mRNA或mRNA组合物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 mRNA或mRNA组合物及其制备方法和应用 (mRNA or mRNA composition, preparation method and application thereof ) 是由 朱涛 王浩猛 李荩 晏巧玲 莘春林 邵忠琦 李军强 宇学峰 巢守柏 于 2021-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供了mRNA或mRNA组合物以及包含mRNA或mRNA组合物的mRNA疫苗。所述的mRNA或mRNA组合物包含编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列。本发明还提供了mRNA或mRNA组合物以及包含mRNA或mRNA组合物的mRNA疫苗在制备预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染导致的疾病的药物(尤其是疫苗)中的应用。(The invention provides mrnas or mRNA compositions and mRNA vaccines comprising mrnas or mRNA compositions. The mRNA or mRNA composition comprises an mRNA sequence encoding the S protein of the novel coronavirus SARS-CoV-2 or a variant thereof and an mRNA sequence encoding the RBD in the S protein or a variant thereof. The invention also provides the mRNA or mRNA composition and the application of the mRNA vaccine containing the mRNA or mRNA composition in the preparation of medicaments (especially vaccines) for preventing and/or treating diseases caused by the infection of the novel coronavirus SARS-CoV-2.)
技术领域
本发明涉及疫苗研制技术领域，具体涉及包含编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的刺突蛋白(S蛋 白)或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的受体结合域(RBD)或其变体的mRNA序列。本发明涉及 包含一种或两种mRNA的组合物。以及所述mRNA或组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒 SARS-CoV-2感染的药物(尤其是疫苗)中的应用。
背景技术
冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒(Nidovirales)冠状病毒(Coronaviridae) 正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ和 δ四个属。迄今为止，共有7种冠状病毒可感染人类：包括α属的229E和NL63，β属的OC43和HKU1、 中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERSr-CoV)、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr-CoV)和新型冠 状病毒(SARS-CoV-2)。其中只有后三种会导致严重的人类疾病甚至死亡。
冠状病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，经常为多形性，直径通常为50～200nm。S蛋白位于病 毒表面形成棒状结构，作为病毒的主要抗原蛋白之一，是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因 组，可用作诊断抗原。对冠状病毒理化特性的认识多来自对SARS-CoV和MERS-CoV的研究。基于 SARS-CoV的全长S蛋白设计的疫苗被报道会诱导大量非中和抗体，在动物模型上攻毒失败且引起严重 的副反应，比如增加发病率，引起肝部组织强烈炎症反应及肝损伤(参见文献：“Evaluation of modified vaccinia virus ankara basedrecombinant SARS vaccine in ferrets”，Vaccine 23， 2273-2279.)。因此，在疫苗设计中避免暴露能具有免疫优势的非中和表位是保障疫苗安全性的基础。
SARS-CoV和MERS-CoV的RBD都由两部分组成：一个高度相似的核心结构和一段差异极大的受体 结合基序(RBM)。RBM的不同使得SARS-CoV和MERS-CoV分别识别不同的受体：SARS-CoV识别血管紧 张素转化酶2(ACE2)，而MERS-CoV识别二肽基肽酶4(DPP4)。
目前SARS-CoV和MERS-CoV疫苗研发所涉及到的疫苗平台有：病毒载体疫苗、DNA疫苗、亚单位 疫苗、类病毒颗粒(VLP)疫苗、全病毒灭活疫苗和减毒疫苗。
虽然全病毒灭活疫苗理论上可以快速生产应对新型冠状病毒SARS-CoV-2疫情的爆发，但是一方 面病毒的培养需要生物安全三级实验室，疫苗企业一般很难满足其生产要求；另一方面安全性可能也 存在问题，研发中的SARS-CoV和MERS-CoV的全病毒灭活疫苗均有报道在小鼠模型上攻毒后会在肺部 发现过敏型病理现象(参见文献：“Immunizationwith inactivated middle east respiratory syndrome coronavirus vaccine leadsto lung immunopathology on challenge with live virus”，Hum.Vaccin.Immunother.12，2351-2356.)，因此全病毒灭活疫苗的形式并不是研发用于COVID-19疫苗的最佳选 择。
由于老年人以及免疫力低下的人群，也是SARS-CoV-2感染的宿主，而减毒活苗平台制备得到的 疫苗不适合老年人及免疫力低下个体，因此不适合用于COVID-19疫苗的研发。
DNA疫苗和病毒载体疫苗都是将DNA递送至疫苗接种者的细胞内表达，虽然诸如基于腺病毒载体 的疫苗目前并没有整合重组进基因组的报导，但是也不能完全排除此种可能，仍有一定安全风险。亚 单位疫苗和VLP疫苗则是需要建立优化表达、纯化方法，并且一般需要选择搭配适合的佐剂，需要的 研究时间往往以年计算，难以用于应对快速发展的疫情。
近年来RNA分子领域相关技术突破性进展，mRNA疫苗在流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒等多 种传染病上取得了一定的研究成果，mRNA疫苗将mRNA传递至细胞，表达产生蛋白，从而使机体获得 免疫保护。与传统的重组蛋白疫苗、灭活疫苗和减毒疫苗相比，mRNA疫苗制备步骤简单，对于传染性 疾病的控制有着重大意义。此外，mRNA疫苗比传统重组疫苗更耐高温也更加稳定。同时，mRNA疫苗能 够引起强烈的CD4+或CD8+的T细胞应答，与DNA免疫接种不同，在动物体内mRNA疫苗通过一两次低 剂量接种就能够产生抗体。
因此，本发明提供了一种安全可靠的mRNA疫苗，避免了其他疫苗平台的缺陷。
发明内容
本发明的第一方面，提供了mRNA或mRNA组合物，所述的mRNA或mRNA组合物包含编码新 型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白(刺突蛋白)或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD(受 体结合域)或其变体的mRNA序列。
其中，所述的编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列与编码S蛋白 中的RBD或其变体的mRNA序列来源于相同的SARS-CoV-2突变株或不同的SARS-CoV-2突变株。
优选的，所述的S蛋白或其变体包含野生型全长S蛋白或固定在融合前构象的全长S蛋白。
进一步优选的，为稳定构象，所述的固定在融合前构象的全长S蛋白包含682RRAR685位 突变和/或将986KV987位突变，以使S蛋白固定到融合前构象。最为优选的，所述的固定在融合 前构象的全长S蛋白为将野生型全长S蛋白的682RRAR685突变为GSAG和/或将986KV987突变为 PP。
同时，现有专利中公开的部分内容也支持了本发明的技术方案，例如在接近第一段七肽重 复区域或在第一段七肽重复区域中将一个或两个氨基酸替换为脯氨酸可极有效率地稳定构象(见 美国专利，申请号20200061185，PREFUSION CORONAVIRUS SPIKEPROTEINS and THEIR USE)。
在本发明的一个
具体实施方式
中，所述的野生型全长S蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：1 或与SEQ ID NO：1具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的固定在融合前构象的全长S蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：15或与SEQ ID NO：2或15具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的氨基酸序列。
优选的，所述的S蛋白或其变体不包含信号肽、包含野生型S蛋白的信号肽或包含野生型 S蛋白的信号肽及在其前添加强信号肽，所述的强信号肽优选为组织型纤溶酶原激活剂(tPA) 的信号肽或血清免疫球蛋白E(lgE)的信号肽。
在本发明的一个具体实施方式中，编码不含信号肽的野生型2019-nCoV S蛋白的核苷酸序 列如SEQ ID NO：6所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的RBD的氨基酸序列如SEQ ID NO：3、SEQID NO： 13、或与SEQ ID NO：3或13具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的氨基酸序列。
优选的，所述的RBD或其变体不包含信号肽、包含野生型S蛋白的信号肽或包含野生型S 蛋白的信号肽及在其前添加强信号肽，所述的强信号肽优选为组织型纤溶酶原激活剂(tPA)的 信号肽或血清免疫球蛋白E(lgE)的信号肽。
在本发明的一个具体实施方式中，编码含IgE信号肽的野生型SARS-CoV-2的RBD的核苷 酸序列如SEQ ID NO：7、9-11任一所示。
优选的，所述的mRNA为单顺反子、双顺反子或多顺反子mRNA。所述的双顺反子或多顺反 子mRNA即含有两个及以上编码区的mRNA。
优选的，所述的编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列与编码S蛋 白中的RBD或其变体的mRNA序列为分别的两条mRNA序列或连接为一条mRNA序列。
进一步优选的，连接为一条mRNA序列从5’至3’的连接顺序为：先编码新型冠状病毒 SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列、后编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，或 者为先编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列、后编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或 其变体的mRNA序列。再进一步优选的，编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA 序列与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列之间通过内部核糖体进入位点(IRES)连接。
其中，所述的IRES可以用于分隔两个编码区。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的IRES序列包括但不限于小RNA病毒(例如FMDV)、 瘟病毒(例如CFFV)、脊髓灰质炎病毒(例如PV)、脑心肌炎病毒(例如ECMV)、口蹄疫病毒(例如 FMDV)、丙肝病毒(例如HCV)、古典猪瘟病毒(例如CSFV)、小鼠角膜白斑病毒(例如MLV)、猿免 疫缺陷病毒(例如SIV)或蟋蟀麻痹病毒(例如CrPV)。
优选的，所述的mRNA或mRNA组合物还包含5’帽子结构、5’非编码区和多聚腺苷酸尾。
进一步优选的，所述的mRNA或mRNA组合物还包含5’保守序列元素、RNA复制酶编码区、 亚基因组启动子、3’保守序列元素或3’非编码区中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述的mRNA为传统mRNA、自主扩增型mRNA或反式扩增型mRNA。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA为传统mRNA，即所述的mRNA除包含编码新 型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA 序列外，还包含5’帽子结构，5’非编码区，3’非编码区和/或多聚腺苷酸尾的mRNA序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA为自主扩增型mRNA，即所述的mRNA除包含 编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD或其变体 的mRNA序列外，还包括5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子， 3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成。其中，可使用的RNA复制酶编码区包括但不限于甲病毒 (例如SFV)、小RNA病毒(例如FMDV)、黄病毒(例如DENV)、副粘病毒(例如HMPV)或杯状病毒(例 如NV)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA为反式扩增型mRNA，即所述的编码目的基因 的mRNA除包含编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中 的RBD或其变体的mRNA序列外，还包括5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，3’ 保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成；RNA复制酶由单独的传统mRNA编码。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA或mRNA组合物包括编码新型冠状病毒SARS-CoV-2 的S蛋白或其变体的mRNA序列与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列连接构成的一条mRNA序列， 其选自下列任一组:
A)由5’帽子结构，5’非编码区，编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序 列，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成；
B)由5’帽子结构，5’非编码区，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，编码新型冠状 病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成；
C)由5’帽子结构，5’非编码区，编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序 列，内部核糖体进入位点(IRES)，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚 腺苷酸尾构成；
D)由5’帽子结构，5’非编码区，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，IRES，编码新 型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成；
E)由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码S蛋白中的 RBD或其变体的mRNA序列，编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守 序列元素和多聚腺苷酸尾构成；
F)由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码新型冠状病 毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守 序列元素和多聚腺苷酸尾构成；
G)由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码S蛋白中的 RBD或其变体的mRNA序列，IRES，编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’ 保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成；或
