阅读说明：本技术 免疫调节性多核苷酸缀合物及其使用方法 (Immunomodulatory polynucleotide conjugates and methods of use thereof ) 是由 J·庞斯 H·I·万 C·W·布拉德肖 B·J·希姆 T·C-C·郭 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本文提供了用于调节天然杀伤细胞或骨髓细胞的缀合物,其包含靶向部分和免疫调节性多核苷酸。本文还提供了用于调节天然杀伤细胞或骨髓细胞的药物组合物,其包含含有靶向部分和免疫调节性多核苷酸的缀合物,以及药学可接受的赋形剂。本文另外提供了其用于调节天然杀伤细胞或骨髓细胞和治疗增生性疾病的方法。(Provided herein are conjugates for modulating natural killer cells or bone marrow cells comprising a targeting moiety and an immunomodulatory polynucleotide. Also provided herein are pharmaceutical compositions for modulating natural killer cells or bone marrow cells comprising a conjugate comprising a targeting moiety and an immunomodulatory polynucleotide, and a pharmaceutically acceptable excipient. Further provided herein are methods for their use in modulating natural killer cells or myeloid cells and treating proliferative diseases.)

具体实施方式

实施例1.核苷酸和多核苷酸的合成和纯化

免疫调节性多核苷酸及其前体的示例性合成描述如下。

前体

用于制备本发明多核苷酸的前体提供于WO 2015/188197(例如亚磷酰胺、靶向部分和含有PEG链的生物可逆性基团)。

亚磷酰胺和其他单体

可用于合成本发明多核苷酸的含核苷的中间体公开于WO 2015/188197(例如WO2015/188197中的化合物U1-U54、A1-A15、 C1-9和G1-G12)。

可商购亚磷酰胺购自Glen Research(Sterling,VA)或ChemGenes (Wilmington,MA)。需要时，可使用本文或他处所述的标准反应条件，从经适当保护的核苷制备其他亚磷酰胺。

化合物S61B

向S61(0.48g,2.0mmol)的DCM(5.0mL)溶液中添加S61A (0.60g，2.0mmol)和ETT(乙腈中0.25M，4.8mL，1.2mmol)。将混合物搅拌2小时。蒸发挥发物得到残余物，使用乙酸乙酯/己烷 (在Combi Flash Rf仪器上0-30％梯度)将其进行快速硅胶柱纯化以得到无色油状化合物S61B(0.49g,55％)。³¹P NMR(202MHz,CDCl₃； ppm):δ147.83(s)。

化合物S108

向2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙醇(S108A，25.0g，167mmol) 和N-甲基吗啉(21.0mL，191mmol)的二恶烷(100mL)的搅拌混合物中滴加Fmoc-OSu(62.2g，184mmol)的二恶烷(50mL)溶液。搅拌过夜后，将反应真空浓缩以得到浅黄色油。将粗产物再溶于 EtOAc中，并用饱和NaHCO₃(aq.)和盐水洗涤。真空去除有机层以得到油状物，将其通过SiO₂色谱法纯化以得到 FmocNH-PEG2-OH(S108,55g,88％产率).ESI+m/z计算值371.4, 实测值372.2[M+H]⁺。

X1和X2无碱基间隔基合成-通用方案：

化合物S110

在氩气下于0℃下向NaH(13.2g，矿物油中60％，230.0mmol) 在THF(40mL)中的悬浮液中滴加二醇(S109，4.92g，22.0mmol) 的THF(20mL)溶液；将得到的混合物温热至室温并搅拌1h。将反应混合物冷却至0℃，缓慢添加炔丙基溴(18.6g，158.4mmol)的 THF(25mL)溶液，并将所得混合物加热至室温并在40℃搅拌过夜。通过TLC观察，产物耗尽后，通过在0℃下滴加水淬灭反应，并将所得混合物用二氯甲烷(50mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，用无水Na₂SO₄,干燥、过滤并蒸发以得到残余物，将其使用ISCO 伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-30％)通过快速硅胶柱纯化以得到5.92g (89.5％)油状化合物S110。¹H NMR(500MHz,CDCl₃；ppm): δ7.49-7.47(dd,J8.0,1.5Hz,2H),7.38-7.34(m,3H),5.43(s,1H),4.21 (d,J2.5Hz,2H),4.12(t,J2.5Hz,4H),4.10(s,1H),3.91(s,1H),3.89 (s,1H),3.37(s,2H)；C₁₈H₂₀O₄的ESIMS计算值300.34,观察值 [M+H]⁺301.3。

化合物S111

将双炔丙基化合物S110(5.9g，19.64mmol)溶于乙酸/水混合物(60mL，75：25)中，并在50℃下继续反应2小时。反应完成后，将溶液蒸发并与甲苯(2x20mL)共蒸发。使用快速硅胶柱，使用ISCO 伴侣(己烷/乙酸乙酯，20-80％)将残余物直接纯化而无需任何处理以得到3.02g(72.5％)油状化合物S111。¹H NMR(500MHz,CDCl₃； ppm):δ4.15(d,J 2.5Hz，4H),3.68(s,4H),3.59(s,4H),2.44(t,J 2.5 Hz,2H),2.30-2.40(br,2H)；C₁₁H₁₆O₄的ESI MS计算值212.24,观察值[M+H]⁺213.2。

化合物S112

在0℃下向二醇S111(3.0g，14.2mmol)、N,N-二异丙基乙胺 (3.15mL，17.0mmol)和DMAP(0.36g，2.83mmol)的二氯甲烷 (25mL)溶液中滴加二甲氧基三苯甲基氯(4.8g，14.2mmol)的二氯甲烷(40mL)溶液，并且反应在室温下继续过夜。将混合物用二氯甲烷稀释，先后用水和盐水洗涤，有机层经无水Na₂SO₄干燥、过滤并蒸发。将所得残余物使用ISCO伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-40％) 通过快速硅胶柱纯化以得到5.29g(73％)的单DMT保护的白色固体状化合物S112。¹H NMR(500MHz,CDCl₃；ppm):δ7.4-7.42(m,2H), 7.32-7.31(m,4H),7.28-7.25(m,2H),6.84-6.81(m,4H),4.09(d,J2.5 Hz,4H),3.79(s,6H),3.67(d,J6.0Hz,2H),3.64-3.56(m,4H),3.13(s, 2H),2.39(t,J2.5Hz,2H)；C₃₂H₃₄O₆的ESI MS计算值514.6,观察值 [M+Na]⁺537.4。

化合物S113

室温下向DMT保护的化合物S112(0.5g，0.98mmol)的二氯甲烷(4mL)溶液中滴加2′-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(0.58 g,1.95mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液，然后在氩气气氛下添加5- 苄硫基-1H-四唑(BTT；乙腈中0.25M，0.78mL，0.18mmol)。继续反应直至起始原料消失(2h)，并将粗混合物用20mL二氯甲烷稀释，依次用饱和NaHCO₃溶液(10mL)和盐水(10mL)洗涤，并用无水Na₂SO₄干燥。真空蒸发溶剂，并使用具有3％三乙胺的乙酸乙酯/己烷作为共溶剂(在Combi Flash Rf仪器上0-30％梯度)将粗混合物通过硅胶柱色谱法纯化以得到0.53g油状化合物S113(75％)。ESI MS：C₄₁H₅₁N₂O₇P计算值714.82,观察值715.6[M+H]⁺；³¹P NMR (202MHz,CDCl₃):δ147.89。

化合物S114

在氩气气氛下向DMT保护的化合物S112(0.98g，1.9mmol) 和N,N-二异丙基乙胺(0.39mL，2.09mmol)在8.0mL无水二氯甲烷的-78℃溶液中滴加双-(N,N-二异丙基氨基)-氯膦(0.56g， 2.09mmol)的二氯甲烷(4.0mL)溶液。使反应混合物温热至室温，同时保持搅拌1h。在室温下添加3-丁炔-1-醇(0.14g，1.9mmol)的 2.0mL无水二氯甲烷溶液；将所得混合物搅拌10分钟，此时添加 0.25M ETT的乙腈溶液(4.6mL，1.15mmol)，并继续再搅拌3h。反应完成后，如通过TLC消失的起始原料所观察，将粗混合物用20mL 二氯甲烷稀释，并依次用饱和NaHCO₃溶液(10mL)和盐水(10mL) 洗涤，并用无水Na₂SO₄干燥。真空蒸发挥发物，并使用乙酸乙酯/ 己烷和3％三乙胺作为溶剂系统(在Combi Flash Rf仪器上0-40％梯度)将粗混合物通过硅胶柱色谱法纯化，以得到0.33g油状化合物 S114(25％)。ESI MS：C₄₂H₅₂NO₇P计算值713.83,观察值714.7 [M+H]⁺；³¹P NMR(202MHz,CDCl₃):δ146.89。

