具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明人首次开发了一种半衰期延长的药物及其文库、以及制备方法和应用。采用本发明药物文库、制备方法可根据需要，快速、高效、低成本、高得率地组装半衰期延长的药物。在此基础上完成本发明。

具体地，本发明提供一种半衰期延长的药物，它包括：(a)药物单元；和(b)与所述药物单元通过核酸碱基互补方式偶联的n个半衰期延长单元；其中，所述的药物单元包括药物元件部分(moiety)以及与所述药物元件部分相连的第一核酸元件部分，所述的半衰期延长单元包括半衰期延长元件部分以及与所述的半衰期延长元件部分相连的第二核酸元件部分，并且一个所述药物单元的所述的核酸元件部分与至少一个半衰期延长单元的核酸元件部分可通过互补形成碱基互补的配对结构(例如双链配对结构)，从而构成所述药物；其中，n为≥1的正整数。，本发明半衰期延长的药物仅通过快速组装(如1分钟)形成稳定的核酸碱基互补的配对结构(而非复杂的肽键或其它化学修饰等)。实验表明，当本发明药物可以通过FcRn结合元件、或与FcRn结合蛋白(如血清白蛋白)结合的结合元件与FcRn进行特异性的结合。出乎意料地，当本发明药物被血液中的造血细胞或血管内皮细胞通过胞饮作用内吞后，可进入内含体(endosome)并与其中的FcRn结合，从而进入到回收途径，并耐受胞内和内含体等多种环境下的降解。这样，本发明药物可有效避免进入到降解途径被溶酶体(lysosome)所降解。此外，本发明药物被循环到细胞表面后，可在中性生理条件下(如约pH7.4)与FcRn解离，释放到血液中,从而实现循环利用(参见图1)。

术语

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

如本文所用，术语“蛋白药物”、“多肽药物”可互换使用，指含有氨基酸通过肽键形成多肽序列的药物，所述药物可以仅由氨基酸序列构成，也可以基本上由氨基酸序列构成。此外，该术语还包括未修饰或修饰的形式，例如，糖基化的蛋白药物、PEG化的蛋白药物、ADC形式的蛋白药物。

如本文所用，术语“半衰期延长单元”、“半衰期延长模块”、“半衰期提升模块”可互换使用，均指这样的元件或模块，它含有半衰期延长元件部分以及与所述的半衰期延长元件部分相连的第二核酸元件部分，并用于通过碱基互补方式形成“药物单元-半衰期延长单元”复合物，进而使蛋白药物复合物的半衰期延长。

如本文所用，术语“蛋白药物复合物”或“药物单元-半衰期延长单元的复合物”可互换使用，指药物单元和半衰期延长单元通过碱基互补形成的药物复合物。

药物T

本发明中，所述药物单元包括药物元件部分以及与所述药物元件部分相连的第一核酸元件部分。

其中，所述药物元件部分为蛋白类药物、多肽类药物。

典型地，所述蛋白类药物包括但不限于抗体、融合蛋白、生长因子、激素(例如胰岛素、生长激素等)。

在本发明的一个优选的实施例中，所述蛋白类药物为治疗A型血友病的长效八因子(FVIII)。

半衰期延长单元A

本发明中，所述的半衰期延长单元包括半衰期延长元件部分以及与所述的半衰期延长元件部分相连的第二核酸元件部分。

具体地，本发明利用核酸配对介导的多特异性抗体自组装技术(专利申请号201710322583.3)，将靶向FcRn的蛋白或多肽(半衰期延长因子)和药物分别与核酸元件相连形成FcRn靶向单元，然后通过核酸元件互补配对将两者偶联在一起，形成可被细胞回收的长效药物。

所述半衰期延长元件部分(半衰期延长因子)可分为以下几大类：

2.1 HSA蛋白

HSA蛋白可以是血源提取的HSA，也可以是酵母等低成本表达系统重组表达的HSA。HSA有一个游离的Cys34，可用于定点偶联活化后的单链耐降解核酸(如反向核酸)。当然，若是不要求定点偶联，HSA表面的NH₂也可以用于随机偶联单链核酸。

