基于双噻吩并苯衍生物的荧光探针及其在细胞脂滴成像中的应用
阅读说明：本技术 基于双噻吩并苯衍生物的荧光探针及其在细胞脂滴成像中的应用 (Fluorescent probe based on dithienobenzene derivative and application of fluorescent probe in cell lipid drop imaging ) 是由 卢革宇 王晨光 刘冠男 闫旭 贾晓腾 刘晓敏 高原 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：一种基于双噻吩并苯衍生物的荧光探针及其在细胞脂滴成像中的应用,属于生物成像技术领域,该荧光探针的结构式如下所示。本发明还公开了该荧光探针在特异性标记HeLa细胞中脂滴和可视化HeLa细胞中脂滴形态和分布方面的应用。实验证实本发明的荧光探针SO2-DSB是一种具有超高的脂滴染色选择性和光稳定性等优点的脂滴荧光探针,具有巨大的应用前景。(A fluorescent probe based on a dithienobenzene derivative and application thereof in cell lipid drop imaging belong to the technical field of biological imaging, and the structural formula of the fluorescent probe is shown as follows. The invention also discloses application of the fluorescent probe in specifically marking lipid droplets in HeLa cells and visualizing the morphology and distribution of the lipid droplets in the HeLa cells. Experiments prove that the fluorescent probe SO2-DSB is a lipid drop fluorescent probe with the advantages of ultrahigh lipid drop dyeing selectivity, light stability and the like, and has a huge application prospect.)
技术领域
本发明属于生物成像技术领域，具体涉及一种基于双噻吩并苯衍生物的荧光探针及其在特异性标记细胞中脂滴、可视化细胞中脂滴形态和分布方面的应用。
背景技术
脂滴是高度动态的细胞器和代谢脂质的存储中心，调节身体的能量平衡。脂滴几乎存在于所有生物体中，在不同的细胞类型中的直径差异很大。脂肪细胞的脂滴直径约为10～200μm，而棕色脂肪组织的脂滴直径仅为100nm～1μm，内质网释放的新生脂滴的直径甚至小于100nm。近年来的研究表明，脂滴不仅是简单的脂质静态存储，而且是复杂的、必要的、动态的多功能细胞器。因此，阐明脂滴与其他细胞器的空间分布和相互作用具有重要意义和挑战性。开发用于标记和跟踪脂滴的荧光探针是提高对脂滴生物学认识的必要条件。
为了可视化脂滴并阐明其多重功能，一般采用荧光成像技术。在这种情况下，超分辨率荧光成像技术的出现打破了传统共聚焦显微镜的分辨率限制，可以在纳米水平上观察脂滴。在各种超分辨率成像技术中，受激发射耗尽显微镜(STED)可能是最普遍的一种，因为它提供了更高的分辨率。近年来，荧光探针被认为是一种功能强大的分析传感和光学成像工具，各种各样的荧光探针被开发出来用于脂滴定位。因此，迫切地需要一种具有超高染色选择性的脂滴荧光探针，能够特异性地识别脂滴，实现高质量的脂滴成像。
发明内容
针对现有细胞脂滴成像荧光探针技术方面的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于双噻吩并苯衍生物的荧光探针及其在特异性标记细胞中脂滴、可视化细胞中脂滴形态和分布方面的应用。
本发明所述的一种基于双噻吩并苯衍生物的荧光探针，其特征在于：分子结构为给受体结构，其结构式如下所示：
本发明所述的一种基于双噻吩并苯衍生物的荧光探针，简称为SO2-DSB，制备反应式如下：
针对现有荧光探针的不足，本发明在开发新型荧光探针方面选择了基于双噻吩并苯衍生物的荧光探针分子。该荧光探针分子展现较高亮度的同时，保持了较大的斯托克斯位移。在荧光成像应用方面，大的斯托克斯位移一方面可以有效避免吸收和发射光谱的交叉重叠，另一方面长波发射可以有效降低细胞自荧光背景信号的影响。基于上述优点，荧光探针SO2-DSB能够作为脂滴探针实现高质量荧光成像(共聚焦成像和超分辨成像)。
本发明所述的荧光探针SO2-DSB在特异性标记细胞中脂滴、可视化细胞中脂滴形态和分布中的应用。
