靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物及其制备方法与应用 (Polymer for activating immunity by targeting tumor peripheral cells and preparation method and application thereof ) 是由 帅心涛 林敏钊 蔡宇骏 陈耿佳 于 2021-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于纳米医学与生物医学工程技术领域,具体涉及一种靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物及其制备方法与应用。该聚合物由PD-L1抗体-基质金属蛋白酶蛋白2-聚乙二醇-聚乙烯亚胺和甘露糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺作为嵌段聚合物载体,复合上dsDNA制成,以PD-L1抗体靶向,提高纳米聚合物的聚集、增强抗体滞留的同时解除肿瘤周围免疫细胞的免疫阻断；协同激活肿瘤周围免疫细胞的STING通路改善肿瘤微环境募集T细胞,而不是直接作用于肿瘤细胞,通过“旁观者”效应实现杀伤周围肿瘤细胞的效果,应用前景广阔。(The invention belongs to the technical field of nano-medicine and biomedical engineering, and particularly relates to a polymer for activating immunity by targeting tumor peripheral cells, and a preparation method and application thereof. The polymer is prepared by compounding a PD-L1 antibody-matrix metalloproteinase protein 2-polyethylene glycol-polyethyleneimine and mannose-polyethylene glycol-polyethyleneimine as block polymer carriers with dsDNA, and is targeted by a PD-L1 antibody, so that the aggregation of a nano polymer is improved, the retention of the antibody is enhanced, and the immune block of immune cells around a tumor is relieved; the STING passage synergistically activating the immune cells around the tumor improves the tumor microenvironment to recruit T cells instead of directly acting on the tumor cells, realizes the effect of killing the surrounding tumor cells through the 'bystander' effect, and has wide application prospect.)
技术领域
本发明属于纳米医学与生物医学工程技术领域。更具体地，涉及一种靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物及其制备方法与应用。
背景技术
免疫检查点阻断(ICB)已经成为癌症免疫治疗中最具吸引力和最有效的手段之一。特别是程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)/程序性死亡配体-1(PD-L1)轴的阻断，可以重振耗尽的T细胞以抑制肿瘤生长。但是在实际的临床应用中，由于肿瘤发展出的多种免疫逃避机制，超过一半的患者无法从PD-1/PD-L1阻断中获益，治疗效果有限。
将免疫检查点阻断联合免疫调节剂等改善肿瘤微环境已经成为癌症治疗的研究热点。例如激活干扰素基因刺激物(STING)的先天免疫途径已成为癌症治疗的一种有效策略，其可以促进I型干扰素(IFN-I)的分泌以及多种促炎症因子与趋化因子的产生，并通过一系列级联反应，诱导适应性免疫系统的激活，最终促进效应T细胞的增殖与活化。瘤内(IT)注射STING激动剂已在小鼠模型中显示出疗效，并且已经开始了I期临床试验(ClinicalTrials.gov，NCT02675439和NCT03172936)。近五年来Aduro/诺华、默沙东、默克、葛兰素史克等公司先后研制出以STING为靶点的小分子激动剂，进入临床一期用于单一或联合治疗实体瘤与淋巴瘤，但是上述产品早期的临床数据令人失望，患者的响应率并不高。小分子药物在体内的代谢快、对肿瘤的选择性差成为制约STING激动剂在临床安全有效应用的主要障碍。
