苄基异喹啉生物碱及其衍生物合成基因Ac6OMT的应用
阅读说明：本技术 苄基异喹啉生物碱及其衍生物合成基因Ac6OMT的应用 (Application of benzyl isoquinoline alkaloid and derivative thereof in synthesis of gene Ac6OMT ) 是由 卢善发 崔馨云 李彩丽 于 2021-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种Ac6OMT基因在生产苄基异喹啉生物碱及其衍生物中的应用,Ac6OMT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；合成的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；还公开了Ac6OMT基因在选育合成/不能合成苄基异喹啉生物碱及其衍生物的转基因植物品种中的应用,并记载了调控生物体合成苄基异喹啉生物碱及其衍生物的方法。本发明对苄基异喹啉生物碱及其衍生物合成通路中的Ac6OMT编码基因进行了功能鉴定,该基因可应用于北马兜铃苄基异喹啉生物碱的生物合成和分子育种。(The invention discloses an application of Ac6OMT gene in producing benzylisoquinoline alkaloid and derivatives thereof, wherein the nucleotide sequence of the Ac6OMT gene is shown as SEQ ID NO. 1; the synthesized amino acid sequence is shown as SEQ ID NO. 2; also discloses the application of Ac6OMT gene in breeding transgenic plant varieties capable of synthesizing/not synthesizing the benzylisoquinoline alkaloid and the derivatives thereof, and records a method for regulating organism synthesis of the benzylisoquinoline alkaloid and the derivatives thereof. The invention carries out functional identification on Ac6OMT coding gene in the synthetic pathway of the benzylisoquinoline alkaloid and the derivative thereof, and the gene can be applied to biosynthesis and molecular breeding of the Aristolochia benzylisoquinoline alkaloid.)
技术领域
本发明涉及苄基异喹啉生物碱及衍生物合成技术领域，更具体地说是涉及一种苄基异喹啉生物碱及其衍生物合成基因Ac6OMT的应用。
背景技术
马兜铃酸是一种苄基异喹啉生物碱衍生物，因其严重的肾毒性和致癌性备受关注，与此同时含马兜铃酸的中药材的使用也受到限制。自2005年开始，药典陆续删除了马兜铃、青木香、天仙藤、广防己、关木通这几种马兜铃酸药材，2020版《中国药典》中马兜铃酸药材仅余细辛一种。然而，这些马兜铃酸药材大多使用历史悠久，疗效显著且尚未找到合适的药材替代品，因此想要安全地使用这类药材，多通过炮制、配伍和传统育种的方式减毒。
现在关于马兜铃类药材尚有争议，有研究认为马兜铃酸仅仅是一种毒性致癌物质，无其他功用；还有研究认为，马兜铃酸也是一种药效成分。因此通过对这种不含有马兜铃酸的北马兜铃进行药理毒理实验，就可以进一步验证马兜铃酸到底有没有药用功效，为今后的用药安全提供指导。
马兜铃酸的生物合成途径目前研究较少，只有通过同位素示踪法初步地研究了途径中可能的中间体化合物，且目前仅有一个基因TyrDC被认为很可能参与了马兜铃酸的合成。由于马兜铃酸属于苄基异喹啉生物碱的衍生物，且苄基异喹啉生物碱的生物合成途径目前研究的较为全面，因此马兜铃酸生物合成通路的推理可以参考苄基异喹啉生物碱合成通路。然而，北马兜铃的苄基异喹啉生物碱及其衍生物马兜铃酸生物合成通路的研究尚且空白，因此，对合成北马兜铃的苄基异喹啉生物碱及其衍生物马兜铃酸的基因的研究也较少。
