一种谷氨酸生物传感器的制备方法
阅读说明：本技术 一种谷氨酸生物传感器的制备方法 (Preparation method of glutamic acid biosensor ) 是由 谢颖 储震宇 金万勤 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明属于谷氨酸检测技术领域,涉及一种谷氨酸生物传感器的制备方法。使用金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方颗粒涂覆于电极材料上,所制备的谷氨酸生物传感器适用于食品工程、发酵领域以及临床医学中谷氨酸的检测。传感材料制备简单并可批量生产,以谷氨酸氧化酶作为生物识别元件,对谷氨酸检测线性范围宽,可实现对发酵液的实时监测。(The invention belongs to the technical field of glutamic acid detection, and relates to a preparation method of a glutamic acid biosensor. The prepared glutamic acid biosensor is suitable for glutamic acid detection in the fields of food engineering, fermentation and clinical medicine by coating the gold nanoparticles/silver cubic nanoparticles protected by sulfhydryl compounds on an electrode material. The sensing material is simple to prepare and can be produced in batch, glutamate oxidase is used as a biological identification element, the linear range of glutamic acid detection is wide, and the real-time monitoring of fermentation liquor can be realized.)
技术领域
本发明属于谷氨酸检测技术领域，涉及一种谷氨酸生物传感器的制备方法。
背景技术
谷氨酸是一种众所周知的提味剂，天然存在于一些食品中，虽然谷氨酸被普遍认为是安全的，但在食品中的使用仍然存在争议。同时，谷氨酸作为中枢神经系统的兴奋性神经递质，在记忆，突触可塑性，学习，运动功能和神经传递中起着至关重要的作用。另外，有人提出谷氨酸可以调节神经再生，肿瘤发展，突触形成，神经发生和细胞凋亡。长期高水平的细胞外谷氨酸具有兴奋性毒性并且容易引起神经元细胞死亡，谷氨酸水平的高水平波动与许多神经退行性疾病有关，例如帕金森氏病和阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化症和缺血性中风。因此，对于谷氨酸的实时监测具有十分重要的意义。
近些年来，纳米材料已成功用于医学，药学，化学、生物等领域。但是由于其容易发生自然聚集，精确控制纳米结构始终是一个挑战。电化学生物传感器由于操作便捷、成本较低、性能稳定、准确度高等优点而受到广泛关注。其核心在于传感电极，包括高性能电极材料的开发和传感芯片的制备。生物传感器的发展历程实际上伴随着电极材料的发展，从而不断实现更稳定、更短的电子转移路径。通过这种方式，实现酶促反应的电信号的显著放大，产生高的生物传感性能。在生物传感器的构造中，不均匀的分布和不规则的纳米结构将增加电子传递阻力，并降低酶负载的活性位，从而导致电导率和电催化作用的下降。因此，需要开发一种具有规则几何形态，并在电极上均匀分布的纳米材料才能更好的实现生物传感的应用。利用电化学方法检测谷氨酸主要是依靠电极材料在一定电压下催化氧化谷氨酸并产生电流，通过该电流反应测量谷氨酸的含量。带有巯基的有机物包裹的银纳米立方具有良好的稳定性，可以有效的与金纳米颗粒结合，使得材料的导电性得到显著提高，可以有效的实现谷氨酸的检测。
发明内容
本发明针对传统谷氨酸实时检测中存在的问题提出一种新型的谷氨酸生物传感器的制备方法及其应用。
为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：
本发明涉及一种简便的谷氨酸生物传感器的制备方法，使用金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方颗粒涂覆于电极材料上，所制备的谷氨酸生物传感器适用于食品工程、发酵领域以及临床医学中谷氨酸的检测。
一种谷氨酸生物传感器的制备方法，制备步骤如下：
（1）配制含聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液A，配制含氯化物的乙二醇溶液B, 制含硝酸银的乙二醇溶液C；将溶液A和溶液B混合均匀后，加入溶液C进行反应，反应后离心得到具有规则立方结构的银纳米粒子；
（2）将银纳米粒子加入分散液中，与巯基化合物溶液混合，得到溶液D，振荡反应后离心得到巯基化合物保护的银纳米立方；
