡啶喹唑啉中的二氢喹啉酮环发生分子内亲核取代反应，再经过分子内重排为二氢噁唑环，最终形成该杂质。
附图说明
图1是样品HPLC色谱图。
图2是样品紫外吸收光谱图。
图3是样品LC-MS离子流谱图。
图4是样品LC-MS谱图。
图5是样品1H NMR谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和相关附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：通过以下步骤分离提纯吡啶喹唑啉中未知杂质：称取20g吡啶喹唑啉原药（95%），在加热搅拌条件下将其溶于40mL乙腈直至饱和，冷却析晶后再抽滤进行固液分离，所得滤液为结晶母液，减压浓缩至干，得到含1%左右该未知杂质的固体样，再加入10mL二氯甲烷溶解，加入200目硅胶8g，减压浓缩至干，然后采用干法制样，上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯（20：1-0：1）冲柱，收集Rf为0.5的组分，减压浓缩至干后得到10%该未知杂质粗品2g，加10mL乙腈溶解，配制成200mg/mL的溶液，用制备液相色谱进行梯度洗脱实现完全分离，分20次进样。分别收集包含不同色谱峰的洗脱液，并用HPLC分析，确保所收集的色谱峰为该未知杂质，减压浓缩至干后，得到含量98%以上的未知杂质样品100mg。
实施例2：通过以下步骤分离提纯吡啶喹唑啉中该未知杂质：称取15g吡啶喹唑啉原药（90%）在加热搅拌条件下将其溶于30mL乙腈直至饱和，冷却析晶后再抽滤进行固液分离，所得滤液为结晶母液，减压浓缩至干，得到含2%左右该未知杂质的固体样，再加入10mL二氯甲烷溶解，加入200目硅胶8g，减压浓缩至干，然后采用干法制样，上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯（20：1-0：1）冲柱，收集Rf为0.5的组分，减压浓缩至干后得到18%该未知杂质粗品1.5g，加10mL乙腈溶解，配制成150mg/mL的溶液，用制备液相色谱进行再次分离，分10次进样。分别收集包含不同色谱峰的洗脱液，并用HPLC分析，确保所收集的色谱峰为该未知杂质，合并减压浓缩至干后，得到含量98%以上的未知杂质样品150mg。
实施例3：通过以下步骤对所得未知杂质进行结构解析：
分子量测定：称取未知杂质约 13.00 mg 置于 25 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，配制成未知杂质母液。移取未知杂质母液 0.6 mL 置于 10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成未知杂质溶液。LC-MS分析条件优选采用Agilent 1260/6120 LC-MS，色谱柱：Eclipse Plus C18，250 mm×4.6 mm，5 µm，流动相：乙腈 :水= 45 : 55，柱温：35℃，紫外检测波长：210 nm ，柱流量：1.0 mL/min ，进样体积：10 μL，运行时间：30.0 min，离子源：APCI，负离子检测模式，碎裂电压：70 Ev，雾化器压力：60 psi ，干燥气（N2）流量：5.0 mL/min ，蒸发器温度：350 ℃，干燥气温度：350 ℃ ，毛细管传输电压：3000 V ，质量扫描范围：50-1000 amu。由LC-MS谱图得到准分子离子峰m/z:330[M-H]-，则该未知杂质分子量为331，推断其含奇数个N原子，分子式为：C11H8F7NO2。
1H NMR分析：取该未知杂质纯品约 5 mg 置于核磁管中，加入 0.5 mL 氘代氯仿，充分溶解，配制成该未知杂质溶液，对该未知杂质溶液进行1H NMR分析，优选采用VarianINOVA-300型核磁共振仪，工作频率：300 MHz，扫描次数：8，纯度 99.99%的氘代氯仿（CDCl3）：Sigma-Aldrich。将1H NMR谱图进行解析如下：δ7.933（d，1H，H-3），δ7.589（d，1H，H-2），δ7.442（s，1H，H-1），δ4.638（s，2H，H-4），δ2.606（s，3H，H-5）。则可确定该未知杂质的化学结构式为：
。
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