因此，如何对北马兜铃苄基异喹啉生物碱及其衍生物合成基因加以应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了以植物北马兜铃为研究对象，对苄基异喹啉生物碱及其衍生物马兜铃酸生物合成通路中的Ac6OMT编码基因进行了筛选和功能鉴定。为苄基异喹啉生物碱及其衍生物马兜铃酸的生物合成途径的解析以及不含马兜铃酸的植物的分子育种奠定基础。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
Ac6OMT基因在生产苄基异喹啉生物碱及其衍生物中的应用，所述Ac6OMT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；合成的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为上述技术方案优选的技术方案，将Ac6OMT基因转化微生物工程菌或植物中，用于合成苄基异喹啉生物碱及其衍生物。
SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换、缺失或插入得到的编码与所述Ac6OMT基因具有相同功能的蛋白的核苷酸序列。
作SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的氨基酸序列。
作为相同的发明构思，本发明还请求保护Ac6OMT基因在选育合成苄基异喹啉生物碱及其衍生物的转基因植物品种中的应用。
作为相同的发明构思，本发明还请求保护敲除Ac6OMT基因在培育不能合成苄基异喹啉生物碱衍生物的植物品种中的应用。
作为相同的发明构思，本发明还请求保护一种调控生物体内苄基异喹啉生物碱合成的方法，通过调控Ac6OMT基因的表达量或敲除该基因，控制苄基异喹啉生物碱及其衍生物的产量或彻底消除生物体内的苄基异喹啉生物碱衍生物。
一种SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经一个或多个碱基的替换、缺失或插入得到的基因。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开了苄基异喹啉生物碱及其衍生物马兜铃酸合成通路中的去甲乌药碱6-氧甲基转移酶Ac6OMT基因的应用，Ac6OMT基因具有催化去甲乌药碱生成乌药碱的功能，揭示了苄基异喹啉生物碱及其衍生物马兜铃酸生物合成中的一个关键基因，为苄基异喹啉生物碱及其衍生物马兜铃酸的生物合成途径的解析以及分子育种奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明提供的北马兜铃不同组织中马兜铃酸的含量图；
图2附图为本发明提供的基于北马兜铃基因组的Ac6OMT基因的鉴定及进化分析图；
图3附图为Ac6OMT编码基因在北马兜铃不同组织中的差异表达图；
图4附图为Ac6OMT蛋白催化机制图；
图5附图为Ac6OMT蛋白催化路线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了北马兜铃苄基异喹啉生物碱及衍生物合成基因的筛选及应用。
实例1北马兜铃根茎叶花中马兜铃酸含量的测定
1)样品前处理
将根茎叶花四个组织从-80℃冰箱中取出，使用液氮研磨成细粉。称取0.1g粉末于离心管中，加入2ml 70％甲醇震荡，室温浸润15min，随后超声30min。离心后收集上清，余下沉淀加入2ml 70％甲醇震荡，超声30min。离心后收集上清，和之前收集的上清液合并。经0.22μm滤膜过滤后，待上样；
2)UPLC检测马兜铃酸A，B，C，D的含量
使用ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱(2.1X100nm，1.7μm；Waters)；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：0.4mL min-1，进样量；10μL；流动相：乙腈-0.2％乙酸水；等度洗脱条件为：40％乙腈。记录马兜铃酸A，B，C，D组分的峰面积，结合定量的标品的峰面积，计算得到各组织中马兜铃酸A，B，C，D的含量。结果显示，马兜铃酸总量在根中最高，在花中较高，在茎和叶中较低(图1)。
实施例2基于北马兜铃基因组与转录组数据Ac6OMT基因的筛选及系统进化分析
在Tair数据库中提取拟南芥的OMT蛋白序列，通过BLASTP比对北马兜铃基因组数据，鉴定得到北马兜铃AcOMTs。将在Uniprot数据库中检索得到6条与苄基异喹啉生物碱合成相关的其他物种的OMT蛋白序列(Ps6OMT，Tf6OMT，Cj6OMT，Ps4’OMT1，Ps4’OMT2，Cj4’OMT)和AcOMTs，一同经过MUSCLE比对，构建NJ系统进化树，bootstrap选择重复1000次。如图2，重点关注与6条已知功能的OMTs聚在一起的7条AcOMTs，AcOMT1-7。根据转录组数据，提取这7条AcOMTs在不同组织中的表达量FPKM值，绘制热图(图3)进行比较。发现不同组织中，Ac6OMT的表达量很显著且与马兜铃酸的积累成正相关。推测其很可能与马兜铃酸的合成有关。