因此，将PD-L1抗体(aPD-L1)或STING激动剂高效递送至靶细胞的有效策略对于联合癌症治疗至关重要。为了解决上述问题，现有技术考虑将aPD-L1和STING激动剂负载于特定的载体上，如中国专利申请CN112601554A公开了一种肿瘤微环境活化的药物-结合剂缀合物，该缀合物可以由检查点蛋白和检查点拮抗剂PD-L1和免疫调节剂STING激动剂等制成，用于治疗肿瘤；但是在实际应用中发现，该缀合物很难将PD-L1和STING激动剂分别递送到合适的位置，存在递送困难、分布不均等问题；并且使用纳米载体进行肿瘤靶向药物递送时，机体中的实体肿瘤可能会对大分子和纳米级物体表现出增强的渗透和保留(EPR)效应，造成纳米药物的被动肿瘤积累通常远不如预期高，肿瘤治疗效果非常有限。因此，迫切需要提供一种可以克服肿瘤渗透和保留效应，靶向递送使药物充分发挥作用的聚合物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有小分子药物代谢快、肿瘤选择性差，肿瘤渗透和保留效应等逃避机制影响的缺陷和不足，提供一种可以靶向肿瘤周围细胞的聚合物。
本发明的目的是提供一种靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物。
本发明另一目的是提供所述靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物的制备方法。
本发明另一目的是提供所述靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物在制备治疗癌症药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物，所述聚合物由PD-L1抗体-基质金属蛋白酶蛋白2-聚乙二醇-聚乙烯亚胺和甘露糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺作为嵌段聚合物载体，复合上dsDNA制成纳米聚合物。
本发明靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物以聚合物表面的PD-L1抗体作为靶头，靶向肿瘤周围细胞后，肿瘤微环境中丰富的基质金属蛋白酶蛋白2(MMP-2)使聚合物的抗体断开，实现特异性阻断肿瘤的免疫耐受；同时，PD-L1抗体靶向肿瘤周围高表达PD-L1蛋白的免疫抑制型细胞，达到提高纳米聚合物聚集能力的效果。并且，裸露出的甘露糖基团作为聚合物外端，可以靶向免疫细胞(如树突细胞、巨噬细胞等)，促进免疫细胞摄取聚合物，被免疫细胞摄取的聚合物中，聚乙烯亚胺表面正电荷复合了可激活STING通路的dsDNA，激活体内免疫效应，促进T细胞浸润。总的来说，本发明聚合物采用PD-L1抗体靶向，提高纳米聚合物的聚集、增强抗体滞留的同时解除肿瘤周围免疫细胞的免疫阻断；协同激活肿瘤周围免疫细胞的STING通路改善肿瘤微环境募集T细胞，而不是直接作用于肿瘤细胞，通过“旁观者”效应实现杀伤周围肿瘤细胞的效果，应用前景广阔。
进一步地，所述dsDNA由两条DNA oligo复合形成双链，其中两条DNA oligo的序列分别为5'-TACAGATCTACTAGTGATCTATG-3'，5'-ACTGATCTGTA CATGATCTACA-3'。细胞通过上游cGAS通路识别细胞质中的双链DNA，将作为危险信号激活机体免疫，进而促进I型干扰素(IFN-I)的分泌以及多种促炎症因子与趋化因子的产生，并通过一系列级联反应，诱导适应性免疫系统的激活，最终促进效应T细胞的增殖与活化。
更进一步地，所述聚乙二醇的分子量为1000～2000Da。
进一步地，所述聚乙烯亚胺的分子量为600～1800Da。
更进一步地，所述聚合物的氮和dsDNA中磷的摩尔比为10～40。优选地，所述聚合物的氮和dsDNA中磷的摩尔比为20～40。
另外的，本发明还提供了所述靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、甘露糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺的制备：通过胺反应将甘露糖基团复合至嵌段聚合物Boc-PEG2000-NHS上的聚乙二醇段，脱Boc后加入(S)-4-苄基-2-恶唑烷酮进行开环聚合反应，加入聚乙烯亚胺充分反应，得甘露糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺；
S2、PD-L1抗体-基质金属蛋白酶蛋白2-聚乙二醇-聚乙烯亚胺的制备：N3-PEG2000-NH2和(S)-4-苄基-2-恶唑烷酮进行开环聚合反应，加入聚乙烯亚胺充分反应后，加入MMP2使其敏感肽Mal基团与聚乙二醇的叠氮基团发生点击反应，最后加入aPD-L1通过表面巯基跟敏感肽Mal基团反应，得PD-L1抗体-基质金属蛋白酶蛋白2-聚乙二醇-聚乙烯亚胺；
S3、聚合物的制备：将步骤S1所得甘露糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺和步骤S2所得PD-L1抗体-基质金属蛋白酶蛋白2-聚乙二醇-聚乙烯亚胺复合dsDNA形成聚合物。
进一步地，步骤S2中，所述MMP2的敏感肽Mal基团结构为Mal-GPLGVRG-Pra。