X3和X4无碱基间隔基合成-通用方案：

化合物S116

使用针对化合物S110所述的方案制备油状化合物S116，产率为 91％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃；ppm):δ7.51(d,J 7.5Hz,2H), 7.37-7.32(m,3H),5.56(s,1H),3.37-3.35(m,4H),4.10-4.07(dd,J 13.0 Hz,J 2.5Hz，2H),3.65-3.64(m,1H),2.43-2.42(t,J6.5Hz，1H)；ESI MS：C₁₃H₁₄O₃计算值218.24,观察值[M+H]⁺219.2。

化合物S117

使用针对化合物S111所述的方案制备油状化合物S117，产率为 91％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃；ppm):δ4.33(s,2H),3.83-3.70(m, 5H),2.48(s,1H),2.04(br,2H)；ESIMS：C₆H₁₀O₃计算值130.14,观察值[M+Na]⁺153.0。

化合物S118

使用针对化合物S112所述的方案制备白色固体状化合物S118，产率为54％。¹HNMR(500MHz,CDCl₃；ppm):δ7.43(d,J7.5Hz,2H), 7.37-7.27(m,5H),7.23-7.16(m,2H),6.83(d,J9.0Hz,3H),6.78-6.76 (ddJ 8.5Hz,1H),4.35-4.22(m,2H),3.77(s,6H)3.76-3.72(m,2H), 3.71-3.64(m,1H),3.27-3.19(m,2H),2.48(t,J4.5Hz，1H),2.03-1.96 (m,1H)；ESIMS：C₂₇H₂₈O₅计算值432.50,观察值[M+Na]⁺455.4。

化合物S119

使用针对化合物S113所述的方案制备油状化合物S119，产率为 86％。ESI MS：C₃₆H₄₅N₂O₆P计算值432.72,观察值433.5[M+H]⁺；³¹P NMR(202MHz,CDCl₃):δ149.05,148.96。

化合物S120

使用针对化合物S114所述的方案制备油状化合物S120，产率为 47％。ESI MS：C₃₇H₄₆NO₆P计算值431.73,观察值432.5[M+H]⁺；³¹P NMR(202MHz,CDCl₃):δ147.80,147.71。

X5和X6无碱基间隔基合成-通用方案：

化合物S121

向S116(4.0g，22.2mmol)的二恶烷(25mL)溶液中添加溶解在最少量水中的KOH(0.12g，2.2mmol)溶液，并将所得混合物在室温下搅拌至少30分钟。将混合物冷却至0℃，滴加丙烯腈(2.35g，44.4mmol)的二恶烷(15mL)溶液，并将所得混合物在室温下反应过夜。真空蒸发挥发物，将残余物用水稀释，并将pH调节至接近中性。粗产物用乙酸乙酯(2×50mL)萃取，并且将合并的有机层用盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥、过滤、蒸发以得到残余物，使用ISCO 伴侣(二氯甲烷/甲醇，0-5％)将其通过快速硅胶柱纯化以得到3.1g (60％)白色固体状化合物S121。¹H NMR(500MHz,CDCl₃；ppm): δ7.49(d,J 7.0Hz,2H),7.36-7.34(m,3H),5.56(s,1H),3.36(d,J 13.0 Hz 2H),4.10-4.07(dd,J 13.0Hz,J 2.0Hz,2H),3.84(t,J6.5Hz,2H), 3.42(m,1H),3.69(t,J 6.5Hz，2H)；ESIMS：C₁₃H₁₅NO₃计算值233.2, 观察值[M+Na]⁺256.3。

化合物S122

在0℃下向氢化铝锂(0.83g，4.0mmol)在THF(10mL)中的悬浮液中滴加化合物S121(1.28g，5.5mmol)的THF(15mL)溶液，将所得混合物温热至室温，并继续搅拌3h。反应完成后，将反应混合物冷却至0℃，并根据需要通过滴加水(约2-3mL)淬灭。添加额外的8mL水，并将粗产物萃取至乙酸乙酯(2×25mL)中。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na₂SO₄干燥、过滤并蒸发以得到化合物S122，其无需进一步纯化用于随后的步骤。¹H NMR(500MHz, CDCl₃；ppm):δ7.49(d,J 7.0Hz,2H),7.40-7.32(m,3H),5.55(d,J 5.0 Hz,1H),4.34(d,J 13.0Hz,1H),4.20-4.11(dd,J 12.0Hz4H), 4.05-4.03(d,J 13.0Hz,J 2.0Hz,1H),3.66-3.62(m,2H),3.27(m,1H), 2.86(t,J 6.5Hz,1H),2.16(br,2H)；ESI MS：C₁₃H₁₉NO₃计算值237.2, 观察值[M+H]⁺238.2。

化合物S123

在0℃下向化合物S122(1.0g，4.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺 (2.3mL，12.6mmol)的二氯甲烷(8mL)溶液中滴加Fmoc-OSu(1.7g， 5.0mmol)溶液，并将所得混合物在室温下反应3小时。完成后，将将反应混合物用二氯甲烷(10mL)稀释，并且用水和然后用盐水洗涤。将有机层分离，用无水Na₂SO₄干燥、过滤、蒸发以得到残余物。使用ISCO伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-50％)将残余物通过快速硅胶柱纯化以得到0.65g(35％)白色固体状化合物S123。¹H NMR(500MHz, CDCl₃；ppm):δ7.75(d,J 7.5Hz,2H),7.58(d,J 7.5Hz,2H),7.51(d,J 7.5Hz,2H),7.37(t,J 7.5Hz,2H),7.31-7.26(m,5H),5.57(s,1H),5.48 (br,1H),4.46-4.32(m,4H),4.15(d,J 7.0Hz,1H),4.06(t,J 12.5Hz 2H),3.67(m,2H),3.54(m,2H),3.41(s,1H),1.88(t,J 6.0Hz,2H)； ESIMS：C₂₈H₂₉NO₅计算值459.5,观察值[M+Na]⁺482.5。

化合物S124

使用针对化合物S111所述的方案制备油状化合物S124，具有定量产率。¹H NMR(500MHz,CDCl₃；ppm):δ7.76(d,J 7.5Hz,2H),7.58 (d,J 7.5Hz，2H),7.39(t,J 7.5Hz，2H),7.32(t,J 7.5Hz,2H),5.18(br， 1H),4.44(d,J 6.5Hz,2H),4.21(t,J 6.5Hz,1H),4.76-4.73(dd,J 11.5, 3.5Hz 2H),3.67-60(m,4H),3.42(m,1H),3.37(br,2H),2.07(m,2H), 1.75(br,2H)；ESI MS：C₂₁H₂₅NO₅计算值371.4,观察值[M+Na]⁺ 394.3。

化合物S125

使用针对化合物S112所述的方案制备白色固体状化合物S125，产物(S125)产率为48％。¹H NMR(500MHz,CDCl₃；ppm):δ7.75(t,J 7.5Hz,2H),7.58(t,J 7.5Hz,2H),7.40-7.38(m,3H),7.32-27(m,7H), 7.18-7.16(m,3H),6.83(t,J 7.0Hz,4H),5.16(br,1H),4.44(d,J6.5 Hz,2H),4.20(m,1H),3.80(s,3H),3.79(m,1H),3.76(s,3H),3.74(m, 2H),3.66-3.62(m,4H),3.43-3.37(m,2H),2.31(br,1H),1.76(br,2H)； C₄₂H₄₃NO₇的ESI MS计算值673.7,观察值[M+Na]⁺696.7。

化合物S126

使用针对化合物S113所述的方案制备油状化合物S126，产物 (S126)产率为78％。ESI MS：C₅₁H₆₀N₃O₈P计算值874.0,观察值896.9 [M+Na]⁺,913.0[M+K]⁺；³¹P NMR(202MHz,CDCl₃；ppm):δ148.90, 148.76。

无碱基间隔基S131的合成-通用方案：

化合物S127

在氩气下向S109(2.56g，11.4mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入溴乙腈(3.01g，25.1mmol)、氧化银(I)(5.28g，22.8mmol) 和四丁基碘化铵(0.84g，2.28mmol)，并将得到的混合物搅拌过夜。将混合物通过过滤，并将滤液蒸发以得到黑色残余物，将其在ISCO伴侣上进行快速硅胶柱纯化(己烷/乙酸乙酯，15-90％)以得到1.34g(39％)粘性油状物所需化合物S127。ESI MS：C₁₆H₁₈N₂O₄计算值302.3,观察值[M+H]⁺303.3。