H)由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码新型冠状病 毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列，IRES，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’ 保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA或mRNA组合物包括两条mRNA序列的组合，其选 自下列任一组：
a)由5’帽子结构，5’非编码区，编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序 列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，编码S蛋 白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
b)由5’帽子结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码S蛋白 中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子 结构，5’保守序列元素，RNA复制酶编码区，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS-CoV-2 的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
c)由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS-CoV-2 的S蛋白或其变体的mRNA序列，IRES，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序 列元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’ 非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
d)由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的 mRNA序列，IRES，编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列 元素和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’ 非编码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；
e)由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码新型冠状病毒SARS-CoV-2 的S蛋白或其变体的mRNA序列，编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素 和多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’非编 码区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA；或
f)由5’帽子结构，5’保守序列元素，亚基因组启动子，编码S蛋白中的RBD或其变体的 mRNA序列，编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的mRNA序列，3’保守序列元素和 多聚腺苷酸尾构成的mRNA，组合由5’帽子结构，5’非编码区，RNA复制酶编码区，3’非编码 区和多聚腺苷酸尾构成的mRNA。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA或mRNA组合物中包含的mRNA序列包含 SEQ ID NO：16-19中的任一个或两个以上的组合。
优选的，所述的mRNA或mRNA组合物还包括阳离子或聚阳离子化合物。
优选的，所述的阳离子或聚阳离子化合物游离或者与mRNA结合。
在本发明的一个具体实施方式中，为了使得所述mRNA或mRNA组合物更稳定选择阳离子或聚 阳离子化合物与所述mRNA结合的形式。
优选的，所述的mRNA或mRNA组合物中还包含脂质。
进一步优选的，所述的脂质包括但不限于能够促进自组装形成病毒大小的颗粒(～100nm) 的脂质体、使得mRNA从内涵体中释放到胞内的脂质体、支撑磷脂双分子层结构的脂质体或用作 稳定剂的脂质体。
更优选的，为了增加LNP(脂质纳米颗粒)的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG化脂质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的脂质包含阳离子脂质、PEG化脂质、胆固醇和/或 磷脂。
本发明所述的mRNA或mRNA组合物可以为脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子。所述的脂质体可 以为以下形式制备得到的脂质体：1，2-二油烯基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DODMA)脂质体、1，2- 二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧杂 环戊烷(DLin-KC2-DMA)脂质体。所述脂质复合物或脂质纳米粒子可以由选自以下的脂质形成：DLin-DMA、 DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、聚乙 二醇化脂质和氨基醇脂质。
本发明所述的mRNA或mRNA组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形 剂可以是载体、稀释剂、佐剂或编码佐剂核苷酸序列、增溶剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、转染促进 剂等。所述转染促进剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、费氏(Freunds)不完全佐剂、LPS 类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒 蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚-L-谷氨酸(LGS))或纳米粒子或其他已知的转染促进剂。所述的编 码佐剂的核苷酸序列为编码如下至少一种佐剂的核苷酸序列：GM-CSF、IL-17、IFNg、IL-15、IL-21、 抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-12、INF-α、INF-γ、Lymphotoxin-α、hGH、MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋 白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、 ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、 神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、 DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、 TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、 NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。
本发明的第二方面，提供了一种mRNA疫苗，所述的mRNA疫苗包括本发明任一所述的mRNA 或mRNA组合物。
优选的，所述的mRNA疫苗中编码的新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体与编码S蛋 白中的RBD或其变体的序列分别来自于不同SARS-CoV-2突变株，从而免疫产生对不同SARS-CoV-2 突变株的交叉保护。在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA疫苗中编码含IgE信号肽的 野生型SARS-CoV-2的RBD中含有501Y.V2谱系的K417N、E484K和N501Y突变，优选其氨基酸序 列如SEQ ID NO：13所示；编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前 构象的全长S蛋白的序列来自Wuhan-Hu-1isolate，其中含有501Y.V2谱系的L18F、D80A、D215G、 L242-L244删除突变(L242-244del)、R246I、K417N、E484K、N501Y和A701V，优选其氨基酸 序列为SEQ ID NO：15所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA疫苗包含编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S 蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，其中，新型冠状病毒 SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，S蛋白中的RBD或其变体如 SEQ ID NO：13所示。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的mRNA疫苗包含编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的 S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，其中，新型冠状病 毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，S蛋白中的RBD或其变体 如SEQ ID NO：13所示。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的mRNA疫苗包含编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的 S蛋白或其变体的mRNA序列以及编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA序列，其中，新型冠状病 毒SARS-CoV-2的S蛋白或其变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，S蛋白中的RBD或其变体 如SEQ ID NO：3所示。优选的，所述的mRNA疫苗中编码新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白或 其变体的mRNA与编码S蛋白中的RBD或其变体的mRNA的质量比为(1-5)：(1-5)。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的mRNA疫苗中编码含IgE信号肽的野生型SARS-CoV-2 的RBD的mRNA和编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全 长S蛋白的mRNA的质量比为(1-2)：(1-2)。
优选的，所述的mRNA疫苗还包括阳离子或聚阳离子化合物。
优选的，所述的阳离子或聚阳离子化合物游离或者与mRNA结合。
在本发明的一个具体实施方式中，为了使得所述mRNA疫苗更稳定选择阳离子或聚阳离子化 合物与所述mRNA结合的形式。
优选的，所述的mRNA疫苗中还包含脂质。
进一步优选的，所述的脂质包括但不限于能够促进自组装形成病毒大小的颗粒(～100nm) 的脂质体、使得mRNA从内涵体中释放到胞内的脂质体、支撑磷脂双分子层结构的脂质体或用作 稳定剂的脂质体。
更优选的，为了增加LNP的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG化脂质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的脂质包含阳离子脂质、PEG化脂质、胆固醇和/或 磷脂。
本发明所述的mRNA疫苗可以为脂质体、脂质复合物或脂质纳米粒子。所述的脂质体可以为以下 形式制备得到的脂质体：1，2-二油烯基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DODMA)脂质体、1，2-二亚油基氧 基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧杂环戊烷 (DLin-KC2-DMA)脂质体。所述脂质复合物或脂质纳米粒子可以由选自以下的脂质形成：DLin-DMA、 DLin-K-DMA、98N12-5、C12-200、DLin-MC3-DMA、DLin-KC2-DMA、DODMA、PLGA、PEG、PEG-DMG、聚乙 二醇化脂质和氨基醇脂质。
本发明所述的mRNA疫苗还可以包含药学上可接受的赋形剂。所述药学上可接受的赋形剂可 以是载体、稀释剂、佐剂或编码佐剂核苷酸序列、增溶剂、粘合剂、润滑剂、助悬剂、转染促进 剂等。所述转染促进剂包括但不限于表面活性剂如免疫刺激复合物、费氏(Freunds)不完全佐剂、 LPS类似物(例如单磷酰酯A)、胞壁肽、苯醌类似物、角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离 子、病毒蛋白质、阳离子、聚阳离子(例如聚-L-谷氨酸(LGS))或纳米粒子或其他已知的转染促进 剂。所述的编码佐剂的核苷酸序列为编码如下至少一种佐剂的核苷酸序列：GM-CSF、IL-17、IFNg、 IL-15、IL-21、抗PD1/2、乳铁蛋白、鱼精蛋白、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INF-α、INF-γ、Lymphotoxin-α、hGH、MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、 IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、 VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、、CD40、CD40L、 血管生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、Apo-1、p55、WSL-1、 DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天 冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性 的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、 RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、 NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。
本发明的第三方面，提供了一种mRNA或mRNA组合物的制备方法，包括将mRNA与阳离子或聚阳 离子化合物混合后用脂质包装。
优选的，所述的脂质包括但不限于能够促进自组装形成病毒大小的颗粒(～100nm)的脂质体、 使得mRNA从内涵体中释放到胞内的脂质体、支撑磷脂双分子层结构的脂质体或用作稳定剂的脂质体。 更优选的，为了增加LNP的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG化脂质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的脂质包含阳离子脂质、PEG化脂质、胆固醇和/或磷脂。
本发明的第四方面，提供了一种mRNA疫苗的制备方法，所述的制备方法包括将本发明任一 所述的mRNA或mRNA组合物与阳离子或聚阳离子化合物混合后用脂质包装。优选的，包装成脂质 纳米颗粒。
优选的，所述的脂质包括但不限于能够促进自组装形成病毒大小的颗粒(～100nm)的脂质体、 使得mRNA从内涵体中释放到胞内的脂质体、支撑磷脂双分子层结构的脂质体或用作稳定剂的脂质体。 更优选的，为了增加LNP的半衰期，所述的脂质还可以包含PEG化脂质。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的脂质包含阳离子脂质、PEG化脂质、胆固醇和/或磷脂。
本发明的第五方面，提供了一种本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物或mRNA疫苗在预防 和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染导致的疾病的应用。
优选的，所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染导致的疾病包括但不限于COVID-19。
本发明的第六方面，提供了一种本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物或mRNA疫苗在抗新 型冠状病毒SARS-CoV-2感染中的应用。
本发明的第七方面，提供了一种本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物或mRNA疫苗在制备 预防和/或治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染导致的疾病的药物中的应用。