2.2 HSA结合蛋白

HSA结合蛋白类型包括纳米抗体、单链抗体、Fab以及全长IgG抗体。根据本发明，优选的HSA结合蛋白为制备成本较低的纳米抗体、单链抗体。

2.3 HSA结合多肽与结构域

特定序列的多肽也可以与HSA结合，比如多肽SA21(氨基酸序列：Ac-RLIEDICLPRWGCLWEDD-NH₂，SEQ ID NO.6)，其中的核心序列为DICLPRWGCLW(SEQ ID NO.7)，含有核心序列的多肽均能不同程度的与HSA结合，成为本发明专利的半衰期提升因子。

其他蛋白结构域经过定向改造、进化等手段，也可以成为HSA结合蛋白结构域，比如Affibody、DART等人工改造小片段抗体。

2.4 HSA结合核酸

部分核酸适配体(aptamer)可以特异性的与HSA结合，比如其中一个RNA类型的核酸适配体序列为5'-GUGGACUAUACCGCGUAAUGCUGCCUCCAC-3'(SEQ IDNO.8)。本发明优选的HSA结合核酸优选与核酸框架的类型一致，便于合成、制备，比如可以都选择L-RNA或是L-DNA。

另外，树枝状烷基链(dendritic alkyl chains)修饰过的核酸也可以与HSA结合，例如J.Am.Chem.Soc.2017.139.21.7355-7362报道了一种利用树枝状烷基修饰过的DNA组装形成的DNA笼(DNA cube)，可以高亲和力地与HSA结合。

对于蛋白或多肽类的半衰期延长因子，为便于它们与活化的L-核酸偶联，半衰期延长因子上会引入一个特异性的位点(如突变位点，Cys)，用于连接物的偶联。

对于核酸类的半衰期延长因子，可将其序列与用于组装的同类型核酸进行整合，同时合成。

药物文库

本发明提供一种药物文库，所述药物文库包括：(a)药物单元；和(b)n个半衰期延长单元；

其中，所述的药物单元包括药物元件部分以及与所述药物元件部分相连的第一核酸元件部分；

所述的半衰期延长单元包括半衰期延长元件部分以及与所述的半衰期延长元件部分相连的第二核酸元件部分；

并且所述药物单元的一个所述的第一核酸元件部分与至少一个半衰期延长单元的第二核酸元件部分可通过形成碱基互补的配对结构(例如双链配对结构)，从而构成“药物单元-半衰期延长单元”复合物；

其中，n为≥1的正整数。

如本文所用，所述“互补”包括直接互补配对或通过一个或多个(如2个、3个、4个、5个、6个)辅助互补核酸分子(即核酸F)的单链互补序列发生互补形成碱基互补的配对结构(例如双链配对结构)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述辅助互补核酸分子(即核酸F)为多聚化协助分子(链)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述药物单元和半衰期延长单元在所述多聚化协助分子(链)的存在下形成多聚体。

典型地，所述“互补”为直接互补配对。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述“互补”为通过1个辅助互补核酸分子(即核酸F)的单链互补序列发生互补形成碱基互补的配对结构。

在本发明的另一个优选的实施方式中，所述“互补”为通过2个辅助互补核酸分子(即核酸F)的单链互补序列发生互补形成碱基互补的配对结构(如图2所示)。

本发明文库含有至少1种药物单元和至少1种半衰期延长单元，所述药物单元和半衰期延长单元通过组装形成药物，优选的药物具有上述式I结构。

在本发明的另一个优选的实施方式中，本发明文库含有1种药物单元和至少种(例如2种、3种、4种)半衰期延长单元。

典型地，所述药物单元具有上述式II结构。

典型地，所述半衰期延长单元具有上述式III结构。

由于本发明的药物单元和半衰期延长单元具有特定的结构，因此不仅可以快速组装成药物，而且所形成的药物具有出乎意料的延长的半衰期(体内的稳定性显著增加)，可以长时间在体内存在并保持活性，而不会被很快降解。

例如，在癌症(或其它代谢疾病)治疗中，往往涉及多个靶点和多个通路，而且每个病人不仅病因不同，体质不同、年龄不同、而且在一个病人中还存在肿瘤的异质性或者疾病的不同亚型，药代动力学和代谢途径也往往不同，因此往往需要采用针对多靶点、半衰期不同的药物。随着个性化治疗或精准治疗技术的发展，本领域迫切需要开发能够快速制备，成本低、靶向性好、稳定性好、半衰期可控(调节)的蛋白质药物(如多特异性抗体)。本发明的文库满足了这类需求。

