具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例的基因组甲基化文库的制备方法，包括以下步骤S1～S5：

S1、提供转座酶复合体(transposome)，转座酶复合体由转座接头和转座酶组成，转座接头含有转座子序列；

S2、使用转座酶复合体对基因组DNA(genomic DNA)进行片段化(tagmentation)，得到加上了转座接头且具有缺口的片段化产物；

S3、使用以mdCTP替代了dCTP的dNTPs对片段化产物进行缺口补齐(gap filling)；

S4、将经缺口补齐后的片段化产物进行转化处理(convert)，使未被甲基化修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶；

S5、将经转化处理后的片段化产物进行PCR扩增(amplification)，得到基因组甲基化文库。

本发明通过转座酶复合体对基因组DNA进行片段化并同时加上接头，然后利用mdCTP(甲基化修饰的胞嘧啶)替代了dCTP(未被甲基化修饰的胞嘧啶)的dNTPs对片段化的DNA进行缺口补齐，经转化处理后的文库序列含有原始链序列和转化链序列，从而可以解决甲基化文库比对分析的问题，实现更准确的甲基化位点分析，可以进行基因突变位点分析，也可大大提高文库碱基平衡性，大幅提高测序质量。

在一个具体示例中，转座接头为单链接头、双链接头和茎环接头中的一种或多种。

在一个具体示例中，转座接头含有甲基化修饰的胞嘧啶，从而可以避免转座接头在后续的转化处理中序列发生巨大变化，提高比对分析的准确性。可选地，转座接头还含有单分子标签序列，从而便于区分不同样本。

在一个具体示例中，转座接头包括序列如SEQ ID NO：1所示的第一接头和序列如SEQ ID NO：2所示的第二接头，以及序列如SEQ ID NO：3所示的第三接头或序列如SEQ IDNO：4所示的第四接头。采用第一接头、第二接头和第四接头时，制备的基因组甲基化文库是将两条互补链连接在一起，可以自身比对，不需要借助参考序列，序列信息更全面。

在一个具体示例中，在缺口补齐的步骤之前还包括以下步骤：使用具有3’端到5’端核酸外切功能的酶对片段化产物进行酶切处理以扩大转座酶复合体形成的缺口。例如Tn5转座酶复合体处理后会形成9bp的缺口，可以通过酶切处理形成95～105bp左右的缺口。如此，通过缺口补齐形成的部分更长，则未被转化的原始链序列更长，能够更加准确地与参考基因组进行比对分析从而定位其位置。

在一个具体示例中，上述酶切处理的步骤包括：在片段化产物中加入T4DNA聚合酶(polymerase)，于10℃～14℃酶切40～80min，然后在70℃～74℃孵育5～15min。

在一个具体示例中，转座酶选自Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn9、Tn10、Tn551、Tn971、Tn916、Tn1545、Tn1681、Tgf2、Tol2、Himar1和HARBI1中的一种或多种，但不限于此。

在一个具体示例中，转化处理采用酶法转化，例如可包括以下步骤：使用TET2酶和氧化增强剂将甲基化修饰的胞嘧啶氧化成羧基胞嘧啶，保护经过修饰的胞嘧啶，使其免受下游的脱氨基作用，然后使用脱氨酶例如APOBEC等对未被甲基化修饰的胞嘧啶进行脱氨基处理，但不影响羧基胞嘧啶。

在一个具体示例中，转化处理采用重亚硫酸盐转化，例如可包括以下步骤：使用亚硫酸氢盐将未被甲基化修饰的胞嘧啶磺化和水解脱氨，生成尿嘧啶磺酸盐中间产物，然后在碱性条件下对所述尿嘧啶磺酸盐中间产物进行脱磺酸基处理，但并不影响甲基化修饰的胞嘧啶。

在一个具体示例中，上述PCR扩增时所用的扩增引物含有测序接头序列和/或标签序列。可选地，制备方法还包括以下步骤：对上述PCR扩增所得的产物进行纯化(purification)。可选地，纯化方法为膜柱子法或磁珠法等。