优选的，所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2感染导致的疾病包括但不限于COVID-19。
本发明的第八方面，提供了一种本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物或mRNA疫苗在制备 抗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的药物中的应用。
本发明的第九方面，提供了一种治疗和/或预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染导致的疾病的 方法，包括向个体施加有效量的本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物，或者mRNA疫苗。
本发明的第十方面，提供了一种预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的方法，包括向未感染 新型冠状病毒SARS-CoV-2的个体施加有效量的本发明所述的mRNA疫苗。
本发明的第十一方面，提供了一种治疗新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的方法，包括向感染新型 冠状病毒SARS-CoV-2的个体施加有效量的本发明所述的mRNA或包含mRNA的组合物或mRNA疫苗，以 使得个体体内产生中和抗体抵制新型冠状病毒SARS-CoV-2。
本发明的第十二方面，提供了一种抗体筛选的方法，所述的方法包括向个体施加有效量的本 发明任一所述的mRNA或mRNA组合物，或者mRNA疫苗的步骤。
其中，所述的抗体筛选的方法不是治疗方法。该方法用来筛选中和抗体，对抗体的药效进行检测 和比较，以确定哪些抗体可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度， 即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第十三方面，提供了一种诱导个体中和抗原特异性免疫应答的方法，所述的方法包括向 个体施加本发明任一所述的mRNA或mRNA组合物，或者mRNA疫苗。
优选的，所述的抗原特异性免疫应答包括T细胞应答和/或B细胞应答。
本发明的第十四方面，提供了本发明所述的mRNA或mRNA组合物编码的蛋白。
优选的，所述的蛋白为固定在融合前构象的全长S蛋白。进一步优选的，所述的固定在融合前构 象的全长S蛋白包含682RRAR685位突变和/或将986KV987位突变，以使S蛋白固定到融合前构象。最 为优选的，所述的固定在融合前构象的全长S蛋白为将野生型全长S蛋白的682RRAR685突变为GSAG 和/或将986KV987突变为PP。
本发明的第十五方面，提供了一种编码本发明所述蛋白的核苷酸序列。
本发明的第十六方面，提供了一种包含本发明所述核苷酸序列的载体。
本发明的第十七方面，提供了一种包含本发明所述的蛋白、所述的核苷酸序列和/或所述的载体 的细胞。
本发明所述的mRNA或mRNA组合物以及包含mRNA或mRNA组合物的mRNA疫苗具备的优势在于：1、 体外合成，无需细胞培养，无动物源污染的风险；2、研发、生产较快，标准化生产，易于量产和质量 控制，同一生产流程适用于多个不同产品；3、可以在一段时间内持续表达，延长抗原暴露时间从而提 高免疫反应的强度和质量；4、模拟天然感染的过程，在人体细胞内被翻译、修饰，可以被MHC I类分 子呈递，诱发更强的细胞免疫；5、支持多种蛋白形式，包括胞内蛋白、跨膜蛋白、VLP等，且可避开 VLP产量低而造成的纯化问题；6、具有自佐剂效应，无需进行佐剂筛选；7、无感染、基因组整合风 险；8、无预存免疫，可多次免疫。
本发明所述的mRNA或mRNA组合物的表达产物包含RBD或其变体以及S蛋白或其变体，其中，RBD 中包含了主要的中和表位，可以诱发高水平的中和抗体滴度；而且，非中和表位相对较少，安全性高。 全长S蛋白可诱导出高水平的特异性细胞免疫，配合针对性诱导中和抗体的RBD，可以产生极为优异 的免疫效果。进一步的，实施例也证实了本发明所述的mRNA或mRNA组合物的表达产物能够在人体中 诱发高水平中和抗体和细胞因子的产生。
同时，现有技术中公开的部分内容也支持了本发明的技术方案，例如通过对SARS-CoV-2的RBD 的序列分析，以及对其结构的模拟预测，认为SARS-CoV-2的S蛋白维持了SARS-CoV的S蛋白和ACE2 相互作用的结构构象。通过比对MERS-CoV的RBD的不同片段，确定蛋白片段377-588为关键中和域， 即可以在小鼠和兔子模型中引起最高的中和抗体滴度；而且此关键中和域仍可以和受体hDPP4结合， 证明其保持了结构构象，不止可以提供线性表位，也可以提供结构表位(见Cuiqing,M等(2014)， Searching for an ideal vaccinecandidate among different MERS coronavirus receptor-binding fragments--theimportance of immunofocusing in subunit vaccine design，Vaccine. 32(46):6170-6176.)。
本发明所述的“个体”包括哺乳动物和人。所述的哺乳动物包括但不限于啮齿类动物(例如小鼠、 大鼠)、猴子、斑马鱼、猪、鸡、兔子等等。
本发明所述的“预防”指在疾病开始发展之前或之后通过施用本发明所述的产品来避免症状或者 延缓特定症状紧张的所有行为；优选的，所述的预防包括将本发明所述的mRNA或包含mRNA的组合物 用作疫苗。
本发明所述的“治疗”指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预； 优选的，所述的治疗包括筛选与本发明所述的mRNA或包含mRNA的组合物结合的抗体，并将其用于治 疗。
本发明所述的“有效量”是指在以单个或多个剂量给予至患者或器官之后提供所希望的治疗或预 防的本发明所述产品的量或剂量。
本发明所述的“S蛋白”为组成新型冠状病毒SARS-CoV-2的结构蛋白，名称为刺突蛋白。
本发明所述的“RBD”为组成新型冠状病毒SARS-CoV-2的结构蛋白，名称为刺突蛋白受体结合域。
本发明所述的“同一性”是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据 实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％， 2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％， 22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％， 58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％， 94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％ 的相似度，且依然具有与原氨基酸序列或核苷酸序列相同或类似的功能，例如与原序列具有同一性的 氨基酸序列依然具有在体内诱发中和抗体和产生细胞因子的功能，与原序列具有同一性的mRNA序列表 达产物依然具有在体内诱发中和抗体和产生细胞因子的功能。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：编码含tPA信号肽的野生型SARS-CoV-2的RBD的序列测序结果。
图2：图2A和图2B的拼接为编码野生型SARS-CoV-2的S蛋白的序列测序结果。
图3：含有T7启动子，5’UTR，3’UTR，和polyA尾的基础质粒模板序列图。
图4：用甲醛变性胶检测加帽纯化后的mRNA，其中，M为Marker，1为编码含tPA信号肽的野生 型SARS-CoV-2的RBD的mRNA，2为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合 前构象的全长S蛋白的mRNA。
图5：WB(Western Blot，蛋白质印迹法)检测结果，其中1为编码含tPA信号肽的野生型SARS-CoV-2 的RBD的mRNA的表达上清，2为阴性对照。
图6：免疫荧光结果。
图7：DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)检测mRNA-LNP的粒径和粒径分布结果， 其中，A代表RBD+S-1-LNP，B代表RBD+S-2-LNP，C代表RBD+S-3-LNP，D代表RBD-LNP，E代表S-LNP。
图8：甲醛变性胶检测包装后样品的mRNA完整性结果，其中1为编码含tPA信号肽的野生型 SARS-CoV-2的RBD的mRNA，2为RBD+S-1，3为RBD+S-2，4为RBD+S-3，5为编码682RRAR685突变为 GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA。
图9：一免、二免后的S蛋白特异性抗体滴度，其中，Negative为阴性对照。
图10：用ELISpot(酶联免疫斑点法)检测干扰素γ(IFN-γ)的结果，其中，纵坐标为每百万 脾细胞的点形成单位(spot forming unit，SFU)，Negative为阴性对照。
图11：CD4 CK胞内染色法(ICS)检测IFN-γ、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF- α)的结果。
图12：CD8 CK胞内染色法(ICS)检测IFN-γ、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF- α)的结果。
图13：用甲醛变性胶检测加帽纯化后的mRNA，其中，M为Marker，1为实施例1制备的编码 682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA，2为编码 682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的 mRNA，3为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS-CoV-2的RBD序列的mRNA。结果显示，mRNA 的大小正确且基本无降解。
图14：WB检测结果，其中1为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS-CoV-2的RBD序 列的mRNA的表达上清，2为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象 的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA的表达上清，3为阴性对照的细胞上清，4为编码含IgE信号肽 的501Y.V2谱系的野生型SARS-CoV-2的RBD序列的mRNA的表达细胞沉淀，5为编码682RRAR685突变 为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA的表达细胞 沉淀，6为阴性对照的细胞沉淀。
图15：DLS(Dynamic Light Scattering，动态光散射)检测mRNA-LNP的粒径和粒径分布结果。
图16：一免、二免后针对501Y.V2谱系的S蛋白特异性抗体滴度。
图17：一免、二免后针对Wuhan-Hu-1isolate的S蛋白特异性抗体滴度。
图18：替代性中和抗体滴度结果，左边4组为针对Wuhan-Hu-1isolate的替代性中和抗体滴度， 右边4组为针对501Y.V2谱系的替代性中和抗体滴度。
图19：CD4+T细胞Th1类细胞免疫反应检测结果。
图20：CD8+T细胞Th1类细胞免疫反应检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人 员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中使用的试剂来源：
替代性中和抗体检测是检测的疫苗免疫小鼠血清中的中和抗体，利用的是ACE2蛋白和RBD蛋白的 竞争结合。
特异性抗体体检测是检测的疫苗免疫小鼠血清中的特异性抗体，利用的是RBD蛋白。
检测针对Wuhan-Hu-1isolate用到的RBD蛋白为野生型RBD蛋白(厂家：金斯瑞，货号：Z03483-1)。
检测针对501Y.V2谱系用到的RBD蛋白为含501Y.V2谱系突变的RBD蛋白(厂家：近岸，货号： DRA125)。
实施例1：mRNA的制备与检测
1、分别人工合成抗原设计的基因序列。
2、通过固相亚磷酰胺三酯法合成短核苷酸链(引物)。
3、引物互为模板进行PCR扩增。
4、将步骤3扩增的产物连接到pUC57载体上，转化测序。
5、经测序验证，序列与预期一致，结果见图1-2所示。具体的，图1显示了编码含tPA信号肽的 野生型SARS-CoV-2的RBD的序列测序结果，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。图2显示编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全 长S蛋白的序列测序结果，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
6、准备含有T7启动子，5’UTR，3’UTR，和polyA尾的基础质粒模板，序列如图3(SEQID NO： 8)所示。
7、用含有与基础质粒模板同源的引物进行PCR，结果显示正确。
基础质粒模板用限制性核酸内切酶BsmBI线性化。将PCR产物分别通过同源重组的方式分别连到 基础质粒模板上，分别转化到Xl1-Blue菌株中，并进行测序确认序列正确，转录模板构建成功。用摇 瓶发酵菌株，用无内毒素质粒大提试剂盒纯化获得转录模板。
将转录模板用限制性核酸内切酶BbsI线性化。用T7体外转录试剂盒进行转录，分别获得SEQ ID NO：4-5的未加帽的mRNA(mRNA具体序列分别为SEQ ID NO：16-17)。分别用DNaseI消化转录模板， 并用沉淀法纯化mRNA。用Cap1加帽试剂盒给mRNA加帽，并分别用mRNA纯化试剂盒对加帽后的mRNA 进行纯化。将纯化后的mRNA溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中，待用。
用甲醛变性胶检测加帽纯化后的mRNA，如图4所示，其中1为编码含tPA信号肽的野生型 SARS-CoV-2的RBD的mRNA，2为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前 构象的全长S蛋白的mRNA。结果显示，mRNA的大小正确且基本无降解。
用24孔板铺3个孔的HEK293细胞，其中1、2号孔分别用lipofectamine 2000转染0.5μg加帽 纯化后的编码含tPA信号肽的野生型SARS-CoV-2的RBD的mRNA，和编码682RRAR685突变为GSAG和 986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA，3号孔作为阴性对照加入lipofectamine 2000转染试剂。转染24h后，取1、3号孔的细胞上清进行WB检测，2、3号孔的细胞固定后用抗S 蛋白多抗进行免疫荧光检测。WB检测结果如图5所示，其中1为编码含tPA信号肽的野生型SARS-CoV-2 的RBD的mRNA的表达上清，2为阴性对照。结果显示表达出来的蛋白大小正确。免疫荧光结果如图6 所示，证明编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA可以正常表达。
实施例2：mRNA疫苗的制备与免疫
1、原料准备
1)将阳离子脂质D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酰基磷脂酰胆碱DSPC、胆固醇、PEG化脂质PEG-DMG四 个组分按摩尔比50:10:38.5:1.5在乙醇中溶解、混合。
2)实施例1制备的编码含tPA信号肽的野生型SARS-CoV-2的RBD的mRNA和编码682RRAR685突 变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA，将这两种mRNA分别按质 量比1:1、2:1、1：2进行混合，得到混合后的mRNA，简写为RBD+S-1、RBD+S-2和RBD+S-3。
2、试验步骤
以脂质混合物：mRNA流速比1:3，在Precision Nanosystems的纳米颗粒制备仪器Ignite中分别 混合包装RBD+S-1、RBD+S-2、RBD+S-3、编码含tPA信号肽的野生型SARS-CoV-2的RBD的mRNA和编 码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA。将包装 好的mRNA-LNP(LNP为脂质纳米颗粒)透析并超滤浓缩到DPBS中，无菌过滤后获得用于后续动物实验 的样品。用DLS检测mRNA-LNP的粒径和粒径分布，检测结果如图7所示，包装后样品的粒径大小均在 70nm-100nm，PDI均小于0.2。其中，RBD+S-1-LNP：粒径平均值77.15nm，PDI值0.038，截距(intercept) 0.958，具体见表1；RBD+S-2-LNP：粒径平均值77.04nm，PDI值0.055，截距(intercept)0.959， 具体见表2；RBD+S-3-LNP：粒径平均值91.43nm，PDI值0.049，截距(intercept)0.974，具体见表 3；RBD-LNP：粒径平均值77.92nm，PDI值0.036，截距(intercept)0.954，具体见表4；S-LNP：粒 径平均值76.89nm，PDI值0.031，截距(intercept)0.977，具体见表5。
表1：RBD+S-1-LNP
粒径(nm)
强度(％)
标准差
峰1
81.06
100
18.64
峰2
0
0
0
峰3
0
0
0
