一株鸡新型圆圈病毒3型毒株及基于该病毒的检测体系
阅读说明：本技术 一株鸡新型圆圈病毒3型毒株及基于该病毒的检测体系 (Novel chicken circovirus type 3 strain and detection system based on same ) 是由 成子强 张世成 严天行 周德方 张利 郝小静 于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及分子生物学、免疫学和病毒学领域,具体提供了一株鸡新型圆圈病毒3型(GyV3)毒株及基于该病毒的检测体系,该病毒毒株生物保藏编号为CCTCC NO:V202061,其VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,同时发明人还提供了该病毒的ELISA抗体检测方法和鸡新型GyV3的实时荧光定量PCR检测方法组成检测体系,二者结合可实现对该GyV3病毒安全、特异、快速、灵敏、简单的快速检测,从而为鸡新型环状病毒GyV3的流行病学、早期诊断提供参考依据,具有重要的意义,填补了国内外相关领域空白。(The invention relates to the fields of molecular biology, immunology and virology, and particularly provides a novel chicken circovirus type 3 (GyV3) strain and a detection system based on the virus, wherein the biological preservation number of the virus strain is CCTCC NO: V202061, the nucleotide sequence of a VP1 gene is shown as SEQ ID NO.1, and the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO.2, and meanwhile, the invention also provides a detection system consisting of an ELISA antibody detection method of the virus and a novel chicken GyV3 real-time fluorescent quantitative PCR detection method, and the combination of the two can realize safe, specific, rapid, sensitive and simple rapid detection of the GyV3 virus, thereby providing a reference basis for epidemiology and early diagnosis of the novel chicken circovirus GyV3, having important significance and filling up the blank of related fields at home and abroad.)
技术领域
本发明涉及分子生物学、免疫学和病毒学领域,涉及一株鸡新型圆圈病毒3型(GyV3) 毒株及其基于该病毒的检测体系。
背景技术
圆圈病毒3型(Gyrovirus 3,GyV3)是继鸡传染性贫血病毒(Chicken infectiousanaemia virus,CAV或CIAV)之后的第三个圆圈病毒属成员，分类于编码复制相关蛋白的单链环状DNA病毒门(Circular replication-associated protein-encoding single-stranded DNA viruses， CRESS DNA viruses)的指环病毒科(Anelloviridae)。GyV3最早在2012年在智利儿童未知病因急性肠胃炎腹泻粪便中通过宏病毒组学鉴定发现，之后在人类不同年龄腹泻粪便、雪貂腹泻粪便和市场鸡肉中被发现，是近年引起传染性腺胃炎病原。而传染性腺胃炎却给养禽业带来了巨大的危害，其可发生于不同品种的蛋鸡和肉鸡且流行广泛，发病率一般为7％～27％，死亡率一般为30％～50％。临床以消瘦、腺胃肿大，粪便过料为主要症状。目前，该病毒是第二个报道的单链环状DNA病毒，首个报道的单链环状DNA病毒是鸡传染性贫血病毒。 GyV3病毒可引起禽免疫抑制、贫血以及腺胃肿大等症状，且在之后的致病性实验中明确其可感染小鼠，实现两群体间的水平传播，其跨物种传播现象提示潜在的公共卫生意义，而GyV3 对人的危害亟待研究。鉴于此病毒引起的危害，亟需建立快速敏感的检测体系用于早期诊断，准确判定机体的感染状态，及时淘汰发病鸡，对未感染动物进行有效保护，为养禽业和公共卫生事业健康发展提供保障。