本发明所述细胞为HeLa细胞。
本发明制备的特异性标记细胞中脂滴的荧光探针SO2-DSB是具有高亮度、超高染色选择性和光稳定性的可用于共聚焦成像和STED超分辨成像的荧光探针。
实验结果证实，本发明所述的荧光探针SO2-DSB具有较高的亮度和超高的染色选择性，在相同的染色和成像条件下，SO2-DSB表现出了与Nile Red更高的亮度和更优异的染色选择性。通过MTT测试证实，SO2-DSB的细胞毒性很低。最重要的是，SO2-DSB具有超高的光稳定性，可用于脂滴的STED超分辨成像。因此，荧光探针SO2-DSB可作为特异性标记脂滴、可视化细胞中脂滴形态和分布的强有力的工具，有望引领脂滴STED超分辨成像荧光探针的发展浪潮，成为商业化的脂滴STED超分辨成像荧光探针。更重要的是它可以为脂滴细胞生物学的研究提供新的视野，促进脂滴细胞生物学的发展。
总之，本发明所述的探针SO2-DSB是一种全新的荧光探针，该探针具有高的光稳定性、荧光亮度和成像信噪比，超高的脂滴染色选择性。这些特性使荧光探针可以理想地应用于STED超分辨率成像。除了STED成像，这种荧光探针的优越用途也被证明在双色三维共焦成像和四色共焦成像。鉴于上述特点，其在细胞脂滴荧光成像方面的应用具有广阔前景。
附图说明
图1：本发明实施例1中制备的荧光探针SO2-DSB在甲苯(toluene)中的吸收-发射光谱；
其中，左侧虚线部分为吸收光谱，右侧实线部分为发射光谱。
图2：本发明实施例4中用不同浓度的荧光探针SO2-DSB染色HeLa细胞24小时后细胞的存活率柱形图；
图3：本发明实施例5荧光探针SO2-DSB与脂滴荧光探针Ph-Red标记的HeLa细胞中共定位图像：每个荧光通道的图像以及合并两个荧光通道和明场通道的图像
图4：本发明实施例6荧光探针SO2-DSB和脂滴荧光探针Nile Red在HeLa细胞中光稳定性的量化图；
其中，图a和b部分分别是荧光探针SO2-DSB和Nile Red在染色HeLa细胞后在同一区域连续成像50张照片中的第1、10、30和50张照片；图c部分分别是这100张照片的相对荧光强度随成像张数的变化趋势曲线。标尺：10μm。该图说明探针SO2-DSB具有良好的光稳定性。
图5：本发明实施例7荧光探针SO2-DSB的多色成像图；
其中，右侧图为左侧图正方形标记区域的放大图。
图6：本发明实施例8荧光探针SO2-DSB的三维成像图。
具体实施方式
实施例1：
1、化合物3的合成
将市售的化合物1(苯并[1,2-B:4,5-B']二噻吩-4,8-二酮(4.40g,20.0mmol))，经还原、碱化、溴化三步反应，得到了化合物3。与文献报道的方法相同(B.McDearmon,E.Lim,I.-H.Lee,L.M.Kozycz,K.O’Hara,P.I.Robledo,N.R.Venkatesan,M.L.Chabinyc,C.J.Hawker,Macromolecules 2018,51,2580-2590)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.43(s,2H),4.16(t,J＝6.1Hz,3H),1.93–1.81(m,4H),1.11(t,J＝7.4Hz,6H).
2、化合物4的合成
在化合物3(0.200g,0.379mmol)、苯基硼酸(0.184g,1.51mmol)、Pd(PPh3)4(0.058g,0.050mmol)和碳酸钾(553mg,4.00mmol)的混合物中加入脱气后的50mL甲苯、乙醇和水混合物(体积比＝8:1:1)，然后将反应混合物加热回流12h。冷却至室温后，将混合物过滤除去无机盐。将滤液倒入水中，用CH2Cl2萃取三次。有机层用饱和食盐水洗涤，然后用无水MgSO4干燥，并过滤。滤液经减压浓缩后，化合物4无需进一步提纯即可用于下一步。
3、SO2-DSB的合成
向步骤2得到的化合物4溶解在CH2Cl2(20mL)溶液中，在30min内缓慢加入m-CPBA(2.62g,85％,12.9mmol)，然后将混合物加热回流48h。用10mL NaHCO3饱和水溶液淬灭反应后，有机层用NaHCO3水溶液洗涤，然后用无水MgSO4干燥，过滤。滤液经减压浓缩后，经硅胶柱层析纯化得到0.120g(0.230mmol,61％)黄色固体为本发明所述的荧光探针SO2-DSB。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.88–7.80(m,4H),7.55–7.47(m,6H),7.46(s,2H),4.48(t,J＝6.5Hz,4H),2.02–1.91(m,4H),1.15(t,J＝7.4Hz,6H).EI-MS:m/zcalcd.forC28H26O6S2:521.1([M-H]+)；found.522.4。
实施例2：实施例1中制备的荧光探针SO2-DSB吸收-发射光谱的测定