应理解，虽然本发明药物文库含有或主要含有或全部含有本发明上述药物单元和半衰期延长单元，但是该药物文库还含有其他的治疗剂，尤其是其他的蛋白药物，代表性的例子包括(但并不限于)：抗体、化合物、融合蛋白。例如，本发明文库可额外地含有一种或多种具有治疗作用的常规抗体、或者具有延长药物半衰期的常规药物、或者常规代谢调节剂。

应理解，本发明文库中的半衰期延长单元的数量没有限制，可以为≥2的任一正整数n。例如，n为3-100的任一正整数；n为3-50；更佳地n为5-20；最佳地n为5-8。

此外，在本发明中，半衰期延长单元中的抗体元件没有特别限制，代表性的例子(选自下组)：单链抗体、纳米抗体、Fab、单克隆抗体、或其组合。

对于本发明文库而言，可以使用各种来源的蛋白、多肽来制备药物单元；可以使用各种来源的抗体来制备半衰期延长单元。本发明药物文库的一个突出特点是，可使用通过原核系统(如大肠杆菌)或真核系统(如酵母、CHO细胞)表达的抗体片段，从而极大地降低了生产成本。

典型地，在使用时，可根据需要(如某一个体的病情和诊断结果、治疗待治疗对象的疾病所需的蛋白药物信息，包括蛋白药物的种类、给药方式、药代动力学)，选择相应的药物单元和半衰期延长单元的(包括种类和个数)，简便地通过核酸互补框架就完成药物的组装。例如，在应用时，根据病人疾病的靶点情况，代谢情况、相应确定半衰期延长单元的数量或比例(例如2种、3种、4种、或4种以上)，然后进行组装。

在制备药物时，从文库中选出相应的可相互直接或间接配对偶联的药物单元和半衰期延长单元，并按所需的抗体比例混合后，就可在1分钟内完成组装过程。

在本发明文库中，药物单元的核酸元件和半衰期延长单元的核酸元件可通过序列设计成为二聚体、三聚体、四聚体等高聚体框架，由此完成通过传统药物半衰期设计和制备技术无法轻易达到的一个药物分子携带3个甚至是4个半衰期延长单元的多聚体的制备。

一旦组装形成多聚体蛋白药物，就可根据治疗目的，用于相应的个体。

左旋核酸(L-核酸)

左旋核酸是指相对自然界存在的右旋核酸(D-核酸)而言，成镜像存在，可分为左旋DNA(L-DNA)和左旋RNA(L-RNA)。左旋(手性中心)主要存在于核酸的脱氧核糖或核糖部分，呈镜像翻转。因此，左旋核酸无法被血浆中无处不在的核酸酶(如核酸外切酶、核酸内切酶)所降解。

本发明半衰期延长的药物

本发明的半衰期延长的药物是指药物单元和n种半衰期延长单元通过核酸互补形成碱基互补的配对结构(例如双链配对结构)而形成的半衰期延长的药物，其中n为≥1的正整数；其中，所述的药物单元包括药物元件部分以及与所述药物元件部分相连的第一核酸元件部分，所述的半衰期延长单元包括半衰期延长元件部分以及与所述的半衰期延长元件部分相连的第二核酸元件部分，并且一个所述药物单元的所述的核酸元件部分与至少一个半衰期延长单元的核酸元件部分通过互补形成碱基互补的配对结构(例如双链配对结构)。

在另一优选例中，所述的核酸元件部分是耐核酸酶降解的。

在另一优选例中，所述的核酸元件部分选自下组：左旋核酸、肽核酸、锁核酸、硫代修饰核酸、2’-氟修饰核酸、5-羟甲基胞嘧啶核酸、或其组合。

本发明的药物可通过例如式II所示的药物单元和式III所示的半衰期延长单元组装而形成。

典型地，多聚体的药物是指由一个药物单元与多个半衰期延长单元组装而成，例如二、三、四、五或六聚体。

在一个优选例中，本发明的药物为采用左旋核酸连接。本发明的研究表明，核酸是一种可以快速进行特异性配对的双链分子，因此，若是将半衰期延长元件部分(如HSA、单链抗体、纳米抗体、Fab等)与核酸单链偶联，将药物元件部分与核酸单链偶联，则可通过设计核酸序列，让两个及以上的核酸单链快速配对，从而引导药物单元与一个或多个半衰期延长单元快速组装，完成半衰期延长的药物的制备。