实时荧光定量PCR方法(Real time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质为指示剂检测每次循环聚合酶链式反应(PCR)产物的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。然而在PCR扩增的指数时期，待测样品中模板的Ct值与该模板的起始拷贝数存在线性关系，因此该方法可快速灵敏检测待测样品病毒起始拷贝数，从而对待测样品进行快速核酸检测。
间接酶联免疫吸附试验(indirect Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是一种抗原抗体结合反应，以已知抗原检测未知抗体的一种检测方法。通过优化好的包被抗原稀释倍数，从而对待检抗体进行定性和半定量的一种检测方法。待检抗体再和抗原反应过程中，酶标抗抗体与待检抗体相结合，通过酶标仪读数从而判定机体抗体水平。由于GyV3在临床中无有效疫苗，因此该方法测得的抗体水平为机体真实的抗体水平。
综上所述，针对新发现的GyV3病毒如何提供更为有效的检测方法，从而对鸡群感染状态进行全面系统的评价，及时淘汰发病鸡，保护未感染鸡群避免造成更大的损失、保障养禽业健康发展成为本领域亟待解决的问题
发明内容
本发明的发明人针对现有技术存在的空白之处，提供了一株鸡新型圆圈病毒3型(GyV3) 及其基于该病毒的检测体系，该病毒毒株生物保藏编号为CCTCC NO:V202061，其VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，同时发明人还提供了该病毒的ELISA抗体检测方法和鸡新型GyV3的荧光定量PCR检测方法组成检测体系，二者结合可实现对该GyV3病毒安全、特异、快速、灵敏、简便的快速检测，从而为鸡新型GyV3的流行病学调查、早期诊断提供参考依据，具有重要的临床诊断价值和公共卫生意义。
本发明的具体技术方案是：
发明人首先提供了一株新型GyV3病毒毒株，命名为圆圈病毒3型SDAU-2株(Gyrovirus 3,SDAU-2)，发明人对其进行了生物保藏，生物保藏编号为CCTCC NO:V202061；
发明人首先提供了一种新型GyV3 VP1蛋白，该蛋白是由新型GyV3 VP1基因与原核表达载体pET32a通过酶切连接而成，转化大肠杆菌感受态细胞BL21制备而成；其中新型鸡圆圈病毒3型VP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该VP1融合蛋白为VP190-463蛋白。
GyV3病毒属于单股环状DNA病毒，由三个开放阅读框构成，分别为VP1(1392bp)，VP2(720bp)和VP3(378bp)，本发明基于VP1蛋白在病毒侵染和抗原表位识别等方面发挥十分关键的作用，选取GyV3的衣壳蛋白VP1为目标蛋白，为实现其在大肠杆菌中大量表达，对其氨基酸序列进行分析，由于第65-82位氨基酸为跨膜区，无信号肽序列，亲水性较好，对整体蛋白表达影响较大，因此选择第90至463位共374个氨基酸作为抗原区表达，以制备 VP1融合蛋白。
进一步，发明人提供了针对上述病毒的检测方法，具体如下：
将上述获得的新型GyV3 VP1蛋白菌株进行诱导表达、菌体破碎、蛋白纯化、蛋白复性等，即可获得具有抗原表位的新型GyV3 VP1蛋白；之后将上述新型GyV3 VP1蛋白与抗原包被液混合即为ELISA包被所用抗原；
该病毒的ELISA抗体检测方法，其中所用蛋白为上述VP1蛋白，其详细步骤及所用试剂如下所示：
1)抗原包被：将VP1蛋白用抗原包被液稀释至合适的浓度，每孔100μL，加入96孔酶标板中，4℃冰箱孵育过夜，过夜结束后弃掉孔内液体；
2)封闭：用PBST缓冲液洗涤3-5次，每孔加入200μL溶于PBST缓冲液5％的脱脂乳，37℃孵育1h，弃掉孔内液体；
3)一抗孵育：PBST缓冲液洗涤3-5次，每孔加入稀释后的待检血清100μL，37℃孵育1h，弃掉孔内液体；
4)二抗孵育：PBST缓冲液洗涤3-5次，每孔加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡100μL，37℃孵育1h，弃掉孔内液体；
5)显色：PBST缓冲液洗涤3-5次，避光，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光孵育10min；
6)加终止液：每孔加入50μL 2M硫酸液，终止显色；
7)读数：于5min内在酶标仪中检测OD450nm值。
上述ELISA抗体检测方法与现有技术最大的区别就是所采用的蛋白是鸡新型GyV3衣壳蛋白VP1，填补了本领域的空白，而采用的一抗是使用的经过验证的GyV3阳性血清；除此之外，本发明所采用的试剂均为市场上廉价易得的产品，且各个检测参数条件均是比较后最优结果，检测时间进一步缩短，检测结果准确可靠。
结合上述ELISA抗体检测方法，发明人还提供了对应的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)实时荧光定量PCR反应：提取待测物的基因组DNA，利用特异性引物进行PCR 扩增，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，
相应引物序列如下：