（3）将巯基化合物保护的银纳米立方的溶液浸入到氯金酸溶液和酸溶液的混合溶液中反应，反应结束后离心、乙醇清洗、烘干得到金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方粉末；
（4）向金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方粉末中加入碳油墨混合均匀后，通过丝网印刷技术在支撑体上制备工作电极；
（5）配制含有戊二醛的谷氨酸氧化酶混合溶液，均匀涂于工作电极上，低温干燥得到用于谷氨酸检测的生物传感芯片。
作为优选，步骤（1）中，氯化物为NaCl、KCl、CuCl2中的任意一种；溶液A的浓度为0.001-0.5mM；溶液B的浓度为0.01-0.5mM；溶液C的浓度为0.001-0.01M；溶液A与溶液B的体积比为50:1-100:1；溶液A与溶液C的体积比为4:1-10:1；反应温度为150-170℃，反应时间为10-40min；离心转速为5000-10000rpm，离心时间为10-40min。
作为优选，步骤（2）中，巯基化合物为聚2-巯基苯胺、聚3-巯基苯胺，聚4-巯基苯胺， 1,4-苯二硫醇中的至少一种；分散液为乙醇，甲醇，二甲亚砜中的一种，银纳米粒子在分散液中的质量分数为0.01%-0.1%，巯基化合物溶液浓度为1-10 mM,溶剂为乙醇，甲醇，二甲亚砜中的一种,分散液与巯基化合物溶液体积比为1:1-1:3，振荡反应时间为1-5h，振荡反应温度为10-40℃。
作为优选，步骤（3）中酸溶液为柠檬酸、甲苯磺酸，硝酸中的一种，氯金酸与酸溶液的体积比为20:1-40:1；氯金酸溶液浓度为10-30 mM，酸溶液浓度为0.1-0.5 mM, 巯基化合物保护的银纳米立方的质量为0.001-0.01g，浸入反应时长为5-60 min，离心转速为3000-8000rpm，离心时间为5-50min，清洗所用乙醇体积为10-30ml，烘干温度为30-60℃，烘干时长为2-5h。
作为优选，步骤（4）中支撑体为PVC、PET、氧化铝中的至少一种，金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方粉末与碳油墨的质量比为1：10-1:50。
作为优选，步骤（5）中谷氨酸氧化酶溶液的浓度为0.05-1.5 U/μL，戊二醛在混合酶溶液中所占体积百分比为0.1％-10％，涂覆于工作电极上的混合酶溶液为0.5-10 µl，低温干燥温度为0-15℃，干燥时间为5-10h。
上述制备方法得到的生物传感器在谷氨酸检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明基于电化学传感技术，制备一种谷氨酸生物传感器，该传感材料制备简单并可批量生产，以谷氨酸氧化酶作为生物识别元件，对谷氨酸检测线性范围宽，可实现对发酵液的实时监测。
附图说明
图 1 为所制备银纳米立方的扫描电镜图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
实施例1
1）配制浓度为0.002 mM含聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液40ml，向其中加入浓度为0.01 mM含NaCl的乙二醇溶液0.4ml。配制浓度为0.002 M的AgNO3的乙二醇溶液10ml，少量多次加入上一步得到的混合溶液中，进行合成反应。反应温度控制在160℃，合成时间控制在40min，反应结束后离心，离心速度速率为5000 r/min，离心时间为10 min。将离心得到的银纳米立方（图1，银纳米立方微观显示其颗粒小大均匀）分散于10ml乙醇中（质量分数为0.01%），与1mM的1,4-苯二硫醇的乙醇溶液（30ml）混合振荡反应；反应温度控制在25℃，振荡时间控制在2 h，反应结束后进行离心，离心速度速率为5000 r/min，离心时间为40 min。得到巯基化合物保护的银纳米立方。
2）配制1 ml 25 mM HAuCl4溶液和25 µL 0.25 mM柠檬酸溶液，将0.01g巯基化合物保护的银纳米立方浸入到上述混合溶液中，室温下反应5min后，将上述混合液以8000r/min的速率离心5min，20ml乙醇清洗后，30℃烘干，烘干时间为5h，得到金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方。向金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方粉末中加入碳油墨混合均匀（质量比为1：10）后，将混合油墨通过丝网印刷技术在pvc上制备工作电极。
3）配制0.5U/μL的谷氨酸氧化酶溶液，加入体积比为1%的戊二醛，取5μL置于工作电极上，在0℃下干燥5h后得到谷氨酸生物传感芯片。
本实施例平行重复10次，所得到的谷氨酸生物传感芯片性能基本保持不变，说明本发明提出的方法所得到的谷氨酸生物传感芯片性能稳定，适合批量生产。
实施例2
本实施例未特殊说明之处，与实施例1保持一致，下同。