表2：RBD+S-2-LNP
表3：RBD+S-3-LNP
粒径(nm)
强度(％)
标准差
峰1
97
100
24.54
峰2
0
0
0
峰3
0
0
0
表4：RBD-LNP
粒径(nm)
强度(％)
标准差
峰1
82.01
100
19.41
峰2
0
0
0
峰3
0
0
0
表5：S-LNP
粒径(nm)
强度(％)
标准差
峰1
80.72
100
18.76
峰2
0
0
0
峰3
0
0
0
用甲醛变性胶检测包装后样品的mRNA完整性，结果如图8所示，其中1为编码含tPA信号肽的野 生型SARS-CoV-2的RBD的mRNA，2为RBD+S-1，3为RBD+S-2，4为RBD+S-3，5为编码682RRAR685 突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA。可见mRNA基本无降解。
6周龄左右的BALB/c雌性小鼠随机6只一组，分为6组。分别在第0天和第28天免疫后腿肌肉 接种10ug，在第28天和第42天检测S蛋白特异性抗体滴度，在第42天杀鼠检测细胞因子。
3、实验结果
一免、二免后的S蛋白特异性抗体滴度如图9所示，可以看到单S全长免疫二免后的特异性抗体 滴度显著低于单RBD免疫，而三组S与RBD的组合免疫，其中两组与单RBD免疫的特异性抗体滴度无 显著性差异，RBD+S-1出现了协同增益的效果，特异性抗体滴度显著高于单RBD免疫。用ELISpot检 测干扰素γ(IFN-γ)的结果如图10所示，可以看到单S全长免疫引起的IFN-γ分泌水平显著高于 单RBD免疫，而三组S与RBD的组合免疫，其中两组与单S全长免疫的IFN-γ分泌水平无显著性差异， RBD+S-3出现了协同增益的效果，IFN-γ分泌水平显著高于单S全长免疫。用CK胞内染色法(ICS) 检测IFN-γ、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的结果如图11和图12所示。CD4+T 细胞的反应较低，个体差异较大，指导意义较小；而CD8+T细胞的检测结果与ELISpot的检测结果基 本一致，三组S与RBD的组合免疫，其中两组与单S全长免疫在IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌水平 上无显著性差异，而RBD+S-3出现了显著性的协同增益的效果。证明S全长和RBD的组合不仅可以结 合S全长的细胞免疫优势和RBD的体液免疫优势，而且可以达到协同增益的效果，可在2019-nCoV型 冠状病毒感染的预防上取得更为优异的效果。
实施例3：序列来源于不同SARS-CoV-2突变株的mRNA的制备与检测
1、通过引物互为模板扩增合成编码含IgE信号肽的的野生型SARS-CoV-2的RBD序列，其中含有 501Y.V2谱系的K417N、E484K和N501Y突变，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示。
2、通过引物互为模板扩增合成编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合 前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的序列，其中含有501Y.V2谱系的L18F、D80A、D215G、L242-L244 删除突变(L242-244del)、R246I、K417N、E484K、N501Y和A701V，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14 所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
3、准备含有T7启动子，5’UTR，3’UTR，和polyA尾的基础质粒模板，序列如图3(SEQID NO： 8)所示。
4、用含有与基础质粒模板同源的引物进行PCR，结果显示正确。
基础质粒模板用限制性核酸内切酶BsmBI线性化。将PCR产物分别通过同源重组的方式分别连到 基础质粒模板上，分别转化到Xl1-Blue菌株中，并进行测序确认序列正确，转录模板构建成功。用摇 瓶发酵菌株，用无内毒素质粒大提试剂盒纯化获得转录模板。
将转录模板用限制性核酸内切酶BbsI线性化。用T7体外转录试剂盒进行转录，分别获得SEQ ID NO：12、14的未加帽的mRNA(mRNA具体序列分别为SEQ ID NO：18、19)。分别用DNaseI消化转录模 板，并用沉淀法纯化mRNA。用Cap1加帽试剂盒给mRNA加帽，并分别用mRNA纯化试剂盒对加帽后的 mRNA进行纯化。将纯化后的mRNA溶解于酸性柠檬酸钠缓冲液中，待用。
用甲醛变性胶检测加帽纯化后的mRNA，如图13所示，其中1为实施例1制备的编码682RRAR685 突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的全长S蛋白的mRNA，2为编码682RRAR685 突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA，3为编 码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS-CoV-2的RBD序列的mRNA。结果显示，mRNA的大小正 确且基本无降解。
用24孔板铺3个孔的HEK293细胞，其中1、2号孔分别用lipofectamine 2000转染0.5μg加帽 纯化后的编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS-CoV-2的RBD序列的mRNA，和编码 682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的 mRNA，3号孔作为阴性对照。转染24h后，离心获得细胞上清和细胞沉淀分别进行WB检测。WB检测结 果如图14所示，其中1为编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS-CoV-2的RBD序列的mRNA 的表达上清，2为编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2 谱系的全长S蛋白的mRNA的表达上清，3为阴性对照的细胞上清，4为编码含IgE信号肽的501Y.V2 谱系的野生型SARS-CoV-2的RBD序列的mRNA的表达细胞沉淀，5为编码682RRAR685突变为GSAG和 986KV987突变为PP的固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA的表达细胞沉淀，6为 阴性对照的细胞沉淀。结果显示表达出来的蛋白大小正确。
实施例4：序列来源于不同SARS-CoV-2突变株的mRNA组合疫苗的制备与免疫
1、原料准备
1)将阳离子脂质D-Lin-MC3-DMA、二硬脂酰基磷脂酰胆碱DSPC、胆固醇、PEG化脂质PEG-DMG四 个组分按摩尔比50:10:38.5:1.5在乙醇中溶解、混合。
2)准备实施例1制备的编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象 的全长S蛋白的mRNA，实施例3制备的编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在 融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA，和实施例3制备的编码含IgE信号肽的501Y.V2谱 系的野生型SARS-CoV-2的RBD序列的mRNA。
3)将实施例3制备的编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的 501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA和实施例3制备的编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型 SARS-CoV-2的RBD序列的mRNA按质量比1：2进行混合，得到混合后的mRNA，简写为combo A。
4)将实施例1制备的编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的固定在融合前构象的 全长S蛋白的mRNA和实施例3制备的编码含IgE信号肽的501Y.V2谱系的野生型SARS-CoV-2的RBD 序列的mRNA按质量比1：2进行混合，得到混合后的mRNA，简写为combo B。
2、试验步骤
以脂质混合物：mRNA流速比1:3，在Precision Nanosystems的纳米颗粒制备仪器Ignite中分别 混合包装combo A、combo B、实施例3制备的编码682RRAR685突变为GSAG和986KV987突变为PP的 固定在融合前构象的501Y.V2谱系的全长S蛋白的mRNA，和实施例3制备的编码含IgE信号肽的 501Y.V2谱系的野生型SARS-CoV-2的RBD序列的mRNA，得到包装好的mRNA-LNP，分别简写为combo A-LNP，combo B-LNP，S-SA-LNP和RBD-SA-LNP。将包装好的mRNA-LNP透析并超滤浓缩到DPBS中，无 菌过滤后获得用于后续动物实验的样品。用DLS检测mRNA-LNP的粒径和粒径分布，检测结果如图15 所示，包装后样品的粒径大小均在70nm-100nm，PDI均小于0.2。其中，combo A-LNP：粒径平均值79.87nm， PDI值0.132，截距(intercept)0.962，具体见表6；combo B-LNP：粒径平均值80.61nm，PDI值0.123， 截距(intercept)0.958，具体见表7；S-SA-LNP：粒径平均值81.13nm，PDI值0.159，截距(intercept) 0.939，具体见表8；RBD-SA-LNP：粒径平均值82.74nm，PDI值0.112，截距(intercept)0.960，具 体见表9。
表6：combo A-LNP
粒径(nm)
强度(％)
标准差
峰1
91.43
100
32.02
峰2
0
0
0
峰3
0
0
0
表7：comboB-LNP
粒径(nm)
强度(％)
标准差
峰1
91.05
100
30.06
峰2
0
0
0
峰3
0
0
0
表8：S-SA-LNP
粒径(nm)
强度(％)
标准差
峰1
93.36
100
33.28
峰2
0
0
0
峰3
0
0
0
表9：RBD-SA-LNP
粒径(nm)
强度(％)
标准差
峰1
92.91
100
30.56
峰2
0
0
0
峰3
0
0
0
6周龄左右的BALB/c雌性小鼠随机6只一组，分为5组。分别在第0天和第14天免疫后腿肌肉 接种5ug，在第14天和第28天检测S蛋白特异性抗体滴度，在第28天杀鼠检测细胞因子。
3、实验结果
一免、二免后针对501Y.V2谱系的S蛋白特异性抗体滴度如图16所示，各组之间没有显著性差异。 一免、二免后针对Wuhan-Hu-1isolate的S蛋白特异性抗体滴度如图17所示，结果显示，两组S与 RBD组合免疫引起的特异性抗体滴度无显著性差异，但单S全长和单RBD二免后的特异性抗体滴度均 显著低于来源于不同SARS-CoV-2突变株的mRNA组合(combo B)。而替代性中和抗体滴度结果也显示 (如图18，左边4组为针对Wuhan-Hu-1isolate的替代性中和抗体滴度，右边4组为针对501Y.V2 谱系的替代性中和抗体滴度)，combo B针对Wuhan-Hu-1isolate的替代性中和抗体滴度显著高于来 源于相同SARS-CoV-2突变株(501Y.V2谱系)的mRNA组合(combo A)、单S全长和单RBD；combo B 针对501Y.V2谱系的替代性中和抗体滴度则和combo A及单RBD无显著性差异，显著高于单S全长。 说明S全长和RBD的组合相对于单S全长有体液免疫优势，且来源于不同SARS-CoV-2突变株的mRNA 组合在体液免疫方面相比于来源于相同SARS-CoV-2突变株的mRNA组合可以提供更好地交叉保护效果。
CD4+T细胞Th1类细胞免疫反应检测结果如图19所示，CD8+T细胞Th1类细胞免疫反应检测结果 如图20所示，结果显示，S全长和RBD的组合相对于单RBD有细胞免疫优势。再次验证了S全长和RBD 的组合设计在疫苗应用方面的优越性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在 本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明 的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可 以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说 明。
序列表
<110> 康希诺生物股份公司
<120> mRNA或mRNA组合物及其制备方法和应用
<130> 1
<150> 2020104199842
<151> 2020-05-18
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
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Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
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Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
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<210> 2
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
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Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
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Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
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355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
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405 410 415
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Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
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Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
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485 490 495
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595 600 605
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Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
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Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
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<210> 3
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe
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Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala
65 70 75 80
Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp
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100 105 110
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115 120 125
Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala
130 135 140
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro
165 170 175
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180 185 190
Val Cys Gly Pro Lys Lys
195
<210> 4
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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tccgtgtatg cctggaaccg gaagagaatc tccaattgcg tggccgacta ttctgtgctg 180