上游引物GyV3 Forward：5’-ACCGGGACTTGGACACC-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
下游引物GyV3 Reverse：5’-AGCCAGGAAGCGATACG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
所述PCR扩增的反应体系如下：反应液每管20μL，含有Green Premix ProTaq HS qPCR Mix 10μL，10μmol/μL GyV3 forward、GyV3 reverse各0.4μL，RNase FreeddH2O 8.2μL，待检测的样品DNA模板1μL；
所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；
扩增结束后，做出溶解曲线，获得扩增动力学曲线；以标准品起始拷贝数的常用对数(lgC) 为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线)Y＝-2.8546X+36.82(Y：Ct值，X：模板起始拷贝数)，回归系数R2＝0.99，获得其敏感性试验数据；以T-GyV3作为阳性标准质粒；设空白作为阴性对照；
(2)结果判定：
质控标准：阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.86，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；
结果描述及判定：无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36.86，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。
上述提供的荧光定量方法是优化条件后的更快速、准确、灵敏的方法，采用Green Premix Pro Taq HS qPCR Mix，可快速对96份样品作出准确判定。
综上所述，本发明在获得一株鸡新型GyV3病毒毒株的基础上，进一步提供了抗体检测的ELISA检测方法和荧光定量PCR检测方法，具体应用时步骤如下：
采集鸡群泄殖腔棉拭子和血清，使用荧光定量PCR检测，可以准确判定鸡群感染GyV3 以及病毒排毒情况；采集鸡群血清可以准确判定GyV3体内抗体情况；
将两者结果结合便可对鸡群抗原抗体动态情况作出判定，从而准确判定鸡群的感染状态。本发明的发明人首次将两种方法联合应用，组合成一个检测体系，不仅可以对圆圈病毒 3型感染鸡群的状态、排毒规律和流行病学做出快速准确的判定，而且可以对鸡新型GyV3 早期诊断和防控提供参考依据，具有重要的临床诊断意义，填补了国内外空白，最大限度减少养禽业损失，保障养禽业健康发展。
保藏信息
保藏时间：2020年10月1日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心
保藏编号：CCTCC NO:V202061
保藏单位地址：中国武汉武汉大学
分类命名:圆圈病毒3型SDAU－2株(Gyrovirus 3SDAU－2)
附图说明
图1为实施例1中新型圆圈病毒3型透射电镜图，
图2为实施例2中新型圆圈病毒3型VP1基因电泳图：
图中M为DL2000 Marker，1-3泳道为新型圆圈病毒3型VP1基因电泳图；
图3为实施例2中PET32a-VP1酶切鉴定电泳图：
图中M为DL2000 Marker，1泳道为新型圆圈病毒3型VP1基因和空载体电泳图，图中在1125bp(目的片段)和2700bp(空载)处有明显的两条带；
图4为实施例2中新型圆圈病毒3型VP1蛋白SDS-PAGE检测结果图：
图中M为170kDa Marker，1泳道为未纯化的新型圆圈病毒3型VP1蛋白；
图5为实施例2中纯化的VP1蛋白SDS-PAGE验证图：
图中M为170kDa Marker，图5A为抗His标签抗体验证VP1蛋白，其中1泳道为未纯化原核表达VP1，2泳道为纯化蛋白过柱流出液，3泳道为纯化蛋白洗涤液，4泳道为纯化的 VP1蛋白；
图5B为抗VP1多抗验证VP1复性效果，其中1泳道为未纯化原核表达VP1，2泳道为纯化的VP1蛋白；
图6为实施例2中VP1蛋白Western blot鉴定图：
图中M为170kDa Marker，图6A:1泳道为未纯化新型圆圈病毒3型VP1蛋白，2泳道为纯化蛋白过柱流出液，3泳道为纯化蛋白洗涤液，4泳道为纯化的VP1蛋白；
图6B:1泳道为未纯化的新型圆圈病毒3型VP1；2泳道为复性后的新型圆圈病毒3型VP1蛋白；
图7为实施例3中ELISA临界值的确定；
图8为实施例3中ELISA敏感性摸索；
图9为实施例3中ELISA特异性摸索；
图10为实施例3中流行病学调查图；
图11为实施例4中荧光定量PCR的溶解曲线对比图、扩增曲线和溶解曲线组合图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例用于解释本发明，而非对本发明的限定。本实施例中除特殊说明外，其他均采用现有技术完成。
实施例1 VP190-463原核表达载体的构建
1.圆圈病毒3型的鉴定