化合物S128

在氩气下向化合物S127(1.34g，4.43mmol)的THF(30mL) 溶液中添加LiAlH₄的THF(2M，8.9mL，17.7mmol)溶液，并将混合物加热至55℃4小时。添加另一份LiAlH₄的THF溶液(2M， 4mL，8.0mmol)，并继续搅拌4小时。反应完成后，将混合物冷却至室温，并用Na₂SO₄.10H₂O淬灭。将固体滤出并用乙酸乙酯洗涤。将滤液经无水Na₂SO₄干燥。将混合物过滤并蒸发以得到残余物，将其溶于二氯甲烷(20mL)。向该溶液添加Fmoc-OSu(1.5g，4.43mmol)和DIEA(0.87mL，5.0mmol)。将混合物搅拌1小时，然后蒸发以得到残余物，将其在ISCO伴侣上进行快速硅胶柱纯化(己烷/乙酸乙酯，20-90％)，得到1.04g(31％)白色泡沫状化合物S128。¹H NMR (500MHz,CDCl₃；ppm):δ7.75(4H，dd,J 7.5,4.5Hz)，7.58(4H,t,J 7.0 Hz),7.48(2H,d,J7.0Hz),7.41-7.34(7H,m),7.32-7.26(4H,m),5.44 (1H,s),5.15-5.05(2H,m),4.44(2H,d,J5.5Hz),4.38(2H,d,J6.0Hz), 4.25-4.15(2H,m),4.10(2H,d,J11.5Hz),3.82(2H,d,J 11.5Hz),3.78 (2H,s),3.53(2H,s),3.42(2H,s),3.36-3.27(4H，m),3.25(2H,s)；ESI MS：C₄₆H₄₆N₂O₈计算值754.9,观察值[M+H]⁺755.3。

化合物S129

将化合物S128(1.1g，1.51mmol)溶于AcOH/H₂O混合物(10mL, 3:1)，并在55℃下继续反应5小时。反应完成后，将挥发物蒸发并与甲苯(2x20mL)共蒸发，并将残余物在ISCO伴侣(己烷/乙酸乙酯， 30-100％)上进行快速硅胶柱纯化以得到0.54g(54％)白色泡沫状化合物S129。¹H NMR(500MHz,CDCl₃；ppm):δ7.75(4H,d,J 7.5Hz), 7.58(4H,d,J 7.5Hz),7.39(4H,t,J 7.5Hz),7.30(4H,t,J 7.5Hz), 5.20-5.05(2H,m),4.41(4H,d，J 6.5Hz),4.21(4H,t,J 6.5Hz),3.64 (4H,s),3.48(8H,s),3.36(4H,s)；ESI MS：C₃₉H₄₂N₂O₈计算值666.7,观察值[M+H]⁺667.3。

化合物S130

在0℃下向二醇S129(0.73g，1.1mmol)、DIPEA(0.19mL， 1.1mmol)和DMAP(0.013g，0.11mmol)的二氯甲烷(6mL)溶液中滴加DMTrCl(0.34g，0.99mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液。将所得混合物温热至室温并搅拌过夜。蒸发混合物以得到残余物，将其在ISCO(己烷/乙酸乙酯，20-100％)上进行快速硅胶柱纯化以得到0.47g(44％)白色泡沫状单二甲氧基三苯甲基保护的化合物S130。¹H NMR(500MHz，CDCl₃；ppm):δ7.75(4H,d,J 7.5Hz),7.58(4H,d,J7.5Hz),7.39(4H,t,J 7.5Hz),7.32-7.25(8H,m),7.17(4H,d,J 6.5Hz), 6.83(4H,d,J6.5Hz),5.20-5.05(2H,m),4.41(4H,d,J 6.5Hz),4.21 (4H,t,J 6.5Hz),3.82(6H,s),3.64(4H,s),3.48(8H,s),3.36(4H,s)； ESI MS：C₆₀H₆₀N₂O₁₀计算值969.1,观察值[M+Na]⁺991.3。

化合物S131

在-78℃下3-Fmoc-氨基-丙烷-1-醇(0.090g,0.30mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.18mL，1.05mmol)的无水CH₂Cl₂(3.0mL)溶液中滴加双-(N,N-二异丙基氨基)-氯膦(0.085g，0.32mmol)的无水CH₂Cl₂ (1.0mL)溶液。将反应混合物温热至室温并搅拌1.5小时。添加化合物S130(0.30g，0.30mmol)的1.0mL无水CH₂Cl₂溶液，并将所得混合物搅拌10分钟。向反应混合物添加ETT(0.72mL，乙腈中0.25M， 0.18mmol)溶液，并将所得混合物搅拌3h。将混合物用CH₂Cl₂(20mL) 稀释，并用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和盐水(20mL)洗涤。将有机层经无水硫酸钠干燥，并将滤液真空蒸发以得到残余物，使用乙酸乙酯/己烷和3％三乙胺作为共溶剂(0-30％梯度)将其在ISCO 伴侣上进行快速硅胶柱纯化以得到0.12g白色泡沫状产物S131 (32％)。ESIMS：C₈₄H₉₁N₄O₁₃P计算值1395.6,观察值1395.7[M]⁺；³¹P NMR(202MHz,CDCl₃):δ146.41。

化合物dT4

FmocNH-PEG2-羟基-二异丙基氨基-dT(5′-DMT)亚磷酰胺(dT4) 的合成。在氩气下将5’-DMT-脱氧胸苷(4.30g，7.89mmol)和DIEA (1.51mL，8.68mmol)在CH₂Cl₂(40mL)中的搅拌悬浮液冷却至-78 ℃。滴加双(二异丙基氨基)氯膦(2.32g，8.68mmol)的CH₂Cl₂(10mL) 溶液。将混合物从冷却浴中移出并搅拌1h。向反应混合物中添加在 CH₂Cl₂(15mL)中的FmocNH-PGE2-OH(S108,2.93g,7.89mmol)，然后添加ETT(乙腈中0.25M，18.9mL)溶液。搅拌过夜后，将混合物真空浓缩，再溶解于EtOAc，并用饱和NaHCO₃(aq.)和盐水洗涤。真空除去有机层以得到白色泡沫。将该粗物质通过SiO₂色谱法纯化以提供标题亚磷酰胺(dT4，4.1g，50％产率)。

上述合成方案用于合成不同三酯的其他亚磷酰胺前体。

化合物dU6

在室温下在Ar(g)下在搅拌下向dU1(3.3g，5.0mmol)、1-甲基咪唑(1.2mL，15.0mmol)和碘(1.9g，15.0mmol)的THF(10 mL)溶液中滴加叔丁基二甲基甲硅烷基氯(0.8g，5.5mmol)的THF (5mL)溶液。将反应在室温下搅拌1小时。TLC证实反应完成。真空除去溶剂，将粗品溶于乙酸乙酯中并用浓缩NaHCO₃水溶液洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥、过滤并蒸发液体。使用ISCO伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-50％)将粗品通过快速硅胶柱纯化，以定量产率提供固体状dU2。NMR与已公布的一致。Nucleic Acids Research,2011, Vol.39，No.9,3962-3971。

将溶解在具有三异丙基硅烷(1.0mL，5.0mmol)的80％乙酸水溶液(40mL)中的dU2(3.9g，5.0mmol)溶液在室温下搅拌1小时。TLC证实反应完成。真空除去溶剂。使用ISCO伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-60％)将粗品通过快速硅胶柱纯化以得到1g(43％)固体状所需化合物dU3。ESI MS：C₁₅H₂₅IN₂O₅Si计算值468.4,观察值 [M+Na]⁺491.0。

在Ar(g)下向在冰水浴中冷却至0℃的dU3(1.0g，2.2mmol) 的THF(20mL)溶液添加氢化钠(60％分散体，0.2g，4.7mmol)。将反应在0℃下搅拌30分钟。滴加碘甲烷(0.7mL，10.8mmol)，并将反应在0℃下搅拌3小时。RP-HPLC/MS证实反应完成。在0℃下用20mL甲醇淬灭反应并温热至室温。添加饱和NaHCO₃水溶液，并将混合物用CH₂Cl₂萃取。将有机相经Na₂SO₄干燥、过滤并将液体真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(己烷/乙酸乙酯，0-50％)纯化以得到固体dU4(0.6g，58％产率)。ESI MS：C₁₆H₂₇IN₂O₅Si计算值482.4, 观察值[M+H]⁺483.1。

在搅拌下在Ar(g)下向冷却的dU4(0.6g，1.3mmol)的THF(20 mL)溶液中滴加叔丁基氟化铵(1M THF，3mL，3.0mmol)。将冷却的溶液搅拌30分钟，然后温热至室温。3.5小时后，RP-HPLC/MS 证实反应完成。将粗产物通过硅胶柱色谱法(二氯甲烷/甲醇，0-10％) 纯化以得到固体dU5(0.4g，92％产率)。ESIMS：C₁₀H₁₃IN₂O₅计算值368.1,观察值[M+H]⁺369.0。