tacaattctg ccagcttctc cacctttaag tgctatggcg tgtctcctac caagctgaac 240
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<210> 5
<211> 3786
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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gatctgtttc tgccattctt tagcaacgtg acctggttcc acgccatcca cgtgtccggc 180
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gctagcaccg agaagtccaa catcatccgc ggctggatct ttggcaccac actggactct 300
aagacacaga gcctgctgat cgtgaacaat gccaccaacg tggtcatcaa ggtgtgcgag 360
ttccagtttt gtaatgatcc cttcctgggc gtgtactatc acaagaacaa taagtcctgg 420
atggagtctg agtttagggt gtattcctct gccaacaatt gcacatttga gtacgtgtcc 480
cagcctttcc tgatggacct ggagggcaag cagggcaatt tcaagaacct gcgggagttc 540
gtgtttaaga atatcgatgg ctacttcaag atctactcca agcacacccc tatcaacctg 600
gtgagggacc tgccacaggg cttctctgcc ctggagcctc tggtggatct gccaatcggc 660
atcaacatca ccagatttca gacactgctg gctctgcacc gcagctacct gacacccggc 720
gacagctcct ctggatggac cgctggagct gctgcttact atgtgggcta tctgcagcct 780
cggaccttcc tgctgaagta caacgagaat ggcaccatca cagacgctgt ggattgcgcc 840
ctggatcctc tgagcgagac caagtgtaca ctgaagtcct ttaccgtgga gaagggcatc 900
tatcagacat ccaatttccg ggtgcagcca accgagtcta tcgtgaggtt tccaaatatc 960
acaaacctgt gcccctttgg cgaggtgttc aacgctacca ggttcgccag cgtgtacgct 1020
tggaatagaa agcgcatctc taactgcgtg gctgactata gcgtgctgta caacagcgcc 1080
tccttctcta cctttaagtg ctatggcgtg agccctacaa agctgaatga cctgtgcttt 1140
accaacgtgt acgccgattc cttcgtgatc agaggcgacg aggtgcgcca gatcgctcca 1200
ggacagacag gcaagatcgc cgactacaat tataagctgc ccgacgattt caccggctgc 1260
gtgatcgcct ggaactccaa caatctggat tctaaagtgg gcggcaacta caattatctg 1320
taccggctgt ttaggaagtc caatctgaag cccttcgagc gggacatctc tacagagatc 1380
taccaggccg gcagcacccc ttgcaatggc gtggagggct ttaactgtta tttccccctg 1440
cagtcttacg gcttccagcc tacaaacggc gtgggctatc agccatacag ggtggtggtg 1500
ctgtcttttg agctgctgca cgctccagct acagtgtgcg gacctaagaa gagcaccaat 1560
ctggtgaaga acaagtgcgt gaacttcaac ttcaacggac tgaccggaac aggcgtgctg 1620
accgagtcta acaagaagtt cctgccattt cagcagttcg gccgggacat cgccgatacc 1680
acagacgctg tgagggaccc ccagaccctg gagatcctgg atatcacacc ttgcagcttc 1740
ggcggcgtgt ccgtgatcac accaggaacc aatacaagca accaggtggc cgtgctgtat 1800
caggacgtga attgtaccga ggtgccagtg gctatccacg ccgatcagct gacccccaca 1860
tggagagtgt actctaccgg cagcaacgtg tttcagacaa gggctggatg tctgatcgga 1920
gctgagcacg tgaacaatag ctatgagtgc gacatcccaa tcggcgccgg catctgtgct 1980
tcctaccaga cccagacaaa ctctccaggc tccgccggca gcgtggctag ccagtccatc 2040
atcgcttata ccatgtccct gggcgccgag aattctgtgg cttactccaa caattctatc 2100
gccatcccca ccaacttcac aatcagcgtg accacagaga tcctgcccgt gagcatgacc 2160
aagacaagcg tggactgcac aatgtatatc tgtggcgata gcaccgagtg ctccaacctg 2220
ctgctgcagt acggctcctt ttgtacccag ctgaatcgcg ccctgacagg catcgctgtg 2280
gagcaggata agaacacaca ggaggtgttc gcccaggtga agcagatcta caagacccca 2340
cccatcaagg actttggcgg cttcaatttt tcccagatcc tgcccgatcc tagcaagcct 2400
tccaagagat cttttatcga ggacctgctg ttcaacaagg tgaccctggc tgatgccggc 2460
ttcatcaagc agtatggcga ttgcctgggc gacatcgctg ctagggacct gatctgtgct 2520
cagaagttta atggcctgac cgtgctgcct ccactgctga cagatgagat gatcgctcag 2580
tacacaagcg ccctgctggc tggaaccatc acatccggat ggaccttcgg cgctggagct 2640
gccctgcaga tcccatttgc catgcagatg gcttatagat tcaacggcat cggcgtgacc 2700
cagaatgtgc tgtacgagaa ccagaagctg atcgccaatc agtttaactc cgctatcggc 2760
aagatccagg acagcctgag cagcacagct tccgccctgg gcaagctgca ggatgtggtg 2820
aatcagaacg ctcaggccct gaataccctg gtgaagcagc tgtctagcaa cttcggcgct 2880
atctcctctg tgctgaatga tatcctgagc cggctggacc ctccagaggc tgaggtgcag 2940
atcgaccggc tgatcacagg caggctgcag tccctgcaga cctatgtgac acagcagctg 3000
atcagagctg ccgagatccg cgcttctgcc aatctggctg ccaccaagat gtccgagtgc 3060
gtgctgggcc agtctaagcg cgtggacttt tgtggcaagg gctatcacct gatgtctttc 3120
ccacagagcg ccccacacgg agtggtgttt ctgcacgtga cctacgtgcc tgcccaggag 3180
aagaacttca ccacagctcc agccatctgc cacgatggca aggcccactt tccacgggag 3240
ggcgtgttcg tgagcaacgg cacccactgg tttgtgacac agaggaattt ctacgagccc 3300
cagatcatca ccacagacaa taccttcgtg agcggcaact gtgacgtggt catcggcatc 3360
gtgaacaata ccgtgtatga tcctctgcag ccagagctgg actcttttaa ggaggagctg 3420
gataagtact tcaagaatca caccagcccc gacgtggatc tgggcgacat ctccggcatc 3480
aatgcttctg tggtgaacat ccagaaggag atcgaccgcc tgaacgaggt ggccaagaat 3540
ctgaacgaga gcctgatcga tctgcaggag ctgggcaagt atgagcagta catcaagtgg 3600
ccctggtata tctggctggg cttcatcgcc ggcctgatcg ccatcgtgat ggtgaccatc 3660
atgctgtgct gtatgacaag ctgctgttcc tgcctgaagg gctgctgttc ttgtggcagc 3720
tgctgtaagt ttgatgagga cgatagcgag cctgtgctga agggcgtgaa gctgcactac 3780
acctga 3786
<210> 6
<211> 3786
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcccagtgcg tgaacctgac cacaaggacc cagctgcccc ctgcctatac caattccttc 60
acacggggcg tgtactatcc cgacaaggtg tttagatcta gcgtgctgca ctccacacag 120
gatctgtttc tgcctttctt ttctaacgtg acctggttcc acgccatcca cgtgagcggc 180
accaatggca caaagcggtt cgacaatcca gtgctgccct ttaacgatgg cgtgtacttc 240
gcctccaccg agaagtctaa catcatcaga ggctggatct ttggcaccac actggacagc 300
aagacacagt ccctgctgat cgtgaacaat gccaccaacg tggtcatcaa ggtgtgcgag 360
ttccagtttt gtaatgatcc attcctgggc gtgtactatc acaagaacaa taagtcttgg 420
atggagagcg agtttcgcgt gtattcctct gccaacaatt gcacatttga gtacgtgtcc 480
cagcccttcc tgatggacct ggagggcaag cagggcaatt tcaagaacct gagggagttc 540
gtgtttaaga atatcgatgg ctacttcaag atctactcca agcacacccc aatcaacctg 600
gtgcgcgacc tgccacaggg cttctctgcc ctggagccac tggtggatct gcccatcggc 660
atcaacatca cccggtttca gacactgctg gccctgcaca gaagctacct gacaccaggc 720
gacagctcct ctggatggac cgcaggagca gcagcctact atgtgggcta tctgcagccc 780
aggaccttcc tgctgaagta caacgagaat ggcaccatca cagacgccgt ggattgcgcc 840
ctggatcccc tgtctgagac caagtgtaca ctgaagagct ttaccgtgga gaagggcatc 900
tatcagacaa gcaatttcag ggtgcagcct accgagtcca tcgtgcgctt tcccaatatc 960
acaaacctgt gcccttttgg cgaggtgttc aacgcaacca ggttcgcaag cgtgtacgca 1020
tggaatagga agcgcatctc caactgcgtg gccgactatt ctgtgctgta caacagcgcc 1080
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ggacagacag gcaagatcgc agactacaat tataagctgc ctgacgattt caccggctgc 1260
gtgatcgcct ggaactctaa caatctggat agcaaagtgg gcggcaacta caattatctg 1320
taccggctgt ttagaaagtc taatctgaag ccattcgaga gggacatctc cacagagatc 1380
taccaggccg gctctacccc ctgcaatggc gtggagggct ttaactgtta tttccctctg 1440
cagagctacg gcttccagcc aacaaacggc gtgggctatc agccctaccg cgtggtggtg 1500
ctgtcttttg agctgctgca cgcacctgca acagtgtgcg gaccaaagaa gagcaccaat 1560
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cagaagttta atggcctgac cgtgctgcct ccactgctga cagatgagat gatcgcccag 2580
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cagaatgtgc tgtacgagaa ccagaagctg atcgccaatc agtttaactc cgccatcggc 2760
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aatcagaacg cccaggccct gaataccctg gtgaagcagc tgtctagcaa cttcggcgcc 2880
atctcctctg tgctgaatga catcctgagc aggctggaca aggtggaggc agaggtgcag 2940
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atcagggcag cagagatcag ggcatctgcc aatctggccg ccaccaagat gagcgagtgc 3060
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ccacagtccg cccctcacgg agtggtgttt ctgcacgtga cctacgtgcc agcccaggag 3180
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ggcgtgttcg tgagcaacgg cacccactgg tttgtgacac agcgcaattt ctacgagcca 3300
cagatcatca ccacagacaa tacattcgtg tccggcaact gtgacgtggt catcggcatc 3360
gtgaacaata ccgtgtatga tcctctgcag ccagagctgg actcttttaa ggaggagctg 3420
gataagtact tcaagaatca caccagcccc gacgtggatc tgggcgacat ctctggcatc 3480
aatgccagcg tggtgaacat ccagaaggag atcgacaggc tgaacgaggt ggccaagaat 3540
ctgaacgagt ccctgatcga tctgcaggag ctgggcaagt atgagcagta catcaagtgg 3600
ccctggtata tctggctggg cttcatcgcc ggcctgatcg ccatcgtgat ggtgaccatc 3660
atgctgtgct gtatgacaag ctgctgttcc tgcctgaagg gctgctgttc ttgtggcagc 3720
tgctgtaagt ttgatgagga cgatagcgag cctgtgctga agggcgtgaa gctgcactac 3780
acctga 3786
<210> 7
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atggattgga cgtggatctt gttcctggtg gcggcggcca ccagggtaca ttccatcacc 60
