一种将On-DNA芳硝基化合物还原成On-DNA芳胺化合物的方法
阅读说明：本技术 一种将On-DNA芳硝基化合物还原成On-DNA芳胺化合物的方法 (Method for reducing On-DNA aromatic nitro compound into On-DNA aromatic amine compound ) 是由 李进 彭婷 苏立强 冯静 刘观赛 万金桥 于 2020-05-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种将On-DNA芳硝基化合物经还原反应将硝基还原为氨基制备On-DNA芳胺化合物的方法,该方法以On-DNA硝基化合物为底物,在二氧化硫脲和碱性条件下将硝基化合物还原为On-DNA芳胺化合物,本发明方法后处理简单,环境友好；且能够在较短时间内高收率得到高多样性的DNA编码化合物,并且适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。(The invention relates to a method for preparing an On-DNA arylamine compound by reducing nitro of the On-DNA arylamine compound into amino through reduction reaction, the method takes the On-DNA nitro compound as a substrate, and reduces the nitro compound into the On-DNA arylamine compound under the condition of thiourea dioxide and alkalinity; and can obtain highly diverse DNA-encoding compounds in a short time and at a high yield, and is suitable for synthesis of libraries of DNA-encoding compounds using multiwell plates.)
技术领域
本发明属于编码化合物库技术领域，具体涉及一种DNA编码化合物库构建中的On-DNA硝基的还原方法。
背景技术
在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，并能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(Accounts of ChemicalResearch,2014,47,1247-1255)。
DNA编码化合物库通过组合化学快速产生巨型化合物库，并且能高通量地筛选出先导化合物，使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效。构建DNA编码化合物库的挑战之一就是需要在DNA上高收率地合成具有化学多样性的小分子。由于DNA需要在一定的条件下(溶剂、pH、温度、离子浓度)才能维持稳定，同时应用于DNA编码化合物库构建的On-DNA反应还需要有较高的产率。因此DNA上进行的化学反应(简称On-DNA反应)的试剂种类、反应种类、反应条件直接影响到DNA编码化合物库的丰富度和可选择性。从而开发能够与DNA兼容的化学反应也成为目前DNA编码化合物库技术的长期探索和研究方向，也直接影响了DNA编码化合物库的应用及商业价值。
硝基和氨基在药物化合物和化学反应官能团转化中非常常见，硝基常作为氨基的一种潜在官能团而大量存在。将硝基转换为氨基的多样性反应引入到DNA编码化合物库中能进一步扩展化合物库的多样性，有利于提高筛选到有效化合物的概率。目前已有多种方法能够实现On-DNA硝基转化为氨基的方法，例如第一种是用水合肼为氢源，Raney Ni为还原剂，在室温下还原On-DNA芳硝基化合物为芳胺(参考文献：Bioconjugate Chem.,2015,1623-1632)；第二种是用水为氢源、硫酸亚铁为还原剂，氢氧化钠存在的情况下，在80℃或更低的温度下还原On-DNA芳硝基化合物为芳胺(参考文献：ACSComb.Sci.,2018,20,251-255)；第三种是用水为氢源、连二亚硫酸钠为还原剂，甲基紫精存在的情况下，在80℃下短时间还原On-DNA芳硝基化合物为芳胺(参考文献：BioconjugateChem.,2017,28,2575)。第一种方法的Raney Ni不是均相溶液，很难通过移液批量加入，过量的Ni金属残留对DNA也有一定的破坏作用，第二种方法二价Fe的使用对于库中金属残留的控制是一个难题，且反应过程中容易产生墨绿色沉淀，后处理困难，第三种方法经常出现氨基亚硫酸盐的副产物，且难以转化为产物。
因此开发一种新颖、简单、快捷、不需要金属还原剂的且适用于大批量多孔板的DNA编码化合物库的硝基还原方法，可以拓展硝基还原的多样性，增加DNA编码化合物库的多样性，提升DNA编码化合物库技术的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种将On-DNA芳硝基化合物还原成On-DNA芳胺化合物的方法，所述反应是以On-DNA芳硝基化合物为底物，在二氧化硫脲和碱性条件下将On-DNA芳硝基化合物还原为On-DNA芳胺化合物；其中On-DNA芳硝基化合物的结构式为DNA-Ar-NO2；On-DNA芳胺化合物的结构式为DNA-Ar-NH2；