将圆圈病毒3型回归动物鸡的腺胃组织进行了组织研磨处理，腺胃组织研磨液超声破碎后进行了差速离心，收集上清后采用蔗糖密度梯度离心的方法纯化病毒。并结合磷酸钨负染的方法，通过电子透射电镜观察病毒粒子的大小和形态。通过观察发现，该病毒粒子呈圆形或二十面体对称结构，无囊膜，病毒粒子直径大小约为26-28nm(如图1所示)。
2.目的片段的克隆
发明人设计引物如下:
F–CGAGCTCGACACAACTAAAGGCAA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
R-TTGCGGCCGCCTAGTCTGCGGGGACGC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
称取7mg确定新型GyV3感染鸡的的腺胃组织，提取组织DNA，按如上引物进行目的条带的扩增，
反应体系为：水10.5μL、dNTP Mixture 12.5μL、上、下游引物各0.5μL、DNA模板1μL；
反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35个循环； 72℃再延伸10min；得到的PCR产物进行凝胶电泳,得到单一的目的条带，大小为1125bp(如图2)。
3.新型GyV3-VP1蛋白原核表达载体的构建，包括以下步骤：
3.1根据新型圆圈病毒3型毒株全基因组获取GyV3-VP1基因，通过跨膜区分析、信号肽分析、疏水性分析和抗原性分析，选择第90至463位氨基酸进行表达，并选用SacⅠ和NotⅠ分别作为上下游酶切位点，进行全基因合成。
3.2将合成的GyV3 VP11125基因用SacⅠ和NotⅠ双酶切后连入pMD 18-T Vector载体相应的酶切位点，转化至感受态细胞DH5α中，提取质粒，将提取的质粒和原核表达载体pET32a (+)使用SacⅠ和NotⅠ酶进行双酶切，将上一步获取的双酶切片段VP11125和pET32a(+) 连接后转化至感受态细胞BL21(DE3)中，提取质粒送华大基因测序，测序结果与GyV3VP11125基因比对结果显示完全匹配，重组质粒构建成功。
上述构建的原核表达载体，转化至感受态细胞BL21中，转化步骤如下：
1)取感受态细胞BL21 100μL冰浴中解冻，加入连接后的重组质粒10μL，轻轻混匀；
冰浴中反应30min；42℃水浴90s(时间严格控制)后迅速转至冰浴中2min，期间严禁晃动；
2)加入400μL LB培养基(不含氨苄)于恒温摇床中37℃、200rpm/min培养1h；取200μL 涂于含有AMP的LB固体培养板中，37℃恒温过夜培养；
3)挑取单个菌落置于10mL含有浓度为100ng/L AMP的LB液体培养基的试管中37℃、 200rpm/min培养6h；
4)取200μL菌液送华大基因测序，测序结果表明重组质粒构建成功。
4.重组质粒的体外表达及鉴定
将测序正确的菌液活化后，摇菌，当菌液在对数生长期时，加入1.0mmol/L的IPTG诱导表达，收取诱导后4h的1mL菌液，超声破碎，对包涵体进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果显示重组蛋白在包涵体中大量表达，证明构建的重组质粒可正确表达圆圈病毒3型VP1 蛋白。
体外表达具体步骤为：
向管中加入1000μL含氨苄的LB培养基，37℃摇床摇动2.5h后6000rpm,10min离心，弃 800μL,余200μL涂板置于37℃恒温培养箱中过夜培养；
挑取单菌落，摇菌8h送华大测序，测得VP190-463，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；测序正确的质粒进行双酶切鉴定。泳道1为酶切后，可见pET-32a(+)空载条带和1125bp的目的条带VP190-463，表示重组质粒的构建成功(图3 所示)，按如上方法将重组质粒转化入BL21感受态细胞中进行表达。
实施例2 VP1的表达、纯化与复性
1、诱导表达
挑取转化入新型质粒pET-32a-VP190-463的BL21感受态细胞，37℃恒温培养箱中过夜培养。第二日将菌液按1：50比例接种于2L的锥形瓶中，于摇床中37℃培养OD 600nm约为0.6，取出10mL未诱导的菌液做对照，加入IPTG(终浓度1mmol/L)进行诱导表达，于摇床中继续培养5h后6000rpm，10min离心收集菌体。加入40mlPBS重悬菌体，重悬3次以去除残留的培养基及杂质，加入1％PMSF冰浴超声破碎，破碎5S，冷却5S，99×5个循环，12000rpm, 离心10min，收集包涵体沉淀弃上清。
2、VP1蛋白纯化与复性
1)用9倍体积的洗涤液I(500mmol/L Tris-Cl(PH＝8.0)，100mmol/L NaCl，100mmol/L EDTA)，重悬沉淀，静置15min后，12000rpm，15min弃上清。
2)用9倍体积的洗涤液II(洗涤液I中加入2M的尿素)重悬沉淀，静置15min后，12000rpm， 15min，弃上清。
3)用9倍体积的洗涤液III(洗涤液I中加入4M的尿素)重悬沉淀，静置5min后，12000rpm， 15min，弃上清。