更进一步地，步骤S3中，所述甘露糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺和PD-L1抗体-基质金属蛋白酶蛋白2-聚乙二醇-聚乙烯亚胺中一端的聚乙烯亚胺通过多氨基结构的过正负电吸附作用，与带负电的dsDNA复合。
另外的，本发明还提供了所述靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物在制备治疗癌症药物中的应用。基于肿瘤微环境中细胞组成的相似特性及本发明靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物的靶向及作用原理，所述靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物适用于常见的实体瘤，可以达到相同的效果。
优选地，所述癌症为乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌或肝癌。
本发明具有以下有益效果：
本发明一种靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物采用PD-L1抗体靶向，提高纳米聚合物的聚集、增强抗体滞留的同时解除肿瘤周围免疫细胞的免疫阻断；协同激活肿瘤周围免疫细胞的STING通路改善肿瘤微环境募集T细胞，而不是直接作用于肿瘤细胞，通过“旁观者”效应实现杀伤周围肿瘤细胞的效果，应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明实施例1中甘露糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺的合成路线图。
图2为本发明实施例1中PD-L1抗体-基质金属蛋白酶蛋白2-聚乙二醇-聚乙烯亚胺的合成路线图。
图3a为本发明靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物的TEM图；图3b、3c为本发明靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物负载dsDNA效果的条带和数据统计图；图3d为本发明靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物的粒径统计图。
图4为实施例3中Raw264.7细胞摄取纳米粒子状况图。
图5为实施例4中细胞蛋白免疫印迹实验验证STING激活状况电泳图。
图6实施例5中纳米粒子体内聚集效果图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1嵌段聚合物载体的制备
1、甘露糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺【Mannose-PEG2000-PAsp(-PEI)】的制备
将嵌段聚合物Boc-PEG2K-NHS(0.1mmol)、盐酸D-甘露糖胺(0.1mmol)溶解在10mL的N,N-二甲基甲酰胺中，以1,1,3,3-四甲基胍作为保护剂，在50℃中反应48h；采用超纯水透析24h，得到产物Boc-PEG2000-Mannose后通过三氟乙酸/二氯甲烷(1：1)反应1h脱Boc基团，得到产物NH2-PEG-Mannose；所得产物在无水环境下用氯仿溶解，并且加入(S)-4-苄基-2-恶唑烷酮，开环聚合反应48h，得到产物Mannose-PEG2000-PBLA，此处的聚合度为60；将产物所得溶解于二甲基亚砜中，加入1.5～2倍摩尔比的PEI，35℃反应过夜后，先后通过甲醇及水透析12h，即得；具体合成路线参见图1。
2、PD-L1抗体-基质金属蛋白酶蛋白2-聚乙二醇-聚乙烯亚胺【aPD-L1-MMP敏感肽-PEG2000-PAsp(-PEI)】的制备
将N3-PEG2000-NH2在无水环境下用氯仿溶解，加入(S)-4-苄基-2-恶唑烷酮，开环聚合反应48h，得到产物N3-PEG2000-PBLA，此处的聚合度为60；将所得产物溶解于二甲基亚砜中，加入1.5～2倍摩尔比的PEI，35℃反应过夜后，先后通过甲醇及水透析12h；接着MMP的Mal基团与聚乙二醇的叠氮基团发生点击反应，此处的MMP2敏感肽结构为Mal-GPLGVRG-Pra，最后aPD-L1通过表面巯基跟MMP敏感肽-PEG2000-PAsp(-PEI)上的Mal基团反应，生成aPD-L1-MMP敏感肽-PEG2000-PAsp(-PEI)；具体合成路线参见图2。
实施例2靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物的制备与表征
1、靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物的制备
取实施例1制备得到的甘露糖-聚乙二醇-聚乙烯亚胺和PD-L1抗体-基质金属蛋白酶蛋白2-聚乙二醇-聚乙烯亚胺，通过复合dsDNA形成纳米聚合物颗粒。
其中dsDNA由两条DNA oligo复合形成双链，其序列结构为：5'-TACAGATCTACTAGTGATCTATG-3'，5'-ACTGATCTGTACATGATCTACA-3'；退火步骤如表1。
表1退火试剂及步骤
照表1顺序依次加入各种试剂，混匀，并参照步骤1～3设置PCR仪进行退火反应，即得。