实施例3北马兜铃Ac6OMT基因的克隆
根据Ac6OMT基因序列的开放阅读框设计基因全长扩增引物，以北马兜铃的cDNA为模板，PCR扩增得到Ac6OMT基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1，基因全长1056bp。将核苷酸序列翻译后推导出Ac6OMT的氨基酸序列，包括351个氨基酸残基，如SEQ ID No.2。Ac6OMT基因全长扩增引物如表1所示：
表1
实施例4Ac6OMT蛋白诱导表达和纯化
将Ac6OMT基因克隆至pET30a载体中形成pET30a-AcOMT2重组表达载体，将该载体与pET30a空载分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌表达菌株中。取过夜活化的菌液1mL加入100mL LB液体培养基(含有50μg/mL卡纳霉素)中，37℃，200rpm，培养3.5h，待其OD值达到0.6-0.8时，加入IPTG使其终浓度为0.5mM，开始进行诱导，16度，200rpm。诱导20h后，离心收集菌体，超声破碎后，所得上清继续进行纯化。将上述所得溶液经0.45μm滤膜过滤，上样至平衡好的Ni柱中，使用清洗缓冲液(500mM NaCl，20mM Tris-Hcl pH 8.0，100mM咪唑)10mL洗三次。洗脱缓冲液(500mM NaCl，20mM Tris-HclpH 8.0，500mM咪唑)6mL洗三次，收集。使用超滤管浓缩洗脱液至500μL，测定蛋白浓度后即得纯化的蛋白酶液。
实施例5参与北马兜铃苄基异喹啉生物碱及其衍生物马兜铃酸生物合成的关键酶基因Ac6OMT的功能验证
将纯化后的蛋白酶液在体外按照以下反应体系(50μL)进行功能验证：25mM Tris–HCl(pH 8.0),25mM维生素C钠,0.1mM S-腺苷甲硫氨酸,100mM去甲乌药碱，10μg纯化后的蛋白。37℃孵育1小时，用50μL甲醇混匀后终止反应，离心后过0.22μm滤膜，使用UPLC检测其化学成分。使用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1X100nm，1.7μm；Waters)；检测波长：280nm；柱温：35℃；流速：0.3mL min-1，进样量；10μL；流动相：甲醇(A)，0.1％甲酸水(B)；梯度洗脱条件为：0–0.5min,保持5％A；0.5–4min，5％A增长至95％A；4-6min，保持95％A；6–6.1min，95％A降低至5％A；6.1–8min，保持5％A。如图4和图5，体外催化结果显示AcOMT2能够催化去甲乌药碱产生一个与乌药碱具有相同的色谱行为(如：保留时间、光谱图等)的色谱图；而空载蛋白无法催化。可知AcOMT2具有催化去甲乌药碱生成乌药碱的功能，由此将其命名为Ac6OMT。
Ac6OMT基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
ATGGAGACACCGAAAGACGATCAATTGGCTCAGGCGAAGCTGTGGAAGTCCGTCTACGCTTTGGCCGACTCCCTCGTCCTCCGTGCCGCCGTAGAGCTCGGCCTCGTCGACATCGTCCACGCCCACGGAGGACCCATCTCAGTTTCCGACATCTCCTCCCGCCTCCGGCTTCCCTCCGTCGACTCCGGCCGCCTTCAACGCCTCTTGCGCTACCTCGTCCGAATGGAGATCTTCTCTACGGAACCGAGCACCCTCGACGACGATGGCGAGTATCGGTACGGCCTCGCCCCCGCCGCCGCCTACCTCGTCTCCGGCAAGGACAAGAACATCATTCCCGCCCTGCTCTTTGTCACCGACAAGGACATGATGACGCCGTACTACTTCATCAAGGACGCACTCCGCCGGAGCGGGCCCACCGCATTCGAGATGGCCCTGGGGAAGAGCATCTGGGATTTCATGGCGGACCAGCCTGAGAAGAACAAGCTCTTCAACGCCGCCATGGCGTCCGATTCTCGGCTCCTCACCTCAGCCCTGGTCGGCGAATGCGAGGACGTCTTCGCCGGAATTGGGTCCCTCGTCGACGTCGGCGGCGGCACTGGAACGGCGGTGAGGGCCATCGCCGAGGCCTACCCGGGAATCAAATGTACCGTCTTCGACCTGCCGCATGTCATCGCCGACTCGCCCCACTATCCGGAGGTGACCCGCGTCGAAGGGGACATGTTTAAGTCCATTCCCGCCGCAGATGCCATTCTAATGAAGTGCATCCTCCACGATTGGGGCGACGAGGATTGCGTGAAGATCCTAAAGAAGTGCAAGGAAGCTGTGCCCACAAAAGGGGGGAAGGTGATTATTGTGGACATCGTGTTGGATACTGATACCCACCGTCCCCAAACCCACCTGAAGCAGTGTATGGATTTGGACATGCTTCTCACCACGGGAGGAAAAGAGAGAACGGAAGCAGAATGGAAGAAACTGATTCACGACGCAGGGTTTAAAGGGTACAAGATCAAACACACTTCCGCGGTACAATCTGTGATTGAGGCATTTCCTTACTAA，如SEQ ID NO.1；
Ac6OMT蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
METPKDDQLAQAKLWKSVYALADSLVLRAAVELGLVDIVHAHGGPISVSDISSRLRLPSVDSGRLQRLLRYLVRMEIFSTEPSTLDDDGEYRYGLAPAAAYLVSGKDKNIIPALLFVTDKDMMTPYYFIKDALRRSGPTAFEMALGKSIWDFMADQPEKNKLFNAAMASDSRLLTSALVGECEDVFAGIGSLVDVGGGTGTAVRAIAEAYPGIKCTVFDLPHVIADSPHYPEVTRVEGDMFKSIPAADAILMKCILHDWGDEDCVKILKKCKEAVPTKGGKVIIVDIVLDTDTHRPQTHLKQCMDLDMLLTTGGKERTEAEWKKLIHDAGFKGYKIKHTSAVQSVIEAFPY，如SEQ ID NO.2。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院药用植物研究所
<120> 苄基异喹啉生物碱及其衍生物合成基因Ac6OMT的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggagacac cgaaagacga tcaattggct caggcgaagc tgtggaagtc cgtctacgct 60
ttggccgact ccctcgtcct ccgtgccgcc gtagagctcg gcctcgtcga catcgtccac 120
gcccacggag gacccatctc agtttccgac atctcctccc gcctccggct tccctccgtc 180
gactccggcc gccttcaacg cctcttgcgc tacctcgtcc gaatggagat cttctctacg 240
gaaccgagca ccctcgacga cgatggcgag tatcggtacg gcctcgcccc cgccgccgcc 300
tacctcgtct ccggcaagga caagaacatc attcccgccc tgctctttgt caccgacaag 360
gacatgatga cgccgtacta cttcatcaag gacgcactcc gccggagcgg gcccaccgca 420
ttcgagatgg ccctggggaa gagcatctgg gatttcatgg cggaccagcc tgagaagaac 480
aagctcttca acgccgccat ggcgtccgat tctcggctcc tcacctcagc cctggtcggc 540
gaatgcgagg acgtcttcgc cggaattggg tccctcgtcg acgtcggcgg cggcactgga 600
acggcggtga gggccatcgc cgaggcctac ccgggaatca aatgtaccgt cttcgacctg 660
ccgcatgtca tcgccgactc gccccactat ccggaggtga cccgcgtcga aggggacatg 720
tttaagtcca ttcccgccgc agatgccatt ctaatgaagt gcatcctcca cgattggggc 780
gacgaggatt gcgtgaagat cctaaagaag tgcaaggaag ctgtgcccac aaaagggggg 840
aaggtgatta ttgtggacat cgtgttggat actgataccc accgtcccca aacccacctg 900
aagcagtgta tggatttgga catgcttctc accacgggag gaaaagagag aacggaagca 960