其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与Ar相连；
其中，结构式中的DNA与Ar通过一个化学键或多个化学键或基团连接。一个化学键时，是指结构式中的DNA与Ar直接相连；多个化学键时，指结构式中的DNA与Ar之间间隔多个化学键相连，比如，DNA与Ar之间通过一个亚甲基(-CH2-)相连，即通过两个化学键连接；或DNA与Ar之间通过一个羰基(-CO-)连接DNA的氨基，也是通过两个化学键连接；或DNA与Ar通过一个亚甲基羰基(-CH2CO-)连接DNA的氨基，也是通过三个连续的化学键连接。
其中，结构式中Ar选自可选取代的单环或双环的芳香环；所述On-DNA芳硝基化合物的-NO2连接于Ar的环上，所述On-DNA芳胺化合物的-NH2连接于Ar的环上。
所述Ar选自以下基团：
R1为氢、卤素、氰基、羟基、羧基、氨基、取代氨基、烷基、取代烷基、烷基氨基、取代烷基氨基、烷氧基、取代烷氧基中的任意一种或多种的随机组合，Ar上可以有一个或多个R1基团，X为O、S、NH或烷基取代亚氨基中的任意一种；
所述烷基为C1-C12的直链或支链烷基或C3-C8环烷基；所述的烷氧基为C1-C12的直链或支链烷氧基；
取代氨基的取代基的数量为一个或多个，取代氨基的取代基是相互独立的选自苯基、C1-C12烷基、C3-C8环烷基、烷氧基苯基中的一种或多种；
取代烷基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、羧基、苯基、氨基、烷氧基苯基中的一种或多种；
取代烷基氨基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基氨基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、氨基、烷氧基、苯基、烷氧基苯基中的一种或多种；
取代烷氧基的取代基的数量为一个或多个，取代烷氧基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、羧基、苯基中的一种或多种。
作为优选，所述的R1选自取代烷基氨基，所述烷基为C1～C6烷基或C3-C6环烷基；所述C1～C6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述的C3-C6环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基或环己基；所述取代烷基氨基的取代基是选自苯基、烷氧基或氨基，更进一步地，所述烷氧基为C1～C6烷氧基，具体选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊烷氧基、己烷氧基。
作为优选，所述的R1选自取代烷氧基，所述烷氧基为C1～C6烷氧基，具体选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊烷氧基、己烷氧基；所述取代烷氧基的取代基选自羧基。
作为优选，所述的R1选自取代烷基；所述烷基为C1～C6烷基；所述C1～C6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；取代烷基的取代基选自羧基。
作为优选，所述的R1选自取代氨基，所述取代氨基的取代基选自苯基、烷氧基苯基、C1-C6烷基或C3-C6环烷基；更进一步地，所述的烷氧基苯基为C1～C6烷氧基苯基，具体选自甲氧基苯基、乙氧基苯基、正丙氧基苯基、异丙氧基苯基、正丁氧基苯基、异丁氧基苯基、叔丁氧基苯基、戊烷氧基苯基、己烷氧基苯基；所述的C1～C6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述的C3-C6环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
优选地，所述Ar选自
作为优选，所述的On-DNA芳硝基化合物选自：
所述Rl为氢、卤素、氰基、拜基、羧基、氨基、Cl-C6烷基、Cl-C6烷基氨基、Cl-C6烷氧基中的任意一种或多种的随机组合；
或所述的R1选自取代烷基氨基，所述烷基为C1～C6烷基或C3-C6环烷基；所述C1～C6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述的C3-C6环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基或环己基；所述取代烷基氨基的取代基是选自苯基、烷氧基或氨基，更进一步地，所述烷氧基为C1～C6烷氧基，具体选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊烷氧基、己烷氧基。
或所述的R1选自取代烷氧基，所述烷氧基为C1～C6烷氧基，具体选自甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、戊烷氧基、己烷氧基；所述取代烷基氧基的取代基选自羧基。