2、靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物的表征
通过凝胶阻滞电泳实验验证dsDNA的形成以及纳米聚合物负载dsDNA的能力，具体包括以下步骤：
(1)验证dsDNA的形成：先配置2％的琼脂糖溶液，倒入平板后加1.5μL核酸染料，并搅匀，每孔加入等量dsDNA，每个样品中加入6X的DNA loading，混合均匀后将加到上样孔中，恒压100V电泳30min后停止电泳仪，取出凝胶，置于凝胶成像系统中，紫外灯下观察电泳条带并拍照；结果参见图3d，可见，DNA oligo已形成双链。
(2)验证纳米聚合物负载dsDNA的能力：按N/P比(聚合物的氮和dsDNA中磷的摩尔比)为1、2、4、6、8、10、20准备好聚合物样品，待凝胶完全凝固，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳液没过凝胶，每个样品中加入6X的DNA loading，混合均匀后将加到上样孔中，恒压100V电泳40min后停止电泳仪，取出凝胶，置于凝胶成像系统中，紫外灯下观察电泳条带并拍照。
结果参见图3b～3c，可见当N/P比较低时，聚合物不足以将dsDNA完全封装复合，游离的dsDNA向阳极移动，形成亮的条带，随着N/P比的增大，条带逐渐减弱，至N/P比足够大能将dsDNA完全复合，条带消失；图中结果显示，N/P比为10、20时，dsDNA的复合效果良好；当N/P比大于20时，dsDNA能被完全复合。
选取N/P比为20时的复合物作为细胞实验时复合点，测定其水力学直径及形貌结构，结果参见图3a；由图3a电镜结果可见，聚合物纳米粒子呈球形结构，加载aPD-L1后，聚合物结构外圈出现明显的蛋白晕，图3a右边为模拟肿瘤周围MMP-2基质金属酶含量高的环境下纳米粒子形态。
实施例3靶向肿瘤周围细胞激活免疫的聚合物细胞摄取状况
采用YOYO-1荧光标记dsDNA，验证抗原提呈细胞的摄取效果。使用六孔板，选取N/P比为20时的聚合物作为细胞实验时复合点，组别为Free DNA，Mannose-PEG2k-Pasp(PEI)和添加了过量甘露糖竞争的Mannose+Mannose-PEG2k-Pasp(PEI)，通过Leica SP8激光共聚焦显微镜观察Raw264.7细胞对摄取及胞内分布情况。具体步骤如下：
将Raw264.7以1×103个/孔接种于到6孔板中(预先放置洁净的玻片)制成细胞爬片，待细胞贴壁后，加入上述组别孵育4h；新鲜PBS洗两遍后，加入4％多聚甲醛固定细胞10min，再加入0.1％Triton X-100通透细胞膜10min，PBS清洗两次后，1μg/mL Hochest染核5min；抗荧光淬灭封片剂封片。细胞核使用405nm激光激发，DAPI荧光通道检测；YOYO-1使用491nm激光激发，FITC荧光通道检测。
结果参见图4，由图可见，Free DNA组别没有明显的荧光信号，代表着DNA没有被摄取，但载体组可以向细胞有效递送dsDNA，同时我们通过甘露糖竞争抑制组别发现，把Raw264.7表面的甘露糖受体竞争抑制后，细胞摄取的DNA量明显减少，因此载体中甘露糖的存在也增强了dsDNA的摄取。
实施例4细胞蛋白免疫印迹实验
将小鼠骨髓来源树突状细胞(DC2.4)或小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(Raw264.7)细胞以每孔1×106细胞密度接种于6孔板中，药物组别为实施例2所得纳米聚合物及常见的STING激动剂DMXAA，给药处理后2h、6h、12h、24h后，用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解提取细胞总蛋白；蛋白电泳使用12％凝胶分离不同分子量的蛋白，然后将其转移到PVDF膜上，用5％的BSA溶液封闭PVDF膜1h后，用一抗STING、p-TBK1、p-IRF3和β-Tublin在4℃下孵育过夜；TBST缓冲液洗膜3次，再用HRP标记的二抗孵育1h，TBST洗膜3次；最后，在化学发光检测系统上曝光相应的免疫印迹条带。
结果参见图5，下游信号角度比较两者对STING激活的差异：实施例2所得纳米聚合物在24h仍能维持磷酸化信号(p-IRF3)，表明相较于普通的STING激动剂，纳米聚合物激活STING的效果更持久，有效解决一般的小分子药物很难通过细胞膜屏障进入细胞内部与STING发生相互作用、同时其容易被组织中大量存在的酶水解而失活的问题。
实施例5体内靶向实验
预先种植小鼠乳腺癌细胞(4T1)肿瘤细胞到BAlb/c雌性小白鼠中，肿瘤体积达150mm3后，通过尾静脉注射通过cy7.5标记的Free aPD-L1、实施例2所得纳米聚合物；在预定的时间，用异氟烷麻醉小鼠后拍摄cy7.5在小鼠体内的分布情况。
结果参见图6，Free aPD-L1可以有效靶向小鼠肿瘤部位，证明采用aPD-L1靶向肿瘤组织是可取的，但是耗时较长，且很快就被降解；而实施例2所得纳米聚合物，由于纳米粒子独特的EPR效应，药物聚集时间缩短且作用时间更长，从而增强药物的疗效。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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