4)向菌体沉淀中加入20mL LE Buffer(洗涤液I中加入8M的尿素)搅拌溶解(约7.5mL LE Buffer/mg包涵体)，4℃过夜，13400×g 4℃离心30min，去除沉淀，收集上清即为溶解的包涵体。
5)使用Ni-NTA亲和层析介质进行蛋白纯化，将未纯化的蛋白样品加入已使用平衡缓冲液平衡好的Ni-NTA树脂中，使样品缓慢流出，控制流速为0.5-1mL/min，重复或循环上样 3-4次；使用LE Buffer洗涤填料，重复3-5次；用2倍柱体积的洗涤液洗涤柱子上的杂蛋白；使用尽量少的洗脱液洗脱，收集的洗脱液即为纯化后的蛋白。结果如图4和5所示，可见纯化前杂带较多，纯化后仅出现一条目的条带，说明纯化效果良好。
6)上清置于透析袋中，依次置于含有尿素为6mol,4mol，2mol,1mol，0mol梯度溶液中，4℃过夜透析，使蛋白复性。
7)SDS-PAGE法检测纯化后的目的蛋白纯度。经过表达纯化后可以得到较为单一的目的蛋白，大小为57kD，即为目的蛋白VP190-463蛋白。
以抗His标签的抗体为一抗和多克隆抗体使用Western blot进行进一步鉴定，以鼠抗His 标签单克隆抗体(pET32a载体自带His标签)和兔抗VP1蛋白为一抗，经检测，在57kDa 处出现阳性信号，结果表明GyV3-VP1蛋白可以鼠抗His标签抗体与兔抗VP1蛋白多抗特异性结合(如图6所示)，说明复性效果良好，抗原决定簇暴露明显。用分光光度法测得的VP1 蛋白浓度为0.576mg/mL。
实施例3鸡新型圆圈病毒3型(GyV3)的ELISA抗体检测方法
ELISA抗体检测方法，其中所用蛋白为复性后的VP1蛋白(即所用ELISA抗原)，其具体步骤如下所示：
1)抗原包被：将VP1蛋白用抗原包被液稀释至合适的浓度，每孔100μL，加入96孔酶标板中，4℃冰箱孵育过夜，过夜结束后弃掉孔内液体；
2)封闭：用PBST缓冲液洗涤3-5次，每孔加入200μL溶于PBST缓冲液5％的脱脂乳，37℃孵育1h，弃掉孔内液体；
3)一抗孵育：PBST缓冲液洗涤3-5次，每孔加入稀释后的鸡GyV3阳性血清100μL，37℃孵育1h，弃掉孔内液体；
4)二抗孵育：PBST缓冲液洗涤3-5次，每孔加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡100μL，37℃孵育1h，弃掉孔内液体；
5)显色：PBST缓冲液洗涤3-5次，避光，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光孵育10min；
6)加终止液：每孔加入50μL 2M硫酸液，终止显色；
7)读数：于5min内在酶标仪中检测OD450nm值。
上述方法中，具体参数的摸索确定过程如下：
1.抗原抗体稀释倍数摸索
将复性后制备的抗原(VP1蛋白)与抗体分别倍比稀释，用碳酸盐缓冲液稀释抗原(根据蛋白浓度确定稀释范围)，包被ELISA板，每孔100μL，4℃冰箱孵育过夜，弃去包被液，用 300μL PBST缓冲液洗涤3次后用200μL溶于PBST缓冲液5％的脱脂乳37℃温育2h弃去，用300μL PBST缓冲液洗涤3次，PBST缓冲液稀释抗体(范围1:100-1:12800)对应的加入各孔内，每孔100μL，进行ELISA检测，37℃温箱孵育1.5h，孵育后用300μL PBST洗涤，洗涤3次，洗涤完成后每孔加100μL PBST稀释后的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡，37℃温箱孵育1h，孵育后用300μL PBST洗涤，洗涤3次，每孔加入100μL TMB底物显色液，于 37℃温箱避光显色30min，每孔加50μL 2mol/L终止液终止反应，5min内酶联检测仪上读出 OD450nm值，计算P/N值，根据P/N值最大确定抗原和抗体最佳稀释倍数。结果显示：抗体最佳稀释倍数为1:640，抗原最佳包被浓度为0.89μg/mL(如表1所示)。
表1.最佳抗原抗体稀释倍数的摸索
2.最佳包被液的选择
分别用以下六种溶液作为包被液，将抗原稀释到最佳浓度进行检测CBS:0.1mol/LPH9.2 碳酸盐缓冲溶液；TBST:20mmol/L pH8.4 Tris-Hcl；PBS:0.01mol/L pH7.2-7.4磷酸盐缓冲液； PBST:pH7.4含0.05％Tween 20磷酸盐缓冲液；W:蒸馏水；S:生理盐水，每种包被液3个技术学重复。分别计算P均值、N均值和P/N值，以P/N值最大确定最佳包被液。结果显示： PBS为最佳蛋白包被液(如表2所示)。
表2.最佳包被液摸索
3.最佳封闭液浓度摸索
用最佳包被液将抗原稀释到最佳浓度，将试验室最常用、最易得的脱脂奶粉用PBST缓冲液制成0.5％-7％等8个不同的梯度浓度的脱脂乳，每个梯度3个技术学重复，根据P/N值最大确定最佳封闭液的浓度。结果：最佳封闭液为5％的脱脂乳(如表3所示)。
表3.最佳封闭浓度摸索
4.最佳封闭时间摸索
用实验所得的最佳封闭液浓度封闭ELISA板，分别做0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h等5个梯度的封闭时间进行检测，每个梯度3个技术学重复，根据P/N值最大确定最佳封闭时间。结果：最佳封闭时间为37℃作用1h(如表4所示)。