本发明一实施例的基因组甲基化文库，其根据如上所述的制备方法制备得到。

本发明一实施例的测序方法，包括以下步骤S1～S3：

S1、根据如上所述的制备方法制备得到基因组甲基化文库；

S2、对基因组甲基化文库进行双端测序，获得双端测序数据；

S3、将双端测序数据与参考基因组数据进行比对，测序reads中通过缺口补齐形成的部分用于序列定位，测序reads中其他部分用于判断甲基化位点，根据比对到参考基因组序列上的信息，获得基因组DNA的甲基化位点。通过缺口补齐形成的部分与原核酸序列相同，用于序列定位，测序reads中其他部分中未被甲基化修饰的胞嘧啶已转变为胸腺嘧啶，用于判断甲基化位点。

在一个具体示例中，在进行比对之前还包括以下步骤：去除双端测序数据中的接头、测序引物(sequencing primer)和低质量数据，获得干净的双端测序数据以用于比对，从而筛选得到高质量的比对序列。

在一个具体示例中，在进行双端测序之前还包括以下步骤：对基因组甲基化文库进行目的基因片段捕获和纯化，从而获得目的基因的甲基化文库，如此以用于靶向基因甲基化测序。

下面主要结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细的说明。

实施例1采用Tn5转座酶介导的基因组甲基化文库构建

(1)样本准备：取HEK293细胞，使用细胞基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。所得的核酸分别用50μL TE buffer溶解，并使用Qubit 3.0荧光计进行浓度测定。最后取50ngDNA按照下述的操作步骤进行文库构建。

(2)Tn5处理标记：

a、合成含有19bp转座酶识别序列的核酸片段(详细序列如下述SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示)，其中序列B和序列C中部分胞嘧啶为甲基化修饰的胞嘧啶(C)。序列B和序列C中，“N”代表任意碱基A、T、C或者G，其中胞嘧啶为甲基化修饰的胞嘧啶。

接头序列A：CTGTCTCTTATACACATCT(SEQ ID NO：1)；

接头序列B：TCGTCGGCAGCGTCNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO：2)；

接头序列C：TCTCGTGGGCTCGGNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO：3)。

b、将接头序列A、B和C分别稀释到100μM，序列A+序列B按1:1混合，序列A+序列C按1:1混合，充分混合后离心，于PCR仪中按如下程序(表1)退火得到转座接头(储存于-20℃)，用于转座酶复合体的制备。

表1

c、按照如下体系(表2)将转座接头与转座酶包埋成转座酶复合体，轻轻吹打20次混合，30℃孵育1小时后完成复合体包埋，该转座酶复合体储存于-20℃。

表2

d、按照如下体系(表3)将50ng的高质量基因组DNA和转座酶复合体进行混合，轻轻吹打20次混合，55℃孵育10分钟后降温至4℃，完成基因组的打断，其工作原理如图1所示。

表3

e、终止反应：反应完成后立即向产物中加入5μL 5×终止液，使用移液器轻轻吹打充分混匀，置于室温放置5min。

(3)修补缺口：经Tn5处理后会形成9bp的缺口，向上述产物中加入15μL的PCRMaster Mix(mdCTP替代dCTP的dNTP)，然后在72℃孵育10min。

(4)转化：使用QIAGEN公司的Fast DNA Bisulfite Kit处理上述产物，将30μL产物加入110μL转换试剂中(85μL Bisulfite Solution，25μL DNA ProtectBuffer)，瞬离后放入PCR仪，设定反应程序如下：95℃，5min；60℃，20min；95℃，5min；60℃，20min；20℃，∞；反应结束后将产物转移至1.5mL离心管中，加入310μL Buffer BL和250μL无水乙醇，充分混匀后瞬时离线，将全部液体转移至膜柱子DNA spin columns上离心1min，加入500μL清洗液Buffer BW后离心1min，加入500μL脱磺液Buffer BD后室温(20～30℃)静置15～20min，离心1min，加入500μL清洗液Buffer BW离心1min，重复清洗一次；加入250μL无水乙醇离心1min，开盖后于60℃放置5min以去除残余液体，加入25μL洗脱液Buffer EB后室温(20～30℃)静置1min，离心1min收集洗脱液。

(5)扩增：按照下表4进行反应体系的配制：

表4

涡旋混匀后瞬时离心，在PCR仪中按如下表5程序进行反应：

表5

(6)纯化：使用Beckman公司的AMPure XP磁珠进行文库片段分选，选用的分选比例为第一轮0.7×，第二轮为0.2×，所得文库大小为400bp左右。文库质检：文库通过Qubit3.0核酸定量仪定量，并进行琼脂糖凝胶电泳查看文库分布。本实施例的实验流程如图2所示。