在本发明中，为了实现延长药物半衰期的效果，需要采用特定结构的药物单元与半衰期延长单元。优选例中，通过使用左旋核酸(如L-DNA、L-RNA等)替代右旋核酸(如D-DNA、D-RNA)的方式，可以显著提高延长药物半衰期。一个原因是L-核酸无法被人体内存在的外切核酸酶、内切核酸酶等降解，所以由L-核酸(左旋核酸)自组装所介导的药物在体内将极为稳定。

制备方法

1.L-核酸链框架的设计与制备

根据本发明，L-核酸链框架由两条及以上的L-核酸单链通过碱基配对形成。每条L-核酸单链的5'或3'端均活化成可供后续修饰的基团(如NH₂等)，然后用连接物(如SMCC、SM(PEG)、SPDP等)的一端与L-核酸单链上的活化基团偶联。带连接物的L-核酸可组装成所需的L-核酸链框架。在确定带连接物的L-核酸可以成功自组装成框架后，则可将带连接物的L-核酸单链分别偶联抗体进行后续的组装。

本发明L-核酸框架基本上可通过如下步骤制备。

1.1 设计可快速自组装的L-核酸单链

确定所需的半衰期提升模块数目N(例如三个半衰期提升模块)；根据半衰期提升模块数目N确定所需的L-核酸单链数目M(M>＝N+1)；设计相应数目的L-核酸单链序列，通过增减碱基配对数目调节目的核酸框架稳定性，减少核酸链间非特异性配对的可能性。

根据本发明一个优选的实施方式，为设计一个四聚体L-核酸框架(M＝4)，设计四条可按照一定规则配对的L-核酸(如图2所示)。其中，任意一条L-核酸单链可与另两条L-核酸单链进行特异性互补配对，而不与第四条配对。且特异性互补配对的吉布斯能变化量△G的绝对值要远大于非特异性配对，例如该优选的实施方式中，每条手臂的特异性互补配对的吉布斯能变化量△G的绝对值约为26千卡每摩尔(kcal/mole)，而非特异性配对则均小于7千卡每摩尔(kcal/mole)，意味着四聚体的组装方式要比非特异性的两两配对更容易发生，四聚体的形式在反应体系中最为稳定。四聚体L-核酸框架可连接1-3个半衰期提升因子。

1.2 L-DNA或L-RNA的活化

L-核酸的活化包括其5'端或3'端的活性基团修饰和后续的连接物偶联。活性基团修饰可由核酸合成公司订制完成；连接物一般拥有双功能基团，即一端可偶联核酸的活性基团，另一端可与抗体上的特异性位点(如SH)连接。

根据本发明一个优选的实施方式，组成框架的所有L-核酸在5'端添加NH₂修饰，然后利用连接物即双特异官能团交联试剂SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯钠盐)通过酰胺键偶联核酸上的NH₂。此时连接物的另外一端马来酰亚胺基团为游离状态，可用于后续偶联抗体上的巯基(SH)，至此完成L-核酸的活化。

2.抗体-L-核酸复合物的制备方法

首先L-核酸的5'或3'端用NH₂修饰，然后根据连接物的不同可为以下几种主要制备方法，其中连接物的一端官能团为NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)或Sulfo-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐)，用于快速偶联L-核酸一端的NH₂基团。包含双特异官能团的连接物均首先与L-核酸的NH₂反应，其次在还原抗体上的巯基后，另一端的基团再与巯基反应形成稳定的化学键。

2.1 马来酰亚胺(Maleimide)。连接物用于偶联抗体上巯基的基团为马来酰亚胺。马来酰亚胺可快速与抗体上游离的巯基反应形成硫醚键。常见的连接物有SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)、SM(PEG)(聚乙二醇修饰的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)等。

2.2 卤乙酰基(Haloacetyl)。连接物用于偶联抗体上巯基的基团为卤乙酰基，比如碘、溴乙酰基。卤素离子可与抗体上的巯基通过亲核作用替换形成稳定的硫醚键。常见的连接物有SBAP(N-马来酰亚胺甲基[4-溴乙酰基]氨基苯甲酸酯),SIAB(N-马来酰亚胺甲基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯)等。