表4.最佳封闭时间摸索
5.抗血清最佳作用时间摸索
将阳性血清抗体及阴性对照血清稀释最佳倍数后，每孔加入100μL，分为4组，每组分别孵育0.5h、1h、1.5h、2h不同时间，分别计算其P/N的值，以P/N值最大确定抗血清最佳作用时间。结果：鸡抗新型GyV3血清最佳作用时间为37℃作用1h(如表5所示)。
表5.最佳一抗作用时间摸索
6.二抗最佳稀释度摸索
二抗为北京博奥森公司羊抗鸡二抗(HRP标记)，将此抗体分别作1:5000、1:10000、1:20000、1:40000、1:80000等5个梯度稀释，分别进行检测，每个梯度3个技术学重复，分别计算其P/N的值，P/N值最大确定二抗的最佳稀释倍数。结果：HRP标记山羊抗鸡抗体最佳稀释倍数为1:5000(如表6所示)。
表6.最佳二抗浓度摸索
7.二抗作用时间摸索
将羊抗鸡二抗(HRP标记)稀释最佳倍数后，二抗孵育时间设置0.5h、1h、1.5h、2h等4 个梯度，分别作用于ELISA板，每个梯度3个技术学重复，计算其P/N的值，P/N值最大确定二抗的最佳作用时间。结果：二抗最佳作用时间为37℃作用1h(如表7所示)。
表7.最佳二抗作用时间摸索
8.最佳显色时间摸索
用TMB单组份底物显色液设置10min、20min、30min、40min等4组分别进行检测，每个梯度3个技术学重复，分别计算其P/N的值，P/N值最大确定底物显色液的最佳作用时间。结果：TMB底物最佳显色时间为37℃作用10min(如表8所示)。
表8.最佳显色时间摸索
9.临界值的确定
随机抽取42份SPF鸡血清，用优化的ELISA方法检测，计算出这42份血清的均OD450nm 的平均值(x)和标准差SD，阴阳性临界值＝x+3SD。当检测的样本OD450nm值≥x+3SD时，可在99.9％的水平上判定为阳性。结果显示：优化的ELISA阴阳性临界值为0.184(如图7 所示)。
10.间接ELISA方法的敏感性检测
将之前验证好的GyV3阳性血清和无感染GyV3阴性血清分别稀释1:100-25600倍，用优化的ELISA方法测定其敏感性,大于临界值稀释度为ELISA敏感度。结果：ELISA敏感度为 1:3200(如图8所示)。
11.间接ELISA方法的特异性检测
按照优化的ELISA操作流程对ALV-J、REV、MDV、NDV、CAV和GyV3阳性血清进行测定，每个血清3个技术学重复，进行特异性试验。结果：GyV3-VP1 ELISA与其他病毒没有发生结合，只与GyV3特异性结合，结果表明ELISA特异性良好(如图9所示)。
12.间接ELISA方法的板内重复性检测
用同一批制备的VP1蛋白包被1快酶标板，在同一块酶标板内检测3份GyV3阳性血清样品和3份无感染GyV3 SPF鸡血清样品，每份血清样品重复6孔，计算其平均值、标准差和变异系数(CV))，CV＝标准差/平均值。结果显示：重复性最大值为9.41％<15％，说明ELISA具有良好的板内重复性(如表9所示)。
表9.板内重复性检测
13.间接ELISA方法的板间重复性检测
用同一批制备的VP1蛋白包被6块酶标板，相同条件下分别在6块酶标板内检测3份GyV3阳性血清样品和3份无感染GyV3 SPF鸡血清样品，每份血清样品重复6孔，计算每一份血清样品的平均值、标准差和变异系数(CV)，CV＝标准差/平均值。结果：重复性最大值为10.19％<15％，说明ELISA具有良好的板间重复性(如表10)。
表10.板间重复性检测
14.流行病学调查
从山东收集的7个城市的血清样本，用优化的ELISA进行检测，进行GyV3的流行病学调查。结果：在GyV3感染鸡5天抗体水平达到最高，随后效价逐步降低，最后趋于稳定(如图10所示)。
在优化了上述ELISA条件后，实验所用试剂更加廉价易得，所需时间进一步缩短，可以在内对鸡群的感染状态高效准确测定，推广到养殖公司后可以在临床简单条件下便做出准确判定，有利于鸡新型GyV3的防控和限制其传播的作用。
实施例4 GyV3荧光定量PCR检测方法的建立
相应引物序列如下：
上游引物GyV3 Forward：5’-ACCGGGACTTGGACACC-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；
下游引物GyV3 Reverse：5’-AGCCAGGAAGCGATACG-3’，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示；
所述PCR扩增的反应体系如下：反应液每管20μL，含有Green Premix ProTaq HS qPCR Mix 10μL，10μmol/μL GyV3 Forward、GyV3 Reverse各0.4μL，RNase FreeddH2O 8.2μL，待检测的样品DNA模板1μL；
所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；
选择经GyV3鉴定引物鉴定为阳性的DNA样品为模板，进行PCR扩增，