在室温下在Ar(g)下在搅拌下向dU5(0.4g，1.2mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中滴加2′-氰基乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(0.4mL，1.3mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液。将反应在室温下搅拌30分钟。然后添加乙硫基四唑(ACN中的0.25M溶液，2.9mL， 0.7mmol)，并使反应继续过夜。TLC证实反应完成。真空除去溶剂，并将粗混合物用20mL二氯甲烷稀释，依次用饱和NaHCO₃溶液 (10mL)和盐水(10mL)洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥、过滤并蒸发液体。将粗制混合物溶于乙酸乙酯，并使用Isco伴侣(己烷/乙酸乙酯，0-100％)通过硅胶柱纯化以得到0.3g(49.9％)固体状所需化合物dU6。ESIMS：C₁₉H₃₀N₄O₆P计算值568.3,观察值567.3[M-H]^-；³¹P NMR(202MHz,CDCl₃,ppm):δ149.25。

化合物dU9

通过在以下所示的标准反应条件下使dU3反应来制备标题化合物。³¹P-NMR(202mHz,CDCl₃,ppm):δ149.42,149.31；MSESI-m/z 实测值667.1[M-H].MSESI+m/z实测值669.2[M+H],691.3 [M+Na]。

制备键合至辅助部分的接头：

化合物PP2、PP3和PP4

制备(5-叠氮戊酰基)-N-Boc赖氨酸(PP1)。将ε-N-Boc赖氨酸 (9.46g，38.4mmol)和K₂CO₃(2.67g,19.3mmol)溶于1:1 THF:H₂O (60mL)中。添加在THF(10mL)中的五氟苯基-5-叠氮戊酸酯(10.8g， 34.9mmol)，并将反应在室温下搅拌过夜。通过RP-HPLC-MS,394.2 [M+Na]观察所需产物。通过用1N HCl(水溶液)滴定将反应酸化至pH 5，并将产物用EtOAc(3×100mL)萃取。将有机层依次用H₂O(50 mL)和盐水(50mL)洗涤。将有机层经MgSO₄干燥，并真空浓缩成浓浆。将粗产物通过硅胶柱色谱法纯化以得到期望的白色针状物产物PP2(8.1g，62％产率)。ESI MS+质量计算值C₁₆H₂₉N₅O₅:371.4, 实测值:394.2[M+Na]⁺。

用于PP1的聚乙二醇化的通用方案：制备(5-叠氮基戊酰基)- ε-N-(NH-BocPEG24)赖氨酸(PP4)。用HCl(2mL，二恶烷中4N) 处理PP1(0.74g，2.0mmol)4小时。HPLC-MS显示完全脱保护， 272.2[M+H]⁺。用1:1 H₂O:乙腈(10mL)稀释反应，冷冻并冻干过夜，以定量产率得到白色固体状PP2。用HATU(0.34g，0.88mmol)、 HOBt(0.14g，0.88mmol)和DIEA(0.7mL，4.0mmol)将DMF (3mL)中的NHBoc-PEG24酸(1.1g，0.88mmol)活化，然后用 PP2(0.24g，0.8mmol)处理2小时。RP-HPLCMS显示形成所需的 PP4。将粗产物通过RP-HPLC纯化以得到白色固体状PP4(0.55g， 46％产率)。ESI MS+质量计算值C₆₇H₁₃₀N₆O₃₀:1499.77,实测值:1499.9[M+H]⁺,1400.8[M-Boc]⁺。

使用WO2015/188197所述的程序，由可商购的起始原料制备 BisPegX-NH2和TrisPegX-NH2(其中X＝各种PEG长度)。

PP2、PP3和PP4的聚乙二醇化的一般方案：用HATU(37mg， 0.1mmol)、N,N-二异丙基乙胺(49mL,0.3mmol)和mPEG48-NH₂ (200mg,0.09mmol)处理溶于DMF(1mL)中的赖氨酸PP1(38mg， 0.1mmol)。RP-HPLC-MS显示将PEG48完全添加到PP1中。将粗产物通过RP-HPLC纯化以得到白色固体状NHBoc PP7(97mg，42％产率)。ESI MS+质量计算值C₁₁₃H₂₂₄N₆O₅₂:2499.03,实测值:833.7 [M+3H]³⁺,625.6[M+4H]⁴⁺。将PP7用HCl(2mL，二恶烷中4N)脱保护4小时。HPLC-MS显示完全脱保护，如通过具有起始原料质量的峰的消失所观察。用1:1 H₂O:乙腈(10mL)稀释反应，冷冻，并冻干过夜，以定量得到白色固体PP8。ESI MS+质量计算值C₁₀₈H₂₁₆N₆O₅₀:2398.88,实测值:1199.8[M+2H]²⁺,800.3[M+3H]³⁺, 600.5[M+4H]⁴⁺,480.6[M+5H]⁵⁺。

在该方案中，条件是：

A)6-甲基四嗪-OSu、HATU、Hünig碱、DMF；和

B)DBCO-CpG、乙腈/H₂O；

其中6-甲基四嗪-OSu具有下式：

并且

DBCO-CpG具有下式：

制备加载有多核苷酸(PP28和PP30)的接头的一般方案。

PP12和PP16的四嗪缀合处理：将PP12(43mg，0.12mmol) 溶于DMF(0.5mL)中，用HATU(4.6mg，0.12mmol)、DIEA(12.7 μL，0.73mmol)和5分钟后用6-甲基-四嗪-OSu(19.9mg，0.61mmol) 处理。将粗反应在室温下搅拌30分钟，RP-HPLCMS显示6-甲基- 四嗪羧酸盐与PP12完全偶联。通过RP-HPLC纯化粗产物，并将合并的级分冻干以得到紫色固体状PP27(39mg，85％产率)。ESI MS+ 质量计算值：C₁₇₀H₃₂₅N₁₁O76:3739.47,实测值:833.7[M+3H]³⁺,625.6 [M+4H]⁴。将纯PP27在乙腈:水(1:1)中的DBCO-CpG中处理，并在37℃下孵育1-2小时，然后在室温下再孵育1小时以得到PP28。将PP28通过制备型AEX(20mM磷酸盐和20mM磷酸盐-1M溴化钠)纯化。

CpG加载的接头PP28和PP30的另一种一锅法路线。将PP12 (400nmol)用乙腈:水(1:1)中的DBCO-CpG(420nmol)处理，并在37℃下孵育1-2小时，然后在室温下再孵育1小时。将DMSO 储备溶液中的四嗪-OSu(4000nmol)添加到粗PP12-DBCO-CpG溶液中，并将紫色溶液在室温下反应3小时和1-2小时以得到PP28。将PP28粗品通过制备型RP-HPLC(水和10％乙腈:水中50mM TEAA)或制备型AEX(20mM磷酸盐和20mM磷酸盐-1M溴化钠) 纯化。

四嗪-PEG24-OPFP(PP32)的制备。在Ar(g)下在搅拌下向氨基 -PEG24-甲酸(1.0g，0.9mmol)和二异丙基乙胺(0.8mL，4.4mmol) 的DMF/水(1:1，12mL)溶液中滴加DMF(3mL)中的甲基四嗪苯基乙酰基琥珀酰亚胺酯(370mg,1.1mmol)。将反应在室温下搅拌2 小时。RP-HPLC/MS表明形成产物。真空除去溶剂，并将粗产物通过RP-HPLC(TFA改性剂)纯化以得到1.1g(80％)的PP31。 C₆₂H₁₁₁N₅O₂₇的ESI MS计算值1358.56,观察值[M+H]⁺1358.8。在 Ar(g)下向PP31(109mg，0.08mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液中添加无水吡啶(32mg，0.4mmol)和五氟苯基三氟乙酸酯(67mg， 0.24mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。真空除去溶剂。将粗产物重新溶于EtOAc中，并用NaHCO₃(5％w/v)(3x)水溶液和盐水(1x) 洗涤。将有机相经Na₂SO₄干燥、过滤、并真空浓缩以定量得到PP32。无需进一步纯化用于下一步。ESIMS：C₆₈H₁₁₀F₅N₅O₂₇计算值1524.61, 观察值[M+2H]²⁺763.0。

制备PP34。在Ar(g)下向mPEG48-胺(2.15g，1.00mmol)和二异丙基乙胺(0.87mL，5.00mmol)的DMF/水(1:1，10mL)溶液中滴加DMF(5mL)中的Cbz-Ne-Boc-L-赖氨酸琥珀酰亚胺酯 (570mg，1.2mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时。RP-HPLC/MS 表明形成产物PP33。将反应混合物真空浓缩并通过硅胶色谱法 (CH₂Cl₂:MeOH 0-10％)纯化。回收的PP33直接用于下一步反应。ESI MS：C₁₁₆H₂₂₃N₃O₅₃计算值2508.0,观察值[M+3H]³⁺836.7,[M+4H]⁴⁺ 627.9。用氮气(g)鼓气PP33(1.00mmol)的MeOH溶液，并添加活性炭上的钯(10％wt，催化的)。将溶液交替抽真空并用氢气(g) (3X)吹扫。2小时后，RP-HPLC/MS显示形成PP34。将不均匀混合物通过硅藻土床过滤，并用大量甲醇洗涤。真空除去溶剂，得到 PP34(2.0g，84％产率，经2步骤)。ESIMS：C₁₀₈H₂₁₇N₃O₅₁计算值2373.87,观察值[M+3H]³⁺792.0。