2.3 硫代吡啶(Pyridyldithiol)。连接物用于偶联抗体上巯基的基团为硫代吡啶。硫代吡啶可与游离的巯基反应形成二硫键。常见的连接物有SPDP(3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)等。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、呼吸道、瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于治疗(例如抗肿瘤治疗)，因而可用于延长药物的半衰期，此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的半衰期延长模块，在一分钟内即可利用左旋核酸链介导完成与目标蛋白的组装；

(2)本发明的半衰期提升模块中的半衰期延长因子改造空间广泛，可选择HSA或者任意形式的HSA结合蛋白、小分子以及多肽(如抗HSA单链抗体、纳米抗体、Fab)；

(3)本发明的半衰期提升模块，可单独保存备用，然后通过简单的核酸配对组装偶联各种蛋白质或多肽药物；

(4)本发明的半衰期延长模块，可根据需要灵活制备含有不同数目半衰期延长模块的长半衰期药物，以便灵活调节药代动力学性质；

(5)本发明的半衰期延长模块，其中的半衰期延长因子均为低成本、易制备的蛋白或者多肽，例如可在大肠杆菌内表达的抗HSA纳米抗体、在人血液中浓度高达50g/L的HSA蛋白等，因此基于该模块制备的长效药物具有制备简单、通用性强、成本低廉等优点；

(6)本发明提供一种灵活的将药物连接FcRn靶向因子的制备方法、及其通过FcRn介导的药物回收途径延长药物在动物体内半衰期的应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

实施例1四聚体DNA结构框架的设计

设计四条可按照四边形形状配对的L-核酸(如图2所示)。其中，任意一条L-核酸单链可与另两条L-核酸单链进行特异性互补配对，而不与第四条配对。且特异性互补配对的吉布斯能变化量ΔG的绝对值要远大于非特异性配对，每条手臂的特异性互补配对的吉布斯能变化量ΔG的绝对值大于25千卡每摩尔(kcal/mole)，而非特异性配对则均小于7千卡每摩尔(kcal/mole)，意味着四聚体的组装方式要比非特异性的两两配对更容易发生，四聚体的形式在反应体系中最为稳定。

按照以上原则设计的四条L-DNA单链序列如下(从5'到3')：

链1(L-DNA1)：SEQ ID NO.1

5'-AAGAGGACGCAATCCTGAGCACGAGGTCT-3'

链2(L-DNA2)：SEQ ID NO.2

5'-AACTGCTGCCATAGTGGATTGCGTCCTCT-3'

链3(L-DNA3)：SEQ ID NO.3

5'-AATGAGTGCATTCGGACTATGGCAGCAGT-3'

链4(L-DNA4)：SEQ ID NO.4

5'-AAGACCTCGTGCTCACCGAATGCACTCAT-3'

5'端有NH₂基团修饰，用于偶联SMCC的NHS。任意一条链的碱基序列分别与另外两条链互补配对，每一部分的配对吉布斯能变化量△G约为-34千卡每摩尔(kcal/mole)。

实施例2四聚体DNA框架的合成与验证

由生物技术服务公司(如Chemgene Inc.、Biosyn Inc.等公司)合成5'端NH₂修饰的L-DNA单链，四条单链的序列如实施例1中所示。

用磷酸缓冲液(50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，pH 7.0)将L-DNA单链溶解，配制成终浓度为200uM的母液。用二甲亚砜(DMSO)溶解SMCC粉末，新鲜配制250mM的SMCC母液。在L-DNA单链母液中加入10～50倍摩尔量的SMCC母液，迅速混合后在室温下反应30min～2h。反应完成后加入反应液10％体积的1MTris-HCl(pH 7.0),混合后室温孵育20分钟，用于终止过量的SMCC继续反应。孵育结束后，加入反应液2倍体积的100％无水乙醇，混合均匀后在-20度冰箱中放置25分钟，充分沉淀L-DNA。离心(12000rpm，10min)取沉淀，用1mL 70％乙醇洗涤，12000rpm离心1min去除上清，重复洗涤5次，充分去除过量的SMCC。剩下的白色沉淀在空气中自然干燥5～10min，然后用磷酸缓冲液重悬、溶解，即得到SMCC-L-DNA复合物(即SMCC-L-DNA单链)。