扩增产物进行琼脂糖凝胶(1.0％)电泳鉴定，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根) 进行纯化回收。将纯化的DNA产物连接至pMD 18-T Vector中，构建新型质粒，于16℃中连接50min。构建新型质粒，将连接GyV3目的片段的质粒进行10倍倍比稀释，进行荧光定量PCR扩增，生成荧光定量扩增曲线、溶解曲线并构建荧光定量标准曲线；以标准品起始拷贝数的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，推导出标准线性回归方程(标准曲线)Y＝-2.8546X+36.82(Y：Ct值，X：模板起始拷贝数)，回归系数R2＝0.99，获得其敏感性试验数据；以T-GyV3作为阳性标准质粒；设空白作为阴性对照(如图11所示)；
(2)结果判定：
质控标准：阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.86，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；
结果描述及判定：无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤36.86，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。
(3)具体检测实例：
2020年采集全国236份血清和泄殖腔棉拭子，使用荧光定量PCR和间接ELISA进行相应检测。结果显示：血清和泄殖腔棉拭子荧光定量阳性率为5.5％和5.08％，ELISA抗体阳性率为5.93％，两者结果对比几乎接近相同，说明该检测体系检测效果良好(如表11所示)。
表11.检测体系检测结果
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 一株鸡新型圆圈病毒3型毒株及基于该病毒的检测体系
<150> 2021104703754
<151> 2021-04-29
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1125
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ccagacacaa ctaaaggcaa aaacgttaca acaactaatg tggcactaat taacgttaac 60
ctgaaagagt tcttctgggc cacactgcca ctagacgcaa ggtcaaagat tggaggaccc 120
aaccccttcc cacaacacat ccagggatgt gactgggcgg gcatagccac aacccacaaa 180
ggctgctggc catacagtac acaaatgtca tcatctagac agccaggggc atggccttca 240
gaatggtggc gatgggcact tcttcttatg catcctagat ccaatgtacg attcttcgga 300
tccccgaaac tgatgaccct accacaaata ggacagttcc tggggggctg gcaactattc 360
acccacagat tcacaaaatt ccgtgtgctt gcaactaaga gcagagaatc gttctccccg 420
gtcgcgagcc tgcttgtaca agacaattac tttgcaagaa gagagggtgc agggccacca 480
atatcgggac aaccaccaat gtgcaccatg caaagactta cgagagacta tacaggcaca 540
gaaagcaatg ctccagctaa tgaaaccaca ataccatcca tgccaccaga cccaccccaa 600
taccccgctc aaaccggctg cagcacggcg gtagaccctg gtgaatacct cctcgcagga 660
ctcacacgta cagcagtatc ctgctggtat tcacgctcaa catacccaag ctttgctacg 720
ctatcagcac taggggcacc atggtcattc ccagcaggac agaagtcaat cagcaaaaca 780
tccttcaaca aacatgtcat tagaggcatg ggtgacccac aaggcaaaaa atggctcacc 840
ctggtaccga aagaacaaga atggatcaat tcggactcaa tgacaaagtc agaactggac 900
acggacatag ctacattgta cctagctcaa ggaacaagca gagcaaacag ctacaaattc 960
aacacattcc acgaggtaat ggtacaagac cccatgaatg tagccccctg ggcagtcgtc 1020
aaagtctcca gcgtctggac actcggcaac aacagaagac catacccatg ggatgtcaac 1080