aatctatgcc cgtttggcga ggtgttcaac gccacgcgat ttgcctcagt ttacgcctgg 120
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tttagcacgt tcaagtgcta tggggtgtcg cccacaaaac tgaatgatct gtgtttcacc 240
aacgtatatg ctgattcgtt tgtgattcgg ggcgatgaag tgaggcagat cgcgcctggc 300
cagacgggca agatcgccga ctacaactac aagttgccgg acgattttac aggctgtgtg 360
attgcgtgga acagtaacaa cctcgactcc aaggtagggg gtaactacaa ctacctgtat 420
agactctttc gaaagtccaa cttgaagcca ttcgagcggg acatttcgac agagatctat 480
caggcaggta gtaccccctg caatggagtc gagggcttca attgttactt tccactgcag 540
tcatacggct tccaacctac taatggggtc gggtaccagc cgtaccgcgt ggtggtgctc 600
agctttgagc tcctccacgc gccggctacg gtatgcggcc ccaagaagta g 651
<210> 8
<211> 319
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (308)..(312)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 8
taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaagaaga gtaagaagaa atataagagc 60
caccggagac ggattgattg ccgtctcctg ataataggct ggagcctcgg tggccatgct 120
tcttgcccct tgggcctccc cccagcccct cctccccttc ctgcacccgt acccccgtgg 180
tctttgaata aagtctgagt gggcggcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 300
aaaaaaannn nnggtcttc 319
<210> 9
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggactgga cctggatcct cttcctcgtg gccgccgcca cccgcgtgca cagcatcacc 60
aacctgtgcc ccttcggcga ggtgtttaac gccacacgct ttgcctccgt gtatgcctgg 120
aaccggaaga gaatctccaa ttgcgtggcc gactattctg tgctgtacaa ttctgccagc 180
ttctccacct ttaagtgcta tggcgtgtct cctaccaagc tgaacgacct gtgcttcaca 240
aacgtgtacg ccgacagctt tgtgatccgg ggcgatgagg tgagacagat cgcaccagga 300
cagaccggca agatcgcaga ctacaactat aagctgcccg acgatttcac aggctgcgtg 360
atcgcctgga attctaacaa tctggatagc aaagtgggcg gcaactacaa ttatctgtac 420
aggctgttcc gcaagagcaa cctgaagcct tttgagcggg acatcagcac cgagatctac 480
caggccggct ccacaccatg caacggcgtg gagggcttca attgttattt tccactgcag 540
tcctacggct tccagcccac caatggcgtg ggctatcagc cttaccgggt ggtggtgctg 600
tcttttgagc tgctgcacgc accagcaaca gtgtgcggac ctaagaagtg a 651
<210> 10
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggactgga cctggatcct cttcctcgtg gccgccgcca cccgggtgca cagcatcacc 60
aacctctgcc ccttcgggga ggtcttcaac gccacccgct tcgccagcgt ctacgcctgg 120
aaccgcaagc gcatctccaa ctgcgtggcc gactacagcg tgctgtacaa cagcgcctcc 180
ttctccacct tcaagtgcta cggggtcagc cccaccaagc tgaacgacct ctgcttcacc 240
aacgtctacg cggactcctt cgtcatccgg ggggacgagg tgcggcagat cgccccgggc 300
cagacgggca agatcgccga ctacaactac aagctgccgg acgacttcac gggctgcgtc 360
atcgcctgga acagcaacaa cctggacagc aaggtgggcg gcaactacaa ctacctgtac 420
cgcctcttcc gcaagtccaa cctgaagccc ttcgagcggg acatctccac ggagatctac 480
caggcgggct ccaccccctg caacggggtg gagggcttca actgctactt ccccctgcag 540
agctacggct tccagcccac caacggggtg ggctaccagc cctaccgggt ggtggtgctg 600
tccttcgagc tgctgcacgc gccggccacc gtgtgcgggc ccaagaagtg a 651
<210> 11
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggactgga cctggatcct cttcctggtg gccgccgcca cccgggtgca cagcatcacc 60
aacctctgcc ccttcgggga ggtcttcaac gccacccgct tcgccagcgt ctacgcctgg 120
aaccgcaagc gcatctccaa ctgcgtggcc gactacagcg tgctgtacaa cagcgcctcc 180
ttctccacct tcaagtgcta cggggtcagc cccaccaagc tgaacgacct ctgcttcacc 240
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cgcctcttcc gcaagtccaa cctgaagccc ttcgagcggg acatctccac ggagatctac 480
caggcgggct ccaccccctg caacggggtg gagggcttca actgctactt ccccctgcag 540
agctacggct tccagcccac caacggggtg ggctaccagc cctaccgggt ggtggtgctg 600
tccttcgagc tgctgcacgc gccggccacc gtgtgcgggc ccaagaagtg a 651
<210> 12
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggactgga cctggatcct gttcctggtc gccgctgcca cccgggtgca cagcagagtg 60
cagcccaccg agtctatcgt gcggtttccc aacatcacca acctctgtcc tttcggcgaa 120
gtctttaacg ccacaagatt cgccagcgtt tacgcctgga ataggaaaag aatcagcaat 180
tgcgtggccg actacagcgt gctgtacaac agcgcctctt tcagcacctt caagtgttac 240
ggagtgtccc ctacaaagct gaacgacctg tgcttcacaa acgtgtacgc tgattctttt 300
gtgattagag gcgacgaggt gcggcagatc gcccctggcc agaccggcaa catcgctgat 360
tacaactata agctgcctga cgacttcacc ggatgtgtga tcgcctggaa cagcaataac 420
ctggactcca aggtgggagg caattacaac tacctgtacc ggctgttcag aaagtccaac 480
ctgaagccct tcgaaagaga tatcagcaca gagatctacc aggccggcag caccccatgc 540
aacggcgtga agggcttcaa ctgctacttc cccctgcaga gctacggctt tcagcctacc 600
tacggcgtgg gttatcaacc atacagagtg gtggtcctga gcttcgagct gctgcacgcc 660
cctgccaccg tgtgcggccc taagaaatct acaaatctgg tgaaaaacaa gtgcgtgaac 720
ttctaa 726
<210> 13
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1 5 10 15
His Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
20 25 30
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
35 40 45
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
50 55 60
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
65 70 75 80
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
85 90 95
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
100 105 110
Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
115 120 125
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
130 135 140
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
145 150 155 160
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
165 170 175
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
180 185 190
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
195 200 205
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
210 215 220
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
225 230 235 240
Phe
<210> 14
<211> 3813
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgttcgtgt ttctggtgct gctgcccctg gtgagctccc agtgcgtgaa tttcaccacc 60
agaacccagc tgccacctgc ctataccaac agtttcacca gaggcgtgta ctaccccgat 120
aaggtgttta gatccagcgt gctgcacagc acccaagacc tgtttctgcc cttcttcagc 180
aacgtgacct ggttccacgc tatccacgtg agcggcacca acggcactaa gaggttcgcc 240
aatcctgtgc tgcctttcaa cgacggcgta tattttgcca gcaccgaaaa gagcaacatc 300
atcagaggat ggatcttcgg aaccaccctg gacagcaaga cccagagcct gctgatcgtg 360
aacaacgcca ccaacgtggt gatcaaggtg tgtgaattcc aattctgcaa cgaccctttc 420
ctgggagtct actaccacaa gaacaacaag agctggatgg aatccgagtt cagagtgtac 480
tctagcgcta ataactgcac ctttgagtac gtgagccagc cattcctgat ggacctggaa 540
ggcaagcaag gcaacttcaa gaatttgcgg gaattcgtct tcaaaaacat cgacggctac 600
ttcaagatct acagcaagca cacccccatc aacctggtca gaggactgcc tcaaggcttt 660
tctgctctgg aacctctagt tgacctgcct atcggcatta acatcacaag attccagaca 720
ctgcacatca gctacctgac ccctggagat agctctagcg gatggacagc cggcgctgcc 780
gcctactacg tgggatatct gcagcccaga acattcctgc tgaaatacaa cgagaacggt 840
acaatcaccg acgccgtgga ctgcgccctg gaccctctgt ctgagacaaa gtgcacgctg 900
aagtccttca cagtggaaaa gggcatctat cagaccagca atttccgcgt gcagcctacc 960
gagagcatag tgcggttccc caacatcacc aacctgtgtc cttttggcga ggtgttcaat 1020
gccacacggt tcgcctccgt gtacgcctgg aacagaaagc ggatcagcaa ttgcgtggcc 1080
gactactccg tgctgtacaa cagcgccagc ttcagcacct tcaagtgcta cggcgtgtcc 1140
cctacgaaac tgaacgatct gtgcttcacc aacgtgtacg ccgacagctt cgtgatccga 1200
ggcgacgagg tgagacagat cgcccctggc cagaccggca acatcgccga ttacaactac 1260
aagctgcctg acgacttcac cggctgcgtg atcgcctgga atagcaacaa cctggattct 1320
aaagtgggcg gcaattacaa ctacctgtac agactgttca gaaagtcgaa cctgaaacct 1380
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aaaggcttca actgttactt ccctctgcag agctacggct ttcagccaac ctacggcgtc 1500
ggctaccagc catacagagt ggtagtgctc agcttcgagc tgctgcatgc ccccgccaca 1560
gtttgtggcc ctaagaaaag cacaaatctg gtgaagaaca agtgcgtgaa cttcaacttc 1620
aacggcctga caggcaccgg agtgctcacc gagagcaaca aaaagttcct gcctttccag 1680
cagtttggga gagatatcgc agacaccaca gatgccgtgc gggaccccca gaccctcgaa 1740
atcctggaca tcacaccttg tagctttgga ggcgtgtctg tgattacacc tggcacaaac 1800
acaagcaacc aggtggctgt gctgtaccaa ggcgtcaact gcaccgaagt gcccgtggct 1860
atccacgccg accagctgac cccgacctgg cgggtgtaca gcacaggcag taatgtgttt 1920
cagacccggg ccggctgtct gatcggagcc gagcacgtga acaacagcta cgagtgcgac 1980
atccccatcg gcgccggcat ctgcgcctct tatcagacac agacaaacag ccccggatct 2040
gctggcagcg ttgctagcca gtctatcatt gcctacacca tgtccctggg cgtggagaat 2100
tctgtggctt actccaacaa ttctatcgcc atccccacca acttcacaat cagcgtgacc 2160