测定各条SMCC-L-DNA单链的浓度。取适量四条待反应的SMCC-L-DNA单链在40度预热5min，然后在40度条件下混合等摩尔量的四条SMCC-L-DNA单链，孵育1min。取0.25ul的SMCC-L-DNA单链和反应产物用3％琼脂糖凝胶电泳分析。

结果如图3所示，SMCC-L-DNA单链的大小约为25bp左右，而混合后形成的主条带则在100bp左右，表明四条不同的SMCC-L-DNA单链形成了四聚体框架。

实施例3半衰期延长因子-抗HSA纳米抗体突变体的制备

抗HSA纳米抗体的羧基末端引入半胱氨酸突变。纳米抗体中存在二硫键，但由于其分子量较小且结构异常稳定，因此可以在大肠杆菌细胞质中进行表达。

将抗HSA的纳米抗体的基因序列优化为大肠杆菌偏爱的密码子，然后亚克隆至pET21b质粒中。

抗HSA的纳米抗体氨基酸序列为SEQ ID NO.5。为便于纯化，纳米抗体的N端均添加双Strep标签。

SEQ ID NO.5，抗HSA纳米抗体突变体氨基酸序列：

SAWSHPQFEKGGGSGGGSGGSAWSHPQFEKENLYFQSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSGSC

取1ul构建好的表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化后的BL21(DE3)单菌落至LB培养基中(含100ug/mL氨苄青霉素)，37度培养至OD600＝0.7，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达，37度继续培养3到4小时。离心收集表达完成后的菌体，重悬于磷酸缓冲液(50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，pH 7.0)，蛋白酶抑制剂混合物(cocktail)(Sigma)(溶液中加入一片SIGMAFAST^TM蛋白酶抑制剂片剂充分溶解)，利用超声破碎。加入DNaseI水解酶在冰上孵育1小时。孵育结束后，菌液在17000rpm离心20分钟收集上清。用Strep亲和柱纯化上清中的纳米抗体，上清以0.25ml/min速度过柱后，用大量Tris缓冲液(50mMTris-HCl，150mMNaCl，pH 7.4)以1ml/min的流速洗涤柱子直至杂蛋白不再流出(根据AKTA蛋白层析系统上的紫外吸收)，用Strep-Tactin洗脱缓冲液(50mMTris-HCl，150mM NaCl，2.5mMDethiobiotinpH 7.4)梯度洗脱结合在柱子上的纳米抗体。

结果：获得了高纯度的抗HSA纳米抗体突变体。

实施例4纳米抗体-L-DNA的偶联与纯化

将纯化后单链抗体用10-50倍摩尔比过量的还原剂(如TCEP、DTT、巯基乙醇等)在室温下孵育30min。孵育结束后用PD-10脱盐柱快速除去反应体系中的还原剂，同时将缓冲液置换为磷酸缓冲液(50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，pH7.0)。测定单链抗体的浓度后，马上加入1～4倍摩尔比过量的SMCC-L-DNA单链(实施例2中制备)，混合均匀后在室温下反应1h。

利用Strep亲和柱除去未反应以及过量的SMCC-L-DNA单链，收集纳米抗体以及纳米抗体-L-DNA混合物。将其缓冲液置换为阴离子交换柱的上样缓冲液。

由于DNA等核酸带负电，利用阴离子交换柱(HiTrap Q HP柱)进一步分离纯化纳米抗体-L-DNA，除去未反应的纳米抗体。分离过程通过梯度洗脱实现，上样缓冲液为50mMTris-HCl，pH 8.5，洗脱缓冲液为50mM Tris-HCl，1M NaClpH 8.5，0-100％的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，未反应的纳米抗体、纳米抗体-L-DNA先后出峰。收集纳米抗体-L-DNA，浓缩后用PD-10脱盐柱将缓冲液置换为50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，pH 7.4。

实施例5半衰期提升模块与目标蛋白药物的自组装

下面以用于治疗A型血友病的长效八因子(FVIII)药物设计为例，描述半衰期提升模块与目标蛋白药物自组装的过程。本实施例以八因子作为目标蛋白药物，所述八因子可以是人血中提取的血源性八因子，也可以是以基因工程方式获得的重组八因子。