tggtacaacg aattcactgc agaaggccgc gtccccgcag actag 1125
<210> 2
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
Pro Asp Thr Thr Lys Gly Lys Asn Val Thr Thr Thr Asn Val Ala Leu
1 5 10 15
Ile Asn Val Asn Leu Lys Glu Phe Phe Trp Ala Thr Leu Pro Leu Asp
20 25 30
Ala Arg Ser Lys Ile Gly Gly Pro Asn Pro Phe Pro Gln His Ile Gln
35 40 45
Gly Cys Asp Trp Ala Gly Ile Ala Thr Thr His Lys Gly Cys Trp Pro
50 55 60
Tyr Ser Thr Gln Met Ser Ser Ser Arg Gln Pro Gly Ala Trp Pro Ser
65 70 75 80
Glu Trp Trp Arg Trp Ala Leu Leu Leu Met His Pro Arg Ser Asn Val
85 90 95
Arg Phe Phe Gly Ser Pro Lys Leu Met Thr Leu Pro Gln Ile Gly Gln
100 105 110
Phe Leu Gly Gly Trp Gln Leu Phe Thr His Arg Phe Thr Lys Phe Arg
115 120 125
Val Leu Ala Thr Lys Ser Arg Glu Ser Phe Ser Pro Val Ala Ser Leu
130 135 140
Leu Val Gln Asp Asn Tyr Phe Ala Arg Arg Glu Gly Ala Gly Pro Pro
145 150 155 160
Ile Ser Gly Gln Pro Pro Met Cys Thr Met Gln Arg Leu Thr Arg Asp
165 170 175
Tyr Thr Gly Thr Glu Ser Asn Ala Pro Ala Asn Glu Thr Thr Ile Pro
180 185 190
Ser Met Pro Pro Asp Pro Pro Gln Tyr Pro Ala Gln Thr Gly Cys Ser
195 200 205
Thr Ala Val Asp Pro Gly Glu Tyr Leu Leu Ala Gly Leu Thr Arg Thr
210 215 220
Ala Val Ser Cys Trp Tyr Ser Arg Ser Thr Tyr Pro Ser Phe Ala Thr
225 230 235 240
Leu Ser Ala Leu Gly Ala Pro Trp Ser Phe Pro Ala Gly Gln Lys Ser
245 250 255
Ile Ser Lys Thr Ser Phe Asn Lys His Val Ile Arg Gly Met Gly Asp
260 265 270
Pro Gln Gly Lys Lys Trp Leu Thr Leu Val Pro Lys Glu Gln Glu Trp
275 280 285
Ile Asn Ser Asp Ser Met Thr Lys Ser Glu Leu Asp Thr Asp Ile Ala
290 295 300
Thr Leu Tyr Leu Ala Gln Gly Thr Ser Arg Ala Asn Ser Tyr Lys Phe
305 310 315 320
Asn Thr Phe His Glu Val Met Val Gln Asp Pro Met Asn Val Ala Pro
325 330 335
Trp Ala Val Val Lys Val Ser Ser Val Trp Thr Leu Gly Asn Asn Arg
340 345 350
Arg Pro Tyr Pro Trp Asp Val Asn Trp Tyr Asn Glu Phe Thr Ala Glu
355 360 365
Gly Arg Val Pro Ala Asp
370
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
accgggactt ggacacc 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
agccaggaag cgatacg 17
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
cgagctcgac acaactaaag gcaa 24
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
ttgcggccgc ctagtctgcg gggacgc 27