gaatggaaga aactgattca cgacgcaggg tttaaagggt acaagatcaa acacacttcc 1020
gcggtacaat ctgtgattga ggcatttcct tactaa 1056
<210> 2
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Thr Pro Lys Asp Asp Gln Leu Ala Gln Ala Lys Leu Trp Lys
1 5 10 15
Ser Val Tyr Ala Leu Ala Asp Ser Leu Val Leu Arg Ala Ala Val Glu
20 25 30
Leu Gly Leu Val Asp Ile Val His Ala His Gly Gly Pro Ile Ser Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ser Ser Arg Leu Arg Leu Pro Ser Val Asp Ser Gly Arg
50 55 60
Leu Gln Arg Leu Leu Arg Tyr Leu Val Arg Met Glu Ile Phe Ser Thr
65 70 75 80
Glu Pro Ser Thr Leu Asp Asp Asp Gly Glu Tyr Arg Tyr Gly Leu Ala
85 90 95
Pro Ala Ala Ala Tyr Leu Val Ser Gly Lys Asp Lys Asn Ile Ile Pro
100 105 110
Ala Leu Leu Phe Val Thr Asp Lys Asp Met Met Thr Pro Tyr Tyr Phe
115 120 125
Ile Lys Asp Ala Leu Arg Arg Ser Gly Pro Thr Ala Phe Glu Met Ala
130 135 140
Leu Gly Lys Ser Ile Trp Asp Phe Met Ala Asp Gln Pro Glu Lys Asn
145 150 155 160
Lys Leu Phe Asn Ala Ala Met Ala Ser Asp Ser Arg Leu Leu Thr Ser
165 170 175
Ala Leu Val Gly Glu Cys Glu Asp Val Phe Ala Gly Ile Gly Ser Leu
180 185 190
Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Thr Ala Val Arg Ala Ile Ala Glu
195 200 205
Ala Tyr Pro Gly Ile Lys Cys Thr Val Phe Asp Leu Pro His Val Ile
210 215 220
Ala Asp Ser Pro His Tyr Pro Glu Val Thr Arg Val Glu Gly Asp Met
225 230 235 240
Phe Lys Ser Ile Pro Ala Ala Asp Ala Ile Leu Met Lys Cys Ile Leu
245 250 255
His Asp Trp Gly Asp Glu Asp Cys Val Lys Ile Leu Lys Lys Cys Lys
260 265 270
Glu Ala Val Pro Thr Lys Gly Gly Lys Val Ile Ile Val Asp Ile Val
275 280 285
Leu Asp Thr Asp Thr His Arg Pro Gln Thr His Leu Lys Gln Cys Met
290 295 300
Asp Leu Asp Met Leu Leu Thr Thr Gly Gly Lys Glu Arg Thr Glu Ala
305 310 315 320
Glu Trp Lys Lys Leu Ile His Asp Ala Gly Phe Lys Gly Tyr Lys Ile
325 330 335
Lys His Thr Ser Ala Val Gln Ser Val Ile Glu Ala Phe Pro Tyr
340 345 350
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggatccatgg agacaccgaa agacgatca 29
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcggccgctt agtaaggaaa tgcctcaatc acaga 35