将八因子与10-50倍摩尔比过量的还原剂(如TCEP、DTT、巯基乙醇等)混合后在室温下孵育30min。孵育结束后用PD-10脱盐柱快速除去反应体系中的还原剂，同时将缓冲液置换为磷酸缓冲液(50mM NaH2PO₄，150mM NaCl，pH 7.0)。测定八因子的浓度后，马上加入1～4倍摩尔比过量的SMCC-L-DNA单链(实施例2中制备)，混合均匀后在室温下反应1h。反应后的产物即为药物单元：八因子-L-DNA。

分别测定抗HSA纳米抗体-L-DNA以及八因子-L-DNA的浓度。取适量上述组分在40度预热5min，然后在40度条件下按1:1摩尔比将HSA纳米抗体-L-DNA与八因子-L-DNA混合，孵育1min。至此，包含半衰期提升模块与八因子活性部分的FVIII-HSAnb就已组装完成，即长效八因子。

采用6-8周龄的FVIII缺陷型小鼠验证FVIII-HSAnb在体内的半衰期延长效果。将8只小鼠随机分为实验组和对照组，分别以5IU/只的给药量静脉注射FVIII-HSAnb和FVIII。取血时间为给药前一天，给药后5min，30h,48h,60h，72h和96h。取血后迅速分离血浆，冻存于-80度冰箱。获得所有血浆样品后，采用APTT方法检测FVIII活性。

根据计算，FVIII和FVIII-HSAnb的半衰期分别为5.6h和22.7h(如图4所示)。

因此，运用本发明设计的FVIII-HSAnb相较于普通FVIII能够将半衰期延长4倍左右。

讨论

IgG型单克隆抗体(单抗)是免疫球蛋白类抗体中半衰期最长的，可长达21天。因此，IgG型抗体是目前治疗性抗体的主要类型。

IgG型单抗的长半衰期和高血清浓度通过与新生儿受体(FcRn)结合并进入其介导的代谢调控实现。IgG的Fc部分可以与FcRn进行特异性的pH依赖结合。当IgG型单抗被血液中的造血细胞或血管内皮细胞通过胞饮作用内吞后，可进入内含体(endosome)并与其中的FcRn结合，从而进入到回收途径，避免进入到降解途径被溶酶体(lysosome)所降解，从而循环到细胞表面，并在中性生理条件下(pH 7.4)与FcRn解离，释放到血液中。

白蛋白是另一种可以通过与FcRn结合延长半衰期的蛋白质，其半衰期可长达19天。人血清白蛋白可分为I-IV四个结构域，其中结构域III是与FcRn结合的部分，结构域I则含有一个游离的半胱氨酸残基(Cysteine 34，Cys 34)。

对于具有长半衰期需求的蛋白或多肽类药物，比如细胞因子药物、凝血因子等，Fc与HSA等FcRn结合蛋白是更好的选择。

Fc或者HSA融合蛋白延长半衰期的方法会在目标蛋白或多肽与Fc/HSA融合部位产生新的表位。此外，Fc只能融合于C端，而HSA只能融合在目标蛋白或多肽的N端或C端。此外，该法不适用于天然蛋白或多肽。

本发明首次开发了一种基于化学偶联法，利用化学分子或连接物，将蛋白或多肽与FcRn结合模块(HSA或HSA结合模块等)特异性地实现异源偶联，从而延长蛋白药物的半衰期，提升它们的药代动力学性质。

与Fc或者HSA融合蛋白相比，在本发明方法是一种更灵活的方案，可对目标蛋白或多肽的各类基团(如SH、NH₂、非天然氨基酸上的活性基团等)进行定点或非定点修饰，也可以应用于天然蛋白或多肽的修饰。

此外，本发明方法不会或基本上不会引入新的表位。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 安升（上海）医药科技有限公司

<120> 半衰期延长的药物及其文库、以及制备方法和应用

<130> P2019-1201

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

aagaggacgc aatcctgagc acgaggtct 29

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

aactgctgcc atagtggatt gcgtcctct 29

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

aatgagtgca ttcggactat ggcagcagt 29

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

aagacctcgt gctcaccgaa tgcactcat 29

<210> 5

<211> 155

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Asn

20 25 30

Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

35 40 45

Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

50 55 60

Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

65 70 75 80

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu

85 90 95

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

100 105 110

Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

115 120 125

Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln

130 135 140

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Cys

145 150 155

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

Arg Leu Ile Glu Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu

1 5 10 15

Asp Asp

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp

1 5 10

<210> 8

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

guggacuaua ccgcguaaug cugccuccac 30