或所述的R1选自取代烷基；所述烷基为C1～C6烷基；所述C1～C6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；取代烷基的取代基选自羧基。
或所述的R1选自取代氨基，所述取代氨基的取代基选自苯基、烷氧基苯基、C1-C6烷基或C3-C6环烷基；更进一步地，所述的烷氧基苯基为C1～C6烷氧基苯基，具体选自甲氧基苯基、乙氧基苯基、正丙氧基苯基、异丙氧基苯基、正丁氧基苯基、异丁氧基苯基、叔丁氧基苯基、戊烷氧基苯基、己烷氧基苯基；所述的C1～C6烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊烷基、己烷基；所述的C3-C6环烷基选自环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
更进一步的，所述On-DNA芳硝基化合物具体选自：
一种将On-DNA芳硝基化合物还原成On-DNA芳胺化合物的方法，包括以下步骤：是向摩尔当量为1，摩尔浓度为0.1～2mM的On-DNA芳硝基化合物溶液中，加入5～200倍摩尔当量的二氧化硫脲和5～500倍摩尔当量的碱，在20℃～100℃下反应1～24小时至反应结束。
优选地，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯、N，N-二异丙基乙胺或1,1,3,3-四甲基胍。
优选地，所述溶液为乙腈、甲醇、乙醇、DMF、DMA、DMSO、THF、水、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中的一种或几种含水的混合溶剂。
优选地，所述反应在缓冲体系中进行，进一步地，所述溶液为硼酸盐缓冲液，所述硼酸盐缓冲液的pH＝9.4。
所述反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或90℃。
所述On-DNA芳硝基化合物溶液的摩尔浓度为0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.4mM，0.5mM，0.6mM，0.7mM，0.8mM，0.9mM，1.0mM，1.1mM，1.2mM，1.3mM，1.4mM，1.5mM，1.6mM，1.7mM，1.8mM，1.9mM或2.0mM。
优选地，当On-DNA芳硝基化合物的摩尔当量为1，所述二氧化硫脲合物的摩尔当量为10当量、30当量、50当量、70当量、90当量、100当量或200当量，所述碱的摩尔当量为50当量、100当量、200当量、300当量、400当量或500当量。
进一步地，所述反应的加料顺序为先将碱和二氧化硫脲混合，再加入到On-DNA硝基化合物的溶液中。
进一步地，上述方法用于批量的多孔板操作。
进一步地，上述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。
本发明方法可以实现通过DNA编码化合物库中硝基还原成氨基的方法，可大规模的引入氨基。该方法收率高，产物单一，后处理简单，绿色环保，且适合大规模多孔板操作，为DNA编码化合物库提供了新的骨架。
在本发明的优选实施方案中，通过控制反应原料和试剂的配比以及加料顺序，提高反应产率，提升本发明方法应用于DNA编码化合物库建库的准确度。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(Ca～Cb)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C1～C12烷基是指包含1～12个碳原子的直链或支链的烷基。
烷基是指烷烃分子中少掉一个氢原子而成的直链或支链的烃基，例如甲基-CH3，乙基-CH2CH3；烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团例如为C1～C6烷氧基，C1～C6烷基氨基。
环烷基：是指具有多个碳原子且没有环杂原子且具有单个环或多个环(包括稠合、桥连和螺环体系)的饱和或部分饱和的环状基团。
所述卤素为氟、氯、溴或碘。
烷氧基：是指烷基与氧原子连接形成取代基，例如甲氧基为-OCH3。
烷基氨基：是指烷基与氨基氮原子连接形成取代基，例如甲基氨基为-NH2CH3。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：本发明实施例4中合成的29种On-DNA芳胺化合物相应的转化率分布图。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本发明中，“室温”指20～25℃。
DMA：二甲基乙酰胺(Dimethylacetamide)；DMF：二甲基甲酰胺。
HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯；
DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；
DMSO：二甲基亚砜；THF：四氢呋喃。