acagagatcc tgcccgtgag catgaccaag acaagcgtgg actgcacaat gtatatctgt 2220
ggcgacagca ccgagtgctc caacctgctg ctgcagtacg gctccttttg tacccagctg 2280
aatcgcgccc tgacaggcat cgctgtggag caggacaaga acacacagga ggtgttcgcc 2340
caggtgaagc agatctacaa gaccccaccc atcaaggact ttggcggctt caatttttcc 2400
cagatcctgc ccgatcccag caagccttcc aagagatctt ttatcgagga cctgctgttc 2460
aacaaggtga ccctggccga tgccggcttc atcaagcagt atggcgattg cctgggcgac 2520
atcgctgcca gggacctgat ctgtgctcag aagttcaatg gcctgaccgt gctgcctcca 2580
ctgctgacag acgagatgat cgctcagtac acaagcgccc tgctggctgg aaccatcaca 2640
tccggctgga ccttcggcgc tggagctgcc ctgcagatcc catttgccat gcagatggct 2700
tacagattca acggcatcgg cgtgacccag aatgtgctgt acgagaacca gaagctgatc 2760
gccaatcagt tcaactccgc tatcggcaag atccaggaca gcctgagcag cacagcttcc 2820
gccctgggca agctgcagga tgtggtgaat cagaacgctc aggccctgaa taccctggtg 2880
aagcagctgt cgagcaactt cggcgctatc tcctctgtgc tgaacgatat cctgagccgg 2940
ctggaccctc cagaggcgga ggtgcagatc gaccggctga tcacaggcag gctgcagtcc 3000
ctgcagacct atgtgacaca gcagctgatc agagctgccg agatccgcgc ttctgccaat 3060
ctggctgcca ccaagatgtc cgagtgcgtg ctgggccagt cgaagcgcgt ggacttttgt 3120
ggcaagggct atcacctgat gtctttccca cagagcgccc cacacggagt ggtgtttctg 3180
cacgtgacct acgtgcctgc ccaggagaag aacttcacca cagctccagc catctgccac 3240
gatggcaagg cccactttcc acgggagggc gtgttcgtga gcaacggcac ccactggttt 3300
gtgacacaga ggaatttcta cgagccccag atcatcacca cagacaatac cttcgtgagc 3360
ggcaactgcg acgtggtcat cggcatcgtg aacaataccg tgtacgatcc tctgcagcca 3420
gagctggact ctttcaagga ggagctggac aagtacttca agaatcacac cagccccgac 3480
gtggatctgg gcgacatctc cggcatcaat gcttctgtgg tgaacatcca gaaggagatc 3540
gaccgcctga acgaggtggc caagaatctg aacgagagcc tgatcgatct gcaggagctg 3600
ggcaagtacg agcagtacat caagtggccc tggtatatct ggctgggctt catcgccggc 3660
ctgatcgcca tcgtgatggt gaccatcatg ctgtgctgta tgacaagctg ctgttcctgc 3720
ctgaagggct gctgttcttg tggcagctgc tgcaagttcg acgaggacga cagcgagcct 3780
gtgctgaagg gcgtgaagct gcactacacc taa 3813
<210> 15
<211> 1270
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Phe Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Ala
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Gly Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu His Ile Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr
245 250 255
Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe
260 265 270
Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys
275 280 285
Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr
290 295 300
Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr
305 310 315 320
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
325 330 335
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
340 345 350
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
355 360 365
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu
370 375 380
Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg
385 390 395 400
Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Asn Ile Ala
405 410 415
Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala
420 425 430
Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr
435 440 445
Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp
450 455 460
Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val
465 470 475 480
Lys Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro
485 490 495
Thr Tyr Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe
500 505 510
Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr
515 520 525
Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr
530 535 540
Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln
545 550 555 560
Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro
565 570 575
Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val
580 585 590
Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu
595 600 605
Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp
610 615 620
Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe
625 630 635 640
Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser
645 650 655
Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln
660 665 670
Thr Gln Thr Asn Ser Pro Gly Ser Ala Gly Ser Val Ala Ser Gln Ser
675 680 685
Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Val Glu Asn Ser Val Ala Tyr
690 695 700
Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr
705 710 715 720
Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr
725 730 735
Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln
740 745 750
Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala
755 760 765
Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln
770 775 780
Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser
785 790 795 800
Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu
805 810 815
Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys
820 825 830
Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys
835 840 845
Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp
850 855 860
Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr
865 870 875 880
Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala
885 890 895
Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val
900 905 910
Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile
915 920 925
Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys
930 935 940
Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val
945 950 955 960
Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp
965 970 975
Ile Leu Ser Arg Leu Asp Pro Pro Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg
980 985 990
Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln
995 1000 1005
Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr
1010 1015 1020
Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys
1025 1030 1035 1040
Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly
1045 1050 1055
Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe
1060 1065 1070
Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg
1075 1080 1085
Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg
1090 1095 1100
Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser
1105 1110 1115 1120
Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp
1125 1130 1135
Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr
1140 1145 1150
Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly
1155 1160 1165
Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn
1170 1175 1180
Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1185 1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly
1205 1210 1215
Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys
1220 1225 1230
Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly
1235 1240 1245
Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly
1250 1255 1260
Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 16
<211> 930
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggggaaauaa gagagaaaag aagaguaaga agaaauauaa gagccaccau ggacgccaug 60
aagaggggac ugugcugcgu gcugcugcug ugcggagccg uguucgugag caacuccauc 120
accaaccugu gccccuucgg cgagguguuu aacgccacac gcuuugccuc cguguaugcc 180
uggaaccgga agagaaucuc caauugcgug gccgacuauu cugugcugua caauucugcc 240
agcuucucca ccuuuaagug cuauggcgug ucuccuacca agcugaacga ccugugcuuc 300
acaaacgugu acgccgacag cuuugugauc cggggcgaug aggugagaca gaucgcacca 360
ggacagaccg gcaagaucgc agacuacaac uauaagcugc ccgacgauuu cacaggcugc 420
gugaucgccu ggaauucuaa caaucuggau agcaaagugg gcggcaacua caauuaucug 480
uacaggcugu uccgcaagag caaccugaag ccuuuugagc gggacaucag caccgagauc 540
uaccaggccg gcuccacacc augcaacggc guggagggcu ucaauuguua uuuuccacug 600
caguccuacg gcuuccagcc caccaauggc gugggcuauc agccuuaccg ggugguggug 660
cugucuuuug agcugcugca cgcaccagca acagugugcg gaccuaagaa gugauaauag 720
gcuggagccu cgguggccau gcuucuugcc ccuugggccu ccccccagcc ccuccucccc 780
uuccugcacc cguacccccg uggucuuuga auaaagucug agugggcggc aaaaaaaaaa 840
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 930
<210> 17