实施例2Tn5转座酶介导和缺口酶切处理的基因组甲基化文库构建

(1)样本准备：取HEK293细胞，使用细胞基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。所得的核酸分别用50μL TE buffer溶解，并使用Qubit 3.0荧光计进行浓度测定。最后取50ngDNA按照下述的操作步骤进行文库构建。

(2)Tn5处理标记：

a、合成含有19bp转座酶识别序列的核酸片段(详细序列如下述SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示)，其中序列B和序列C中部分胞嘧啶为甲基化修饰的胞嘧啶(C)。序列B和序列C中，“N”代表任意碱基A、T、C或者G，其中胞嘧啶为甲基化修饰的胞嘧啶。

接头序列A：CTGTCTCTTATACACATCT(SEQ ID NO：1)；

接头序列B：TCGTCGGCAGCGTCNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO：2)；

接头序列C：TCTCGTGGGCTCGGNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO：3)。

b、将接头序列A、B和C分别稀释到100μM，序列A+序列B按1:1混合，序列A+序列C按1:1混合，充分混合后离心，于PCR仪中按表1退火得到转座接头(储存于-20℃)，用于转座酶复合体的制备。

c、按照表2将转座接头与转座酶包埋成转座酶复合体，轻轻吹打20次混合，30℃孵育1小时后完成复合体包埋，该转座酶复合体储存于-20℃。

d、按照表3将50ng的高质量基因组DNA和转座酶复合体进行混合，轻轻吹打20次混合，55℃孵育10分钟后降温至4℃，完成基因组的打断。

e、终止反应：反应完成后立即向产物中加入5μL终止液，使用移液器轻轻吹打充分混匀，置于室温放置5min。

(3)核酸外切酶处理：向上述产物中加入1μL的T4 DNA Polymerase(5U/μL)和4μL的5×Reaction Buffer，充分混匀，瞬离离心，12℃酶切60min，然后在72℃孵育10min。

(4)修补缺口：经酶切处理后会形成100bp左右的缺口，向上述产物中加入终浓度为10mM的dNTP(其中mdCTP替代dCTP)，充分混匀，瞬离，37℃反应15min，70℃孵育10分钟终止反应。

(5)使用QIAGEN公司的Fast DNA Bisulfite Kit处理上述产物，将上述产物补水至30μL加入110μL转换试剂中(85μL Bisulfite Solution，25μLDNA ProtectBuffer)，瞬离后放入PCR仪，设定反应程序如下：95℃，5min；60℃，20min；95℃，5min；60℃，20min；20℃，∞；反应结束后将产物转移至1.5mL离心管中，加入310μL Buffer BL和250μL无水乙醇，充分混匀后瞬时离线，将全部液体转移至膜柱子DNA spin columns上离心1min，加入500μL清洗液Buffer BW后离心1min，加入500μL脱磺液Buffer BD后室温(20～30℃)静置15～20min，离心1min，加入500μL清洗液Buffer BW离心1min，重复清洗一次；加入250μL无水乙醇离心1min，开盖后于60℃放置5min以去除残余液体，加入25μL洗脱液Buffer EB后室温(20～30℃)静置1min，离心1min收集洗脱液。

(6)扩增：按照表4进行反应体系的配制，涡旋混匀后瞬时离心，在PCR仪中按如表5程序进行反应。

(7)纯化：使用Beckman公司的AMPure XP磁珠进行文库片段分选，选用的分选比例为第一轮0.7×，第二轮为0.2×，所得文库大小为400bp左右。文库质检：文库通过Qubit3.0核酸定量仪定量，并进行琼脂糖凝胶电泳查看文库分布。本实施例的实验流程如图3所示。

实施例3不同接头组合及Tn5转座酶介导的基因组甲基化文库构建

(1)样本准备：取HEK293细胞，使用细胞基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取。所得的核酸分别用50μL TE buffer溶解，并使用Qubit 3.0荧光计进行浓度测定。最后取50ngDNA按照下述的操作步骤进行文库构建。

(2)Tn5处理标记：

a、合成含有19bp转座酶识别序列的核酸片段(详细序列如下述SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：4所示)，其中序列B中部分胞嘧啶为甲基化修饰胞嘧啶(C)。序列B和序列D中，“N”代表任意碱基A、T、C或者G，其中胞嘧啶为甲基化修饰的胞嘧啶。