本发明中DNA-NH2或是单链或双链DNA与接头基团形成的带有-NH2接头的DNA结构，例如WO2005058479中“compound1”的DNA-NH2结构。
实施例1、On-DNA硝基化合物还原成On-DNA芳胺化合物的方法
1)On-DNA硝基化合物的合成
将DNA-NH2溶解在硼酸盐缓冲液(0.25M，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中加入预先混合液(含有羧酸的芳硝基化合物(100摩尔当量，200mM的DMA溶液)，HATU(100摩尔当量，200mM的DMA溶液)，DIPEA(100摩尔当量，200mM的DMA溶液)，室温反应3小时，反应完成后进行乙醇沉淀处理得到On-DNA硝基化合物中间体，直接用于下一步；
将原位生成的On-DNA硝基化合物2溶解在硼酸盐缓冲液(0.25M,pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中加入苯乙胺(200摩尔当量，200mM的DMSO溶液)75℃反应16小时，反应完成后进行乙醇沉淀处理得到On-DNA硝基化合物3，直接用于下一步。
2)On-DNA芳胺化合物的合成
将On-DNA芳硝基化合物3溶解在硼酸盐缓冲液(0.25M，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中加入预先混合液(NaOH(100摩尔当量，1000mM的水溶液)，二氧化硫脲(50摩尔当量，200mM的水溶液))，室温反应2小时；
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀于-40℃真空冻干，得到On-DNA芳胺化合物4，送LCMS确认反应转化率为90％。
实施例2、On-DNA硝基化合物还原成On-DNA芳胺化合物的方法
将On-DNA芳硝基化合物3溶解在溶剂X中，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，再将NaOH(Z摩尔当量，1000mM的水溶液)，二氧化硫脲(Y摩尔当量，200mM的水溶液)室温下混合5min，然后将混合液加入到On-DNA芳硝基化合物3溶液中，室温反应2小时；
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀于-40℃真空冻干，得到On-DNA芳胺化合物4，送LCMS确认反应转化率。具体反应条件见下表1。
所述的溶剂选自水或者硼酸盐缓冲液(0.25M，pH＝9.4)。
表1：实施例2具体反应条件和产率数据表
上述实验结果表明，实验2的反应条件下产率最高。
实施例3、On-DNA硝基化合物还原成On-DNA芳胺化合物的方法
将On-DNA芳硝基化合物3溶解在硼酸盐缓冲液(0.25M，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中依次加入二氧化硫脲(50摩尔当量，200mM的水溶液)，NaOH(100摩尔当量，1000mM的水溶液)，室温下，一锅反应2小时；
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀于-40℃真空冻干，得到On-DNA芳胺化合物4，送LCMS确认反应转化率为78％。
实施例4、On-DNA硝基化合物还原成On-DNA芳胺化合物的方法
DNA-NH2→DNA-NH-Ar-NO2
将DNA-NH2溶解在硼酸盐缓冲液(0.25M，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，向该溶液中加入芳硝基化合物(50摩尔当量，200mM的DMSO溶液)90℃反应16小时，反应完成后进行乙醇沉淀处理得到On-DNA芳硝基化合物，直接用于下一步。
按照上述方法合成29种On-DNA芳硝基化合物。
1)On-DNA芳胺化合物的合成
将29种On-DNA芳硝基化合物分别溶解在硼酸盐缓冲液(0.25M，pH＝9.4)，配制成1mM浓度溶液(10μL，10nmol)，将NaOH(100当量，1000mM的水溶液)，二氧化硫脲(50当量，200mM的水溶液)室温下混合5min，然后将混合液分别加入到29种On-DNA芳硝基化合物溶液中，室温反应2小时；
反应完毕后进行乙醇沉淀：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于-20℃中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液，余下沉淀于-40℃真空冻干，得到On-DNA芳胺化合物，送LCMS确认反应转化率，具体化合物结构和产率见图1。
综上所述，本发明通过控制反应时的加料顺序、温度、pH等条件，由On-DNA硝基化合物在氧化硫脲和碱性条件下，可以得到On-DNA氨基化合物。该方法底物使用范围广，后处理简单，环境友好能够在较短时间内高收率得到高多样性的DNA编码化合物库，并且适合使用大批量多孔板操作。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
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