制备PP37。在Ar(g)下在搅拌下向PP32(124mg，0.08mmol) 和二异丙基乙胺(31mg，0.24mmol)的DMF/水(1:1，10mL)溶液中滴加DMF/水(1:1,10mL)中的PP34(230mg，0.1mmol)。将反应在室温搅拌2小时，并且RP-HPLC/MS表明形成产物PP35。真空除去溶剂，PP35无需进一步纯化用于下一步。ESI MS： C₁₇₀H₃₂₆N₈O₇₇计算值3714.4,观察值[M+4H]⁴⁺929.5,[M+5H]⁵⁺743.8。在Ar(g)下用HCl(二恶烷中4N，5mL)处理粗制PP35(0.08 mmol)。将反应在室温下搅拌2小时，并且RP-HPLC/MS表明完全去除Boc保护基。真空除去溶剂，并将胺用双-Peg3-PFP酯(230mg， 0.4mmol)的DMF(5mL)和二异丙基乙胺(140uL，0.8mmol)溶液酰化。2小时后，RP-HPLC/MS表明形成产物PP37。真空除去溶剂，并将粗产物通过RP-HPLC(TFA改性剂)纯化，以四TFA盐的形式提供PP37，31mg，产率8.7％。ESI MS：C₁₈₁H₃₃₃F₅N₈O₈₁计算值4012.56,观察值[M+3H]³⁺1338.3,[M+4H]⁴⁺1004.0,[M+5H]⁵⁺803.4, [M+6H]⁶⁺669。

包含辅助部分的接头列表：

在上表中，标识为Y或Z的基团具有以下结构：

在上表中，标识为“p313+N₃-戊酰胺”的基团Z是指p313与具有N₃-戊酰胺作为Z的接头之间的环加成反应的产物。

使用本文和WO 2015/188197描述的标准合成程序合成表1中所示的亚磷酰胺单体。

用于手性硫代磷酸酯寡核苷酸合成的双环氧杂氮杂膦酰基单体使用Wada,J.Am.Chem.Soc.130:16031-16037,2008报道的文献方案制备。

表1

手性无碱基间隔基–化合物X7、X8、X9和X10：

X7和X8合成：

X9和X10合成：

以下是可以使用本领域已知的方法和本文所述的方法制备的其他亲水性核苷亚磷酰胺：

其中R为OH、任选取代的氨基或–CO₂R¹(R¹为H或抗衡离子)，且n为1-4的整数；

其中R为OH、OAc、OMe、任选取代的氨基或CO₂R¹(R¹为H 或抗衡离子)，n为1-51的整数。

以下是可以使用本领域已知的方法和本文所述的方法制备的进一步取代的核苷亚磷酰胺：

其中R和R¹各自独立地为H或任选取代的C_1-6烷基(例如， Me、Et、i-Pr或n-Bu)。

以下亚磷酰胺购自Glen Research(Sterling，VA)或ChemGenes (Wilmington，MA)或使用本文所述的标准方案制备：

这些中间体可用于制备本发明的多核苷酸(例如，含有5′-末端修饰的核苷的多核苷酸)。5′-末端修饰的核苷的非限制性实例是5- 卤代尿苷、5-炔基尿苷、5-杂芳基尿苷和5-卤代胞苷。

5’-封端

a)5’-5’-封端

b)5′-磷酸或硫代磷酸酯封端：

基于小分子的靶向部分的合成

用于制备基于小分子的靶向部分的示例性化合物描述于WO 2015/188197(例如，WO 2015/188197中描述的化合物M1-M30)。

葡萄糖醇辅助部分的合成

用于制备基于葡萄糖醇的辅助部分的示例性化合物描述于WO 2015/188197(例如，WO 2015/188197中描述的化合物 POH1-POH10)。

通用多核苷酸合成：

一般方案

实验细节：

使用以下试剂和溶剂在MerMade 6或12上进行自动化的多核苷酸合成(1μmol规模)：

氧化剂–THF/吡啶/H₂O中的0.02MI₂(每循环60s氧化)，

硫化试剂II–二噻唑衍生物/吡啶/乙腈(0.05M，在6:4吡啶: 乙腈中)(每循环60s)

解封–3％三氯乙酸(每循环2x40s解封)，

封端混合物A–THF/2,6-二甲基吡啶/Ac₂O(每循环60s封端)，和

封端混合物B–THF中的16％甲基咪唑(每循环60s封端)

标准多核苷酸合成条件的例外如下：

-使用称为Uny-接头的具有非核苷接头的CPG支持物。

-合成之前，将所有2′-脱氧核糖-磷酰胺重悬于100mM的100％无水乙腈中，除了取决于原料的溶解度，将一些修饰的2′-脱氧-磷酰胺溶于100mM的THF/乙腈混合物(1:4)中。

-用2.5倍摩尔过量的5-苄硫基-1H-四唑(BTT)进行亚磷酰胺的活化。每次插入将活化的2′-脱氧核糖-磷酰胺偶联2x1分钟，并且每次插入将修饰的亚磷酰胺偶联2x3分钟。

-用0.05M吡啶/乙腈(6:4)中的硫化试剂II进行主链硫化1分钟。

多核苷酸脱保护和纯化方案：

在自动多核苷酸合成后，在室温下将固体支持物和碱保护基(例如A-Bz、C-Ac、G-iBu等)和脱保护磷酸三酯的甲酯在1mL AMA 中裂解和去保护(1:1比例的甲醇中的36％氨水和40％甲胺)2h或更长时间，然后离心蒸发。

将粗制的多核苷酸沉淀重悬于100μL的50％乙腈中，短暂加热至65℃并充分涡旋。

为了纯化多核苷酸，用以下缓冲液/梯度将100μL粗制多核苷酸注射到RP-HPLC上：

-缓冲液A＝水中的50mM TEAA；

-缓冲液B＝90％的乙腈；和

-流速＝1mL/min；

-梯度：

o 0-2分钟(100％缓冲液A/0％缓冲液B)，

o 2-42分钟(0％-60％缓冲液B)，和

o 42-55分钟(60％-100％缓冲液B)。

DBCO缀合和纯化方案：

如本文所述，将DBCONHS酯缀合至粗制的2’-脱氧DMT-多核苷酸。将粗制的多核苷酸沉淀悬浮于45μLDMSO中，短暂加热至65 ℃，并充分涡旋。添加5μL DIPEA，然后添加预先溶解在DMSO(1M) 中的DBCO-NHS酯(30eq)。使反应静置10分钟或直至通过MALDI 确认产物形成。用以下缓冲液/梯度将总共80μL的粗制多核苷酸样品注入RP-HPLC：

-缓冲液A＝水中的50mM TEAA

-缓冲液B＝90％的乙腈

-流速＝1mL/min；

-梯度：

o 0-2分钟(90％缓冲液A/10％缓冲液B)

o 2-42分钟(0％-60％缓冲液B)

o 42-55分钟(60％-100％缓冲液B)。

在主要的RP-HPLC峰上，收集0.5mL级分并通过MALDI-TOF 质谱分析以确认所需质量的存在。将质量选择的纯化级分冷冻并冻干。一旦干燥，将级分重悬、与相应的级分合并、冷冻并冻干。

DMT裂解：将冻干的沉淀悬浮于20μL的50％乙腈中，并添加 80μL的乙酸，将样品在室温下静置1h，冷冻并冻干。将干燥的样品重新溶于20％乙腈中，并通过NAP 10(Sephadex^TM-G25 DNA Grade) 柱脱盐。将收集的纯级分冷冻并冻干以得到最终产物。

使用无碱基间隔基的一般缀合方案：

链接反应–一般方案：

其中：

每个q为0或1；

每个m为0-5的整数；

Z为O或S；

R^O是多核苷酸中与核苷连接的键；

R是与H、多核苷酸中的核苷、固体支持物或封端基团(例如-(CH₂)₃-OH)连接的键；

每个R’独立地为H、–Q¹–Q^A1、生物可逆基团或非生物可逆基团；

每个R”独立地为H、–Q¹–Q^A–Q²–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；

每个R^A独立地为H或–OR^C，其中R^C为–Q¹–Q^A1、生物可逆基团，非生物可逆基团或与固体支持物连接的键；

每个R^B独立为H或–OR^D，其中R^D为–Q¹–Q^A–Q²–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；