接头序列A：CTGTCTCTTATACACATCT(SEQ ID NO：1)；

接头序列B：TCGTCGGCAGCGTCNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO：2)；

接头序列D：

CTGTCTCTTATACACATCTNNNNNNNNAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO.4)。

b、将接头序列A、B和D分别稀释到100μM，序列A+序列B按1:1混合，序列D可自身互补形成茎环，充分混匀后离心，于PCR仪中按表1退火得到转座接头(储存于-20℃)，用于转座酶复合体的制备。

c、按照表2将转座接头与转座酶包埋成转座酶复合体，轻轻吹打20次混合，30℃孵育1小时后完成复合体包埋，该复合体储存于-20℃。

d、按照表3将50ng的高质量基因组DNA和转座酶复合体进行混合，轻轻吹打20次混合，55℃孵育10分钟后降温至4℃，完成基因组的打断。

e、终止反应：反应完成后立即向产物中加入5μL 5×终止液，使用移液器轻轻吹打充分混匀，置于室温放置5min。

(3)修补缺口：向上述产物中加入1μL T4 DNA聚合酶(5U/μL)、4μL的5×ReactionBuffer、终浓度为10mM的dNTP(其中mdCTP替代dCTP)37℃反应15min，70℃孵育10min后，加入1μL T4 DNA链接酶(5U)和5μL 5×Buffer，然后在22℃孵育10min，然后在72℃孵育5min。

(4)转化：使用QIAGEN公司的Fast DNA Bisulfite Kit处理上述产物，将上述产物补水至30μL加入110μL转换试剂中(85μL Bisulfite Solution，25μL DNAProtect Buffer)，瞬离后放入PCR仪，设定反应程序如下：95℃，5min；60℃，20min；95℃，5min；60℃，20min；20℃，∞；反应结束后将产物转移至1.5mL离心管中，加入310μL BufferBL和250μL无水乙醇，充分混匀后瞬时离线，将全部液体转移至膜柱子DNAspin columns上离心1min，加入500μL清洗液Buffer BW后离心1min，加入500μL脱磺液Buffer BD后室温(20～30℃)静置15～20min，离心1min，加入500μL清洗液Buffer BW离心1min，重复清洗一次；加入250μL无水乙醇离心1min，开盖后于60℃放置5min以去除残余液体，加入25μL洗脱液Buffer EB后室温(20～30℃)静置1min，离心1min收集洗脱液。

(5)扩增：按照表4进行反应体系的配制，涡旋混匀后瞬时离心，在PCR仪中按如表5程序进行反应。

(6)纯化：使用Beckman公司的AMPure XP磁珠进行文库片段分选，选用的分选比例为第一轮0.7×，第二轮为0.2×，所得文库大小为400bp左右。文库质检：文库通过Qubit3.0核酸定量仪定量，并进行琼脂糖凝胶电泳查看文库分布。本实施例的实验流程如图4所示。

实施例4甲基化文库在基因组甲基化测序中的应用

(1)文库构建：按照实施例1～3中的建库流程分别进行基因组甲基化文库建库。

(2)高通量测序：将质检好的文库分别在Illumina测序仪上进行高通量测序，获得文库序列信息。

(3)数据分析：实施例1的文库所得测序reads的3’端有9bp的原始链序列信息，可与参考基因组进行比对分析，根据3’端定位reads在基因组的位置，从而确定reads甲基化位点信息，序列比对原理如图5所示；

实施例2的文库所得测序reads的3’端有100bp左右的原始链序列信息，可与参考基因组进行比对分析，根据3’端定位reads在基因组的位置，从而确定reads甲基化位点信息；

实施例3的文库所得测序reads的中间段有接头序列信息，接头两端序列为原互补原始链序列，可自身进行比对分析，从而确定甲基化位点信息。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州滴纳生物科技有限公司

<120> 基因组甲基化文库及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgtctctta tacacatct 19

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgtcggcag cgtcnnnnnn agatgtgtat aagagacag 39

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tctcgtgggc tcggnnnnnn agatgtgtat aagagacag 39

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgtctctta tacacatctn nnnnnnnaga tgtgtataag agacag 46