用10mL甲苯(toluene)溶剂将实施例1中合成的荧光探针SO2-DSB配成10μM浓度的溶液。在300～700nm波长范围内用紫外可见分光光度计扫描得到吸收光谱，用光纤式荧光光谱仪在470nm激发下收集得到荧光发射光谱，用Origin软件处理数据得到如图1所示的荧光探针SO2-DSB在甲苯溶液中的吸收-发射光谱(左侧虚线部分为吸收光谱，右侧实线部分为发射光谱)，说明了荧光探针SO2-DSB的吸收-发射峰位和它大的斯托克斯位移。
实施例3：HeLa细胞的培养
本实施例中所有百分数均为体积分数。
HeLa细胞株是在37℃、CO2浓度为5％的培养箱中进行培养，培养液为含有10％胎牛血清和1％双抗(青链霉素混合液)的高糖DMEM。其中，胎牛血清、双抗和高糖DMEM是直接从生物试剂公司购买得到的。
待细胞生长到对数期，我们对细胞进行传代处理：将细胞培养瓶中原有的5mL培养液吸走后用2mL不含胎牛血清的DMEM培养液清洗细胞表面，将该培养液吸走后再用0.5mL胰酶消化处理细胞2分钟，待大部分细胞脱壁后，加入2mL含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养液吹打均匀，取适量该细胞分散液分别转移至新的细胞培养瓶和培养皿中，放入CO2细胞培养箱中培养，培养皿中的细胞待浓度适宜后用于共聚焦或超分辨成像实验。
实施例4：实施例1中制备的荧光探针SO2-DSB细胞毒性的测试
我们使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)对荧光探针SO2-DSB进行细胞毒性测试。在96孔板上接种HeLa细胞(每个孔1*104个细胞)，放入CO2细胞培养箱中培养24小时。之后将中间的60个孔的培养液换成含有不同浓度(0、0.5、1.0、2.0、5.0和10.0μM)荧光探针SO2-DSB和1％(体积分数)DMSO的培养液(每个浓度设置10组平行试验)，再培养24小时后，向这些孔中加入MTT试剂(每孔10μL)，放回细胞培养箱中继续培养4小时。将这些孔中原有培养液移除后加入DMSO(每孔100μL)溶解生成的甲瓒结晶，室温放置30分钟后用酶标仪在490nm处测量各个孔的吸光度值。因为只有活细胞才能与MTT试剂作用生成甲瓒结晶，所以我们可以用各组浓度不同孔的平均吸光度值与对照组(探针浓度为0的10个孔)的平均吸光度值作比，计算细胞存活率，结果如图2所示，说明荧光探针SO2-DSB细胞毒性很小，10.0μM浓度的荧光探针SO2-DSB在24小时内也不会影响HeLa细胞的正常生长。
实施例5：实施例1中制备的荧光探针SO2-DSB与脂滴荧光探针Ph-Red在HeLa细胞中共染色实验
我们将HeLa细胞培养于20mm直径玻璃底的培养皿中，在CO2培养箱中繁殖2天。从培养箱中拿出后，移除培养皿中原有DMEM培养液，加入1mL含有SO2-DSB(2μM)、Ph-Red(1μM)和1％(体积分数)DMSO的DMEM培养液，放入细胞培养箱继续培养2小时。取出之后，用HBSS溶液洗3遍，之后在HBSS溶液中进行荧光成像。如图3所示，我们可以清晰地观察到实施例1中制备的荧光探针SO2-DSB与脂滴荧光探针Ph-Red在HeLa细胞中能很好地实现共定位，说明了实施例1中制备的荧光探针SO2-DSB具有优异的细胞脂滴特异性。
实施例6：实施例1中制备的荧光探针SO2-DSB的光稳定性测试
我们将实施例5中铺满HeLa细胞的2个培养皿从细胞培养箱中取出后，移除原有DMEM培养液，分别加入含有2μM SO2-DSB和2μM Nile Red的DMEM培养液(含1％DMSO)，放回培养箱中继续培养2小时后，取出3个培养皿，分别用HBSS溶液洗3遍，之后进行荧光成像。我们在3个培养皿中分别选定3个区域，之后分别连续成像100张，发现Nile Red会很快被光漂，而实施例1中制备的荧光探针SO2-DSB在成像100张后相对荧光强度仍能保持在88％，说明了其优异的光稳定性。
实施例7：实施例1中制备的荧光探针SO2-DSB的多色成像应用
我们将实施例5中铺满HeLa细胞的培养皿从培养箱取出后，移除原有DMEM培养液，加入含有2μM SO2-DSB的DMEM培养液中染色，培养箱中孵育2小时。用新鲜培养基洗涤后，在含50nM MitoTracker Deep Red和20μMHoechst 33342的DMEM培养液中染色，置于培养箱中20分钟。再次用新鲜培养基洗涤后，在含50nM LysoTracker Red的DMEM培养液中进一步染色，置于培养箱中20分钟，无需洗涤直接进行成像，如图5所示，表明该荧光探针作为多色共聚焦成像中脂滴特异性荧光探针的作用。
实施例8：实施例1中制备的荧光探针SO2-DSB的三维成像应用
我们将实施例5中铺满HeLa细胞的培养皿从培养箱取出后，用2μM SO2-DSB染色2h，4％多聚甲醛室温固定15min后。洗涤加入PBS溶液后进行荧光成像。利用徕卡LAS X软件进行三维图像的重建，如图6所示，可以清晰地看到脂滴的空间分布，表明该荧光探针的光稳定性和用途。