其中：

每个Q¹独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与Q^A或Q^A1键合；第二化合价是开放的，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；

每个Q²独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与Q^A键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；

Q^A是1,2,3-三唑-1,4-二基、任选取代的C_6-16三唑杂亚环基(例如)、任选取代的C_8-16三唑亚环烯基(例如)或二氢哒嗪基团(例如反式-或反式 -)；

Q^A1是任选取代的C_2-12炔基、包含内环碳-碳三键任选取代的C₆-₁₆杂环基(例如)、任选取代的C_8-16环炔基(例如)或任选取代的C_4-8应变环烯基(例如，反式环辛烯基)；和

T是靶向部分

条件是起始原料至少包含一个–Q¹–Q^A1，并且产物包含–Q¹–Q^A–Q²–T；和

条件是起始原料和产物包含0或1个与固体支持物连接的键。

缀合方法

Cu-催化的链接反应

铜-THPTA络合物制备

将5mM的五水合硫酸铜水溶液(CuSO₄-5H₂O)和10mM的三(3- 羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA)水溶液以1:1(v/v)(1:2摩尔比) 混合并使其在室温下静置1小时。该络合物可用于催化Huisgen环加成反应，例如，如下文一般缀合方案所示。

一般方案(100nM规模)

向1.7mL Eppendorf管中的710μL水和100μL叔丁醇(最终体积的10％)的溶液中添加60μL铜-THPTA络合物，然后添加50μL 2mM的寡核苷酸、60μL 20mM抗坏血酸钠水溶液和20μL 10mM 靶向叠氮化物部分的溶液。充分混合后，使溶液在室温下静置1小时。通过凝胶分析确认反应完成。将反应混合物添加到包含5-10倍摩尔过量的TAAcONa(树脂结合的EDTA钠盐)的螺帽瓶中。将混合物搅拌1小时。然后将该混合物通过illustra^TMNap^TM-10 柱Sephadex^TM洗脱。然后将所得溶液冷冻并冻干过夜。

通过酰胺键缀合：

通过酰胺化的缀合可以在本领域已知的酰胺化反应条件下进行。例如参见Aaronson等人,Bioconjugate Chem.22:1723-1728,2011。

其中：

每个q为0或1；

每个m为0-5的整数；

Z为O或S；

R^O是多核苷酸中与核苷连接的键；

R是与H、多核苷酸中的核苷、固体支持物或封端基团(例如-(CH₂)₃-OH)连接的键；

每个R’独立地为H、–Q¹–Q^A1、生物可逆基团或非生物可逆基团；

每个R”独立地为H、–Q¹–Q^A–Q²–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；

每个R^A独立地为H或–OR^C，其中R^C为–Q¹–Q^A1、生物可逆基团或非生物可逆基团；

每个R^B独立为H或–OR^D，其中R^D为–Q¹–Q^A–Q²–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；

其中：

每个Q¹独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与Q^A或Q^A1键合；第二化合价是开放的，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；

每个Q²独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与Q^A键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；

Q^A是任选取代的包含–C(O)–N(H)–或–N(H)–C(O)–的C_2-12杂亚烷基；

Q^A1is–NHR^N1或–COOR¹²，其中R^N1为H、N-保护基或任选取代的C_1-6烷基，并且R¹²为H、任选取代的C_1-6烷基或O-保护基；和

T是靶向部分，

条件是起始材料包含至少一个–Q¹–Q^A1，并且产物包含–Q¹–Q^A–Q²–T。

溶液相缀合

其中：

m为0-5的整数；

Z为O或S；

R^O是多核苷酸中与核苷连接的键；

R是与H、多核苷酸中的核苷或封端基团连接的键；

每个R’独立地为H、–Q¹–NH₂、生物可逆基团或非生物可逆基团；

每个R”独立地为H、–Q¹–NH–CO–Q²–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；

每个R^A独立地为H或–OR^C，其中R^C为–Q¹–NH₂、生物可逆基团或非生物可逆基团；

每个R^B独立为H或–OR^D，其中R^D为–Q¹–NH–CO–Q²–T、生物可逆基团或非生物可逆基团；

其中：

每个Q¹独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与–NH–CO–或–NH₂键合；第二化合价是开放的，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；

每个Q²独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与–NH–CO–键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；

T是靶向部分，

条件是起始材料包含–Q¹–NH₂，并且产物包含–Q¹–NH–CO–Q²–T。

支持物上的缀合：

其中：

Z为O或S；

R^O是多核苷酸中与核苷连接的键；

每个Q²独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与–NH–CO–键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；和

T是靶向部分。

其中：

n是1-8的整数；

A是O或–CH₂–；

Z为O或S；

R^O是多核苷酸中与核苷连接的键；

每个Q²独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与叠氮化物或三唑键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；和

T是靶向部分。

其中：

n是1-8的整数；

A是O或–CH₂–；

Z为O或S；

R^O是多核苷酸中与核苷连接的键；

每个Q²独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与叠氮化物或三唑键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；和

T是靶向部分。

其中：

n是1-8的整数；

A是O或–CH₂–；

Z为O或S；

R^O是多核苷酸中与核苷连接的键；

每个Q²独立地为二价、三价、四价或五价基团，其中一个化合价与叠氮化物或三唑键合；第二化合价与T键合，并且当存在时，每个其余化合价独立地键合至辅助部分；和

每个T独立地是靶向部分。

磷酸三醋的Fmoc脱保护的代表性实例:

使包含具有Fmoc-保护的胺的磷酸三酯的多核苷酸经历脱保护条件，导致Fmoc脱保护，而没有观察到磷酸三酯向磷酸二酯的转化。

TCCATGACGTTCCTGACGTT(p68；参见表2；SEQ ID NO:68)

DBCO-NHS与p68缀合-代表性实例:

通过质谱分析证明，室温下DBCO-NHS与磷酸三酯中的氨基的缀合在10分钟内完成。

使用以下条件进行包含DBCO缀合基团的p68(参见表2)的 RP-HPLC纯化：

-缓冲液A＝水中的50mM TEAA；

-缓冲液B＝90％的乙腈；和

-流速＝1mL/min；

-梯度：

o 0-2分钟(100％缓冲液A/0％缓冲液B)，

o 2-22分钟(0％-100％缓冲液B)，和

o 22-25分钟(100％缓冲液B)。

可以使用类似的程序，使用例如2’-修饰的核苷亚磷酰胺，如本文所述的那些，来制备多核苷酸。这种程序提供于国际专利申请 PCT/US2015/034749。PCT/US2015/034749中的二硫化物磷酸三酯寡核苷酸合成的公开通过引用并入本文。

遵循本文所述的一般程序以制备表2中所列的免疫调节性多核苷酸。

在表2中，A栏提供DB-6细胞中IL-6表达(EC₅₀，nM)；B栏提供DB细胞中IL-10表达(EC₅₀， nM)；C栏提供Ramos蓝细胞中NFκB活化(EC₅₀，nM)；D栏提供Hela-hTLR9-NFκB-luc细胞的NFκB 活化(EC₅₀，nM)；E栏提供Hela-mTLR9-NFκB-luc细胞的NFκB活化(EC₅₀，nM)；F栏提供小鼠脾细胞中IL-6分泌(EC₅₀，nM)；G栏提供在95％小鼠血浆中预孵育24小时后小鼠脾细胞中IL-6分泌(EC₅₀， nM)；H栏提供小鼠骨髓分化的DC中IL-6分泌(EC₅₀，nM)；I栏提供用RNAiMax转染2h后小鼠 HEK-Blue细胞中的NFκB激活；J栏提供用RNAiMax转染2h后人HEK-Blue细胞中的NFκB激活(EC₅₀， nM)。