<211> 4086
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggggaaauaa gagagaaaag aagaguaaga agaaauauaa gagccaccau guucguguuu 60
cuggugcugc ugccccuggu gagcucccag ugcgugaacc ugaccacaag gacccagcug 120
ccaccugccu auaccaauag cuucacaaga ggcguguacu auccugacaa gguguuucgc 180
ucuagcgugc ugcacucuac acaggaucug uuucugccau ucuuuagcaa cgugaccugg 240
uuccacgcca uccacguguc cggcaccaau ggcacaaaga gauucgacaa uccagugcug 300
cccuuuaacg auggcgugua cuucgcuagc accgagaagu ccaacaucau ccgcggcugg 360
aucuuuggca ccacacugga cucuaagaca cagagccugc ugaucgugaa caaugccacc 420
aacgugguca ucaaggugug cgaguuccag uuuuguaaug aucccuuccu gggcguguac 480
uaucacaaga acaauaaguc cuggauggag ucugaguuua ggguguauuc cucugccaac 540
aauugcacau uugaguacgu gucccagccu uuccugaugg accuggaggg caagcagggc 600
aauuucaaga accugcggga guucguguuu aagaauaucg auggcuacuu caagaucuac 660
uccaagcaca ccccuaucaa ccuggugagg gaccugccac agggcuucuc ugcccuggag 720
ccucuggugg aucugccaau cggcaucaac aucaccagau uucagacacu gcuggcucug 780
caccgcagcu accugacacc cggcgacagc uccucuggau ggaccgcugg agcugcugcu 840
uacuaugugg gcuaucugca gccucggacc uuccugcuga aguacaacga gaauggcacc 900
aucacagacg cuguggauug cgcccuggau ccucugagcg agaccaagug uacacugaag 960
uccuuuaccg uggagaaggg caucuaucag acauccaauu uccgggugca gccaaccgag 1020
ucuaucguga gguuuccaaa uaucacaaac cugugccccu uuggcgaggu guucaacgcu 1080
accagguucg ccagcgugua cgcuuggaau agaaagcgca ucucuaacug cguggcugac 1140
uauagcgugc uguacaacag cgccuccuuc ucuaccuuua agugcuaugg cgugagcccu 1200
acaaagcuga augaccugug cuuuaccaac guguacgccg auuccuucgu gaucagaggc 1260
gacgaggugc gccagaucgc uccaggacag acaggcaaga ucgccgacua caauuauaag 1320
cugcccgacg auuucaccgg cugcgugauc gccuggaacu ccaacaaucu ggauucuaaa 1380
gugggcggca acuacaauua ucuguaccgg cuguuuagga aguccaaucu gaagcccuuc 1440
gagcgggaca ucucuacaga gaucuaccag gccggcagca ccccuugcaa uggcguggag 1500
ggcuuuaacu guuauuuccc ccugcagucu uacggcuucc agccuacaaa cggcgugggc 1560
uaucagccau acaggguggu ggugcugucu uuugagcugc ugcacgcucc agcuacagug 1620
ugcggaccua agaagagcac caaucuggug aagaacaagu gcgugaacuu caacuucaac 1680
ggacugaccg gaacaggcgu gcugaccgag ucuaacaaga aguuccugcc auuucagcag 1740
uucggccggg acaucgccga uaccacagac gcugugaggg acccccagac ccuggagauc 1800
cuggauauca caccuugcag cuucggcggc guguccguga ucacaccagg aaccaauaca 1860
agcaaccagg uggccgugcu guaucaggac gugaauugua ccgaggugcc aguggcuauc 1920
cacgccgauc agcugacccc cacauggaga guguacucua ccggcagcaa cguguuucag 1980
acaagggcug gaugucugau cggagcugag cacgugaaca auagcuauga gugcgacauc 2040
ccaaucggcg ccggcaucug ugcuuccuac cagacccaga caaacucucc aggcuccgcc 2100
ggcagcgugg cuagccaguc caucaucgcu uauaccaugu cccugggcgc cgagaauucu 2160
guggcuuacu ccaacaauuc uaucgccauc cccaccaacu ucacaaucag cgugaccaca 2220
gagauccugc ccgugagcau gaccaagaca agcguggacu gcacaaugua uaucuguggc 2280
gauagcaccg agugcuccaa ccugcugcug caguacggcu ccuuuuguac ccagcugaau 2340
cgcgcccuga caggcaucgc uguggagcag gauaagaaca cacaggaggu guucgcccag 2400
gugaagcaga ucuacaagac cccacccauc aaggacuuug gcggcuucaa uuuuucccag 2460
auccugcccg auccuagcaa gccuuccaag agaucuuuua ucgaggaccu gcuguucaac 2520
aaggugaccc uggcugaugc cggcuucauc aagcaguaug gcgauugccu gggcgacauc 2580
gcugcuaggg accugaucug ugcucagaag uuuaauggcc ugaccgugcu gccuccacug 2640
cugacagaug agaugaucgc ucaguacaca agcgcccugc uggcuggaac caucacaucc 2700
ggauggaccu ucggcgcugg agcugcccug cagaucccau uugccaugca gauggcuuau 2760
agauucaacg gcaucggcgu gacccagaau gugcuguacg agaaccagaa gcugaucgcc 2820
aaucaguuua acuccgcuau cggcaagauc caggacagcc ugagcagcac agcuuccgcc 2880
cugggcaagc ugcaggaugu ggugaaucag aacgcucagg cccugaauac ccuggugaag 2940
cagcugucua gcaacuucgg cgcuaucucc ucugugcuga augauauccu gagccggcug 3000
gacccuccag aggcugaggu gcagaucgac cggcugauca caggcaggcu gcagucccug 3060
cagaccuaug ugacacagca gcugaucaga gcugccgaga uccgcgcuuc ugccaaucug 3120
gcugccacca agauguccga gugcgugcug ggccagucua agcgcgugga cuuuuguggc 3180
aagggcuauc accugauguc uuucccacag agcgccccac acggaguggu guuucugcac 3240
gugaccuacg ugccugccca ggagaagaac uucaccacag cuccagccau cugccacgau 3300
ggcaaggccc acuuuccacg ggagggcgug uucgugagca acggcaccca cugguuugug 3360
acacagagga auuucuacga gccccagauc aucaccacag acaauaccuu cgugagcggc 3420
aacugugacg uggucaucgg caucgugaac aauaccgugu augauccucu gcagccagag 3480
cuggacucuu uuaaggagga gcuggauaag uacuucaaga aucacaccag ccccgacgug 3540
gaucugggcg acaucuccgg caucaaugcu ucugugguga acauccagaa ggagaucgac 3600
cgccugaacg agguggccaa gaaucugaac gagagccuga ucgaucugca ggagcugggc 3660
aaguaugagc aguacaucaa guggcccugg uauaucuggc ugggcuucau cgccggccug 3720
aucgccaucg ugauggugac caucaugcug ugcuguauga caagcugcug uuccugccug 3780
aagggcugcu guucuugugg cagcugcugu aaguuugaug aggacgauag cgagccugug 3840
cugaagggcg ugaagcugca cuacaccuga uaauaggcug gagccucggu ggccaugcuu 3900
cuugccccuu gggccucccc ccagccccuc cuccccuucc ugcacccgua cccccguggu 3960
cuuugaauaa agucugagug ggcggcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4020
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4080
aaaaaa 4086
<210> 18
<211> 990
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggggaaauaa gagagaaaag aagaguaaga agaaauauaa gagccaccau ggacuggacc 60
uggauccugu uccuggucgc cgcugccacc cgggugcaca gcagagugca gcccaccgag 120
ucuaucgugc gguuucccaa caucaccaac cucuguccuu ucggcgaagu cuuuaacgcc 180
acaagauucg ccagcguuua cgccuggaau aggaaaagaa ucagcaauug cguggccgac 240
uacagcgugc uguacaacag cgccucuuuc agcaccuuca aguguuacgg aguguccccu 300
acaaagcuga acgaccugug cuucacaaac guguacgcug auucuuuugu gauuagaggc 360
gacgaggugc ggcagaucgc cccuggccag accggcaaca ucgcugauua caacuauaag 420
cugccugacg acuucaccgg augugugauc gccuggaaca gcaauaaccu ggacuccaag 480
gugggaggca auuacaacua ccuguaccgg cuguucagaa aguccaaccu gaagcccuuc 540
gaaagagaua ucagcacaga gaucuaccag gccggcagca ccccaugcaa cggcgugaag 600
ggcuucaacu gcuacuuccc ccugcagagc uacggcuuuc agccuaccua cggcgugggu 660
uaucaaccau acagaguggu gguccugagc uucgagcugc ugcacgcccc ugccaccgug 720
ugcggcccua agaaaucuac aaaucuggug aaaaacaagu gcgugaacuu cugauaauag 780
gcuggagccu cgguggccau gcuucuugcc ccuugggccu ccccccagcc ccuccucccc 840
uuccugcacc cguacccccg uggucuuuga auaaagucug agugggcggc aaaaaaaaaa 900
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 990
<210> 19
<211> 4077
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggggaaauaa gagagaaaag aagaguaaga agaaauauaa gagccaccau guucguguuu 60
cuggugcugc ugccccuggu gagcucccag ugcgugaauu ucaccaccag aacccagcug 120
ccaccugccu auaccaacag uuucaccaga ggcguguacu accccgauaa gguguuuaga 180
uccagcgugc ugcacagcac ccaagaccug uuucugcccu ucuucagcaa cgugaccugg 240
uuccacgcua uccacgugag cggcaccaac ggcacuaaga gguucgccaa uccugugcug 300
ccuuucaacg acggcguaua uuuugccagc accgaaaaga gcaacaucau cagaggaugg 360
aucuucggaa ccacccugga cagcaagacc cagagccugc ugaucgugaa caacgccacc 420
aacgugguga ucaaggugug ugaauuccaa uucugcaacg acccuuuccu gggagucuac 480
uaccacaaga acaacaagag cuggauggaa uccgaguuca gaguguacuc uagcgcuaau 540
aacugcaccu uugaguacgu gagccagcca uuccugaugg accuggaagg caagcaaggc 600
aacuucaaga auuugcggga auucgucuuc aaaaacaucg acggcuacuu caagaucuac 660
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ccucuaguug accugccuau cggcauuaac aucacaagau uccagacacu gcacaucagc 780
uaccugaccc cuggagauag cucuagcgga uggacagccg gcgcugccgc cuacuacgug 840
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gccguggacu gcgcccugga cccucugucu gagacaaagu gcacgcugaa guccuucaca 960
guggaaaagg gcaucuauca gaccagcaau uuccgcgugc agccuaccga gagcauagug 1020
cgguucccca acaucaccaa ccuguguccu uuuggcgagg uguucaaugc cacacgguuc 1080
gccuccgugu acgccuggaa cagaaagcgg aucagcaauu gcguggccga cuacuccgug 1140
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agacagaucg ccccuggcca gaccggcaac aucgccgauu acaacuacaa gcugccugac 1320
gacuucaccg gcugcgugau cgccuggaau agcaacaacc uggauucuaa agugggcggc 1380
aauuacaacu accuguacag acuguucaga aagucgaacc ugaaaccuuu cgagagagau 1440
aucucuaccg agaucuacca ggccggcagc acccccugca auggcgucaa aggcuucaac 1500
uguuacuucc cucugcagag cuacggcuuu cagccaaccu acggcgucgg cuaccagcca 1560
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