1）配制浓度为0.001 mM含聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液100ml，向其中加入浓度为0.05 mM含CuCl2的乙二醇溶液2ml。配制浓度为0.002 M的AgNO3的乙二醇溶液10ml，少量多次加入上一步得到的混合溶液中，进行合成反应。反应温度控制在160℃，合成时间控制在40min，反应结束后离心，离心速度速率为5000 r/min，离心时间为10 min。将得到的银纳米立方分散于10ml甲醇中（质量分数为0.1%），与10 mM的聚2-巯基苯胺的甲醇溶液（10ml）混合振荡反应；反应温度控制在10℃，振荡时间控制在5 h，反应结束后进行离心，离心速度速率为6000 r/min，离心时间为15 min。
2）配制1 ml 10 mM HAuCl4溶液和50 µL 0.1 mM柠檬酸溶液，将0.001g巯基化合物保护的银纳米立方的溶液浸入到上述混合溶液中，反应60min后，将上述混合液以8000r/min的速率离心50min，30ml乙醇清洗后，60℃烘干，烘干时间为2h，得到金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方。向金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方粉末中加入碳油墨混合均匀（质量比为1：50）后，将混合油墨通过丝网印刷技术在pvc上制备电极。
3）配置0.05U/μL的谷氨酸氧化酶溶液，加入体积比为0.2%的戊二醛，取10μL置于工作电极上，在5℃下干燥10h后得到谷氨酸生物传感芯片。
实施例3
1）配制浓度为0.5 mM含聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液40ml，向其中加入浓度为0.5 mM含KCl的乙二醇溶液0.6ml。配制浓度为0.01 M的AgNO3的乙二醇溶液8ml，少量多次加入上一步得到的混合溶液中，进行合成反应。反应温度控制在160℃，合成时间控制在40min，反应结束后离心，离心速度速率为5000 r/min，离心时间为10 min。将得到的银纳米立方分散于10ml二甲亚砜中（质量分数为0.01%），与5mM的聚3-巯基苯胺的二甲亚砜溶液（20ml）混合振荡反应；反应温度控制在40℃，振荡时间控制在3h，反应结束后进行离心，离心速度速率为10000 r/min，离心时间为20 min。
2）配制1 ml 30 mM HAuCl4溶液和30 µL 0.5 mM柠檬酸溶液，将0.005g巯基化合物保护的银纳米立方的溶液浸入到上述混合溶液中，反应40min后，将上述混合液以3000r/min的速率离心50min，10ml乙醇清洗后，50℃烘干，烘干时间为4h，得到金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方。向金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方粉末中加入碳油墨混合均匀（质量比为1：30）后，将混合油墨通过丝网印刷技术在氧化铝上制备电极。
4）配置1.5U/μL的谷氨酸氧化酶溶液，加入体积比为10%的戊二醛，取0.5μL置于工作电极上，在10℃下干燥8h后得到谷氨酸生物传感芯片。
实施例4
1）配制浓度为0.002 mM含聚乙烯吡咯烷酮的乙二醇溶液40ml，向其中加入浓度为0.01 mM含NaCl的乙二醇溶液0.4ml。配制浓度为0.005 M的AgNO3的乙二醇溶液10ml，少量多次加入上一步得到的混合溶液中，进行合成反应。反应温度控制在160℃，合成时间控制在40min，反应结束后离心，离心速度速率为5000 r/min，离心时间为10 min。将得到的银纳米立方分散于10ml乙醇中（质量分数为0.05%），与4mM的聚4-巯基苯胺的乙醇溶液（15ml）混合振荡反应；反应温度控制在25℃，振荡时间控制在1h，反应结束后进行离心，离心速度速率为8000 r/min，离心时间为10 min。
2）配制1 ml 25 mM HAuCl4溶液和30 µL 0.25 mM柠檬酸溶液，将0.008g巯基化合物保护的银纳米立方的溶液浸入到上述混合溶液中，反应20min后，将上述混合液以7000r/min的速率离心20min，10ml乙醇清洗后，40℃烘干，烘干时间为3h，得到金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方。向金纳米颗粒/巯基化合物保护的银纳米立方粉末中加入碳油墨混合均匀（质量比为1：20）后，将混合油墨通过丝网印刷技术在PET上制备电极。
4）配置1.0 U/μL的谷氨酸氧化酶溶液，加入体积比为5%的戊二醛，取1μL置于工作电极上，在15℃下干燥6h后得到谷氨酸生物传感芯片。
实施例1-4所制备的谷氨酸生物传感芯片应用到发酵液中检测谷氨酸浓度的具体使用方法如下：
基于以上的实例，把所制备的四种谷氨酸生物传感芯片，通过计时安培电流的方法来测试发酵液中检测谷氨酸浓度，检测灵敏度高达26.24μA mM -1 cm -2，检测线性范围为0.01-0.72mM, 与Sens. Actuators B Chem.，2020，306，127587相比，均有所提高。将芯片储存在冰箱中 4°C 、30天后，其稳态响应电流仍保持了初始灵敏度的73%以上，表明所制备的谷氨酸酶生物传感器芯片具有良好的稳定性。
具体检测结果如表1：
表1 实施例1-4所制备的生物传感芯片性能检测结果
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。