本文包括的所有表中提供的序列的关键描述符如下：小写＝核苷3′-硫代磷酸酯；大写＝核苷3′-磷酸酯；斜体小写＝具有3′tBuDS-Ph(邻位)三酯的核苷(PS)；斜体大写＝具有3′tBuDS-Ph(邻位)三酯的核苷(PO)；dt＝dT(DBCO)；粗体双下划线t＝DBCO-C6-dT；粗体小写＝具有3′正丁基三酯(PS) 的核苷；粗体大写＝具有3′正丁基三酯的核苷(PO)；斜体粗体小写＝具有3′均炔丙基三酯(hPro)的核苷(PS)；斜体下划线小写＝具有3′DBCO-NH-PEG2三酯(N1)的核苷(PS)；斜体下划线大写＝具有 3′DBCO-NH-PEG2三酯(N1)的核苷(PO)；双下划线t＝dT PEG2-NH₂三酯(PS)；双下划线T＝dT PEG2-NH₂三酯(PO)；斜体双下划线小写＝具有3’PEG2-NH₂三酯(N1)的核苷(PS)；斜体双下划线大写＝具有3’PEG2-NH₂三酯(N1)的核苷(PO)；粗体斜体下划线大写U＝5-碘-2′-脱氧尿苷(PO)；粗体斜体下划线小写u＝5-碘-2′-脱氧尿苷(PS)；粗体下划线＝2′-氟核苷酸(PO)；撇号表示由撇号左侧字母标识的核苷酸包含2′-OMe修饰的核糖；带下划线的ng＝7-脱氮-2′-脱氧鸟苷(PS)；带下划线的 pT＝PEG4dT三酯(PO)；带下划线的pt＝PEG4 dT三酯(PS)；fT＝5-三氟甲基胸苷(PO)；fU＝5- 氟-2′-脱氧尿苷(PO)；bU＝5-溴-2′-脱氧尿苷(PO)；ft＝5-三氟甲基胸苷(PS)；fu＝5-氟-2′-脱氧尿苷(PS)；bu＝5-溴-2′-脱氧尿苷(PS)；C3＝C3间隔基(-(CH₂)₃-OH)(PO)；c3＝C3间隔基(-(CH₂)₃-OH) (PS)；C6＝己烷-1，6-二基；NH₂C6＝6-氨基己-1-基；Te＝具有3′乙基三酯的胸苷(PO)；Ge＝具有3′乙基三酯的鸟苷(PO)；Ce＝具有3′乙基三酯的胞苷(PO)；Ue＝具有3′乙基三酯的5-碘尿苷(PO)； ue＝具有3′乙基三酯的5-碘尿苷(PS)；iu＝基于5-碘-2′-脱氧尿苷(PS)的5′-5′封端；iU＝基于5-碘-2′- 脱氧尿苷(PO)的5′-5′封端；X5＝X5-DBCO(PO)；x5＝x5-DBCO(PS)；X3＝X3无碱基间隔基(PO)；和 IR700是染料。在这里，描述符(PO)代表3′-磷酸；和(PS)代表3′-硫代磷酸酯；od＝5′-原二硫化物磷酸二酯；o＝5′-磷酸(PO)；ods＝5′-原二硫化硫代磷酸酯；s＝5′-硫代磷酸酯(PS)；上标“r”＝Rp PS；上标“s”＝Sp PS；Af＝2′-氟代腺苷(PO)；Csi＝dC O-甲硅烷基三酯(PO)；Tsi＝dT O-甲硅烷基三酯(PO)；tm＝2′-OMe胸苷(PS)；t(m)＝2′-OMOE胸苷(PS)。结构显示于图5和6中。

双链CpG:

退火和凝胶分析：

用DPBS(24.7mL)将多核苷酸p88(1mL，5mM储备液)添加到p144(3.3mL，2mM储备液)中。用p145以类似方式处理多核苷酸p88。将混合物加热至65℃10分钟。TBE尿素凝胶分析表明p88 完全退火(参见图2)。取出1μL的每个样品，添加到5μL的甲酰胺上样缓冲液中，并在200伏的电压下每孔上样到15％TBE-脲凝胶上40分钟，然后进行溴化乙锭(EtBr)染色。p88、p144和p145的结构参见表2。

使用p88/p144的双链CpG–代表性实施例(1)：

TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:234)

AGCAGCAAAACAGCAAAACAGCAA(SEQ ID NO:468)

使用p88/p145的双链CpG–代表性实施例(2)：

TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:467)

AGCAGCAAAACAGCAAAACAGCAA(SEQ ID NO:468)

实施例2：制备抗体-CpG缀合物

A.制备抗SIRPα抗体-CpG核苷酸缀合物

选择两种抗SIRPα抗体。一种抗SIRPα抗体阻断CD47的结合，其表位与CD47结合位点重叠(阻断)。另一种抗SIRPα抗体结合不同于CD47结合位点的表位(非阻断)。参见WO2018/057669，其公开通过引用整体并入本文。通过转谷氨酰胺酶(“mTGase”)反应缀合抗SIRPα抗体。

选择用于缀合的阻断抗体抗SIRPα1的VH和VL分别为 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSNAMSWVRQAPGKG LEWVAGISAGGSDTYYPASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETWNHLFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:521)和 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSS YYYAWYQQKPGQAPVT LIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGGGTKLTVL(SEQ ID NO:525)。

选择用于缀合的非阻断抗体抗SIRPα2的VH和VL分别为 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDVNWVRQAPGKG LEWVSLISGSGEIIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKENNRYRFFDDWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:548)和 ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVYTYLAWYQQKPGQAPR LLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYYDRPPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:553)。

使用脱盐柱将在人IgG1中携带N297A突变的抗SIRPα抗体缓冲液交换为25mMTris，150mM NaCl，pH 8。向SIRPα抗体溶液中添加mTGase和具有N₃-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₂₃-NH₂结构的 N₃-PEG23-NH₂接头。考虑到N297A突变，可以通过谷氨酰胺295 (EU编号)的侧链发生缀合。将所得混合物在室温下放置过夜。在 mTGase反应混合物中，最终抗体浓度为50μM；抗体与mTGase之比为约10，并且接头与抗体之比为约5。通过蛋白A纯化去除mTGase 和游离PEG接头。使用脱盐柱将修饰的抗体缓冲液交换为1xPBS。随后在修饰的抗体中具有叠氮基的SEQ ID NO：425的CpG核苷酸中炔烃的Hüisgen环加成反应，提供了具有式(D)或(E)结构的抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物：

其中Ab是阻断或非阻断抗SIRPα抗体；c是2’-脱氧胞苷；g是 2’-脱氧鸟苷；t是胸苷；X是5-溴-2′-脱氧尿苷；并且Z是

B.制备抗CD56抗体-CpG核苷酸缀合物

鼠单克隆抗CD56抗体(克隆5.1H11)可商购获得。抗CD56 抗体通过活化的五氟苯基(PFP)酯缀合。向抗CD56抗体的Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水(DPBS)缓冲液(～2.5μg/μL)溶液中添加具有 N₃-CH₂CH₂(OCH₂CH₂)₈-CH₂CO-PFP结构的叠氮基-PEG8-PFP酯，其中接头与抗体之比为20。将所得混合物在室温下放置过夜，以形成含叠氮基的抗体。然后通过使用DPBS作为洗脱液通过Amicon 30kD 旋转浓缩器交换缓冲液来去除过量的叠氮基-PEG8-PFP。随后在修饰的抗体中具有叠氮基的SEQ ID NO：425的CpG核苷酸中炔烃的 Hüisgen环加成反应，提供了具有式(F)或(G)结构的抗CD56-CpG 核苷酸缀合物：

其中Ab是抗CD56抗体；s是约3或约4的整数；c是2’-脱氧胞苷；g是2’-脱氧鸟苷；t是胸苷；X是5-溴-2’-脱氧尿苷；并且Z 是

实施例3:抗体-CpG核苷酸缀合物的生物学评估

从Blood Centers of the Pacific接收Trima残留物，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)以1:4稀释。将稀释的血液分成四管，并用15mLPaque密度梯度培养基(GEHealthcare Life Sciences)支撑。将试管以400×g离心30分钟。将PBMC从界面收集，并重悬于FACS 缓冲液(含0.5％牛血清白蛋白的PBS)中。根据生产商的方案，使用单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)和LS柱(Miltenyi Biotec) 通过阴性选择纯化CD14⁺单核细胞。

将PBMC或CD14⁺细胞立即铺板于完全Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI)中的96孔形式(500K/孔)中。在5％CO₂下向来自100nM-6.4pM的抗体和抗体-CpG核苷酸缀合物以及 1μM-64pM的SEQ ID NO：425的CpG多核苷酸的细胞中添加五倍系列稀释液24或48小时。通过以400xg离心五分钟沉淀细胞，并在4℃下在PBS中以1:2000稀释的100μLFixable Viability Dye eFluor 780(Thermo Fisher)中染色。将细胞离心，并在4℃下于100μL FACS缓冲液中染色30分钟，所述缓冲液包含2μLFcγR阻断试剂、 1.25μL抗CD14、抗CD3、抗CD19(用于抗SIRPα分析)和抗CD56、抗CD16、抗CD69、抗CD14、抗CD3和抗CD19(用于抗CD56分析)。将细胞离心，并在200μL FACS缓冲液中洗涤两次，并固定于100μL 0.5％多聚甲醛中。将CountBright绝对计数珠添加到每个孔中以计数细胞数量。在Attune NxT流式细胞仪上分析细胞，然后通过Flowjo 10.7进行数据分析。通过对eFluor 780阴性群体进行门控来排除死细胞。在门控CD14⁺细胞之前排除谱系特异性细胞 (CD19、CD3)，并且在门控CD56⁺CD16⁺细胞之前排除(CD19、 CD3、CD14)。

如图1和2所示，与分别在24小时和48小时时单独的CpG核苷酸和抗CD56相比，抗CD56-CpG核苷酸缀合物增强了NK细胞的活化。如通过CD69表达所确定，抗CD56-CpG核苷酸缀合物能够诱导NK细胞活化。

如图3和图4所示，抗SIRPα-CpG核苷酸与阻断抗体(抗SIRPα1) 或非阻断抗体(抗SIRPα2)的缀合物诱导整个PBMC和纯化的CD14⁺群体中CD14⁺单核细胞的增殖。使用计数珠来确定CD14⁺单核细胞的绝对数量，与单独的CpG核苷酸和抗SIRPα抗体相比，抗 SIRPα-CpG核苷酸与阻断抗体(anti-SIRPα1)或非阻断抗体 (anti-SIRPα2)的缀合物诱导了增殖。使用纯化的CD14⁺单核细胞的实验表明，细胞数量的增加是通过抗SIRP抗体将CpG核苷酸递送到细胞中的结果。这些数据共同表明，与不同表位结合的抗SIRPα抗体(阻断和非阻断)已显示将CpG核苷酸递送至CD14⁺单核细胞并导致其细胞数量扩增。

实施例4:测定K_D

根据以下方案，使用两种方法直接固定抗体(通过GLC芯片) 分析了抗SIRPα抗体与来自各种物种(人v1、人v2、食蟹猴、小鼠 129、BL6、BALBc、NOD)的SIPRα、SIRPβ和SIRPγ的相互作用。使用配备有GLC或NLC传感器芯片的基于SPR的ProteOn XPR36 生物传感器(BioRad，Inc.，Hercules，CA)在25℃下进行所有实验。使用FREESTYLE^TM 293-FS细胞(Thermo Fisher)表达抗体。通过标准蛋白A亲和柱色谱法进行纯化，并将洗脱的抗体储存在PBS缓冲液中。

运行缓冲液是具有0.01％TWEEN-20的PBS pH7.4(PBST+)。所有分析物均以通过A280吸光度测定的标称浓度并使用其摩尔计算的消光系数使用。如所述以“一次性”动力学模式注射分析物(例如参见Bravman等人,Anal.Biochem.2006,358,281-288)。

对于使用GLC芯片的方法，将分析物注入，并使用蛋白胺偶联试剂盒流过固定(～1000RUs)在GLC芯片上的抗SIRPα抗体。对于固定步骤，将GLC芯片用稀释为1/100的EDAC/Sulpho-NHS 1:1(Biorad) 以25μL/min活化300s。将抗SIRPα抗体在10mM乙酸钠缓冲液pH4.5中稀释至80nM浓度，并以30μL/min在芯片上固定50秒。用乙醇胺以25μL/min灭活芯片300秒。将分析物(例如，来自不同物种的SIRP-α、SIRP-β、SIRP-γ)以“一次性”动力学模式以标称浓度 100、33、11、3.7、1.2和0nM注射。以100uL/min监测缔合时间 90s，并监测离解时间1200s。用Pierce IgG洗脱缓冲液/4M NaCl的 2:1v/v共混物再生所述表面。

通过从反应点数据(固定的蛋白质)减去点间数据(不包含固定的蛋白质)，然后从分析物注射的响应减去缓冲液“空白”分析物注射的响应，来对生物传感器数据进行双参考。将双参考数据全局拟合到简单的Langmuir模型，并根据表观动力学速率常数的比率计算K_D值(K_D＝k_d/k_a)。

测定阻断剂119、135和非阻断剂136人抗体与来自不同物种的各种SIRP-α、SIRP-β、SIRP-γ的结合动力学。这些抗体以高亲和力结合来自人v1、人v2和食蟹猴的SIRP-α。它们不结合各种小鼠 SIRP-α。但是，它们与人SIRP-β和人SIRP-γ表现出高亲和力结合。因此，这些抗体对于缀合和递送CpG免疫调节性多核苷酸以调节各种骨髓细胞群的活性将是有用的泛抗SIRP。结果总结于表3中。

测定人源化的AB21阻断抗体与来自不同物种的各种SIRP-α、 SIRP-β、SIRP-γ的结合动力学。AB21抗体以高亲和力结合来自人v1、人v2、食蟹猴、各种小鼠SIRP-α(NOD、BL6和BALBc)、人SIRP-β和SIRP-γ。因此，AB21阻断抗体对于缀合和递送CpG免疫调节性多核苷酸以调节各种骨髓细胞群的活性将是有用的泛抗SIRP。结果总结于表4中。

实施例5:抗体-CpG核苷酸缀合物的体内评估

将CT26和MC38细胞分别以RPMI 1640(对于CT26)或DMEM (对于MC38)中2×10⁶个细胞/小鼠的浓度注射到BALB/c和C57BL/6雌性小鼠的右侧。监测肿瘤直至肿瘤的平均大小达到75-300 mm³(取决于研究)。将小鼠随机分为PBS对照组、具有阻断抗体的抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物(抗SIRPα1)组和具有非阻断抗体的抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物(抗SIRPα2)组，其中取决于研究每组 5-7只小鼠。抗SIRPα抗体的序列描述于实施例2；CpG对应于p313。抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物处理的小鼠给药0.1-10mg/kg，共两次，间隔三天。两种药物均腹膜内给药。用卡尺以两个维度测量肿瘤，并且肿瘤体积计算为：长×宽×宽×0.5，其中长度是两次测量值的较大者。

测量携带CT26肿瘤的小鼠，并通过肿瘤体积将其随机化。在第 4天，每组5只小鼠的平均肿瘤大小为75mm³。用10mg/kg抗SIRPα1 缀合物给药两次、间隔3天处理的小鼠显示肿瘤消除(4/5小鼠)，而与PBS相比，用10mg/kg非缀合的对照抗SIRPa抗体给药两次、间隔3天处理的小鼠显示次佳的肿瘤抑制(图7A)。测量携带CT26 肿瘤的小鼠，并通过肿瘤体积将其随机化。在第8天，每组7只小鼠的肿瘤的平均肿瘤大小为100mm³，用3mg/kg抗SIRPα1缀合物和抗SIRPα2缀合物间隔3天的两次处理显示完全肿瘤消除(图7B)。在第24天，用抗SIRPα1缀合物(抗SIRPα阻断抗体缀合物)处理的7只小鼠中的7只和用抗SIRPα2缀合物(抗SIRPα非阻断抗体缀合物)治疗的7只小鼠中的6只具有完整的肿瘤消除。如图7C所示，用0.1、0.3和1mg/kg抗SIRPα1缀合物处理平均肿瘤大小为300mm³的携带CT26肿瘤的小鼠(且每组5只小鼠)两次，间隔三天。观察到抑制肿瘤的剂量反应，其中最有效的是1mg/kg。在用1mg/kg抗SIRPα1缀合物处理的组中，在第21天，五只小鼠中的四只显示肿瘤消除。如图7D所示，间隔三天用两剂10mg/kg抗SIRPα1缀合物处理的平均155mm³肿瘤体积的携带MC38肿瘤的小鼠显示在第21 天完全消除肿瘤。总的来说，这些数据表明在多种肿瘤模型中的肿瘤消除，与未缀合SIRPa抗体相比SIRPa-CpG的比活性，使用SIRPa 阻断和非阻断抗体CpG缀合物消除肿瘤以及用低至1mg/kg的抗 SIRPα1缀合物处理小鼠时的肿瘤消除。

监测肿瘤直到肿瘤的平均大小达到300mm³。将小鼠随机分为 PBS对照和具有阻断抗体(抗SIRPα1)的抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物，其中每组5只小鼠。抗SIRPα抗体的序列描述于实施例2。CpG 对应于p313。对于CT26模型，用1mg/kg给药抗SIRPα-CpG核苷酸缀合物处理的小鼠共2次，间隔3或7天。腹膜内施用抗SIRPα-CpG 核苷酸缀合物。用卡尺以两个维度测量肿瘤，并且肿瘤体积计算为：长×宽×宽×0.5，其中长度是两次测量值的较大者。

测量携带CT26肿瘤的小鼠，并通过肿瘤体积将其随机化。在第 10天，肿瘤的平均肿瘤大小为300mm³，并且用两剂1mg/kg抗 SIRPα1缀合物间隔三天或七天处理显示出肿瘤消除(图8A)。在第 25天，两组中五只小鼠中的四只无肿瘤。在第63天，间隔三天处理的四只存活小鼠中，所有小鼠均无肿瘤，而间隔七天处理的小鼠也具有四只存活小鼠，但仅两只仍无肿瘤(图8B)。

提供以上阐述的实施例以使本领域技术人员获得如何制备和使用所要求保护的实施方案的完整公开和描述，并且不意欲限制本文公开的内容的范围。对于本领域技术人员显而易见的修改旨在落入所附权利要求的范围内。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，犹如每个这样的出版物、专利或专利申请都被具体地和单独地指出通过引用并入本文。