具体实施方式

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook J.和Russel l，D.W.的分子克隆实验室手册(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：万寿菊高通量转录组测序

由于万寿菊基因组尚未测定，为获得功能基因转录本序列，利用万寿菊栽培品种组织样品，通过分别提取三个单株的叶片、未成熟花、成熟花RNA，将共9份样品进行高通量转录组序列测定与组装注释。

1、试剂

植物RNA提取试剂TRIzol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于TaKaRa公司，RNA文库制备试剂盒(RNA Library Prep Kit)来自北京百迈客生物科技有限公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、植物材料

万寿菊(Tagetes erectaL.)栽培品种菊王由赤峰鑫卉园艺公司繁育提供。

3、方法

3.1 RNA提取

1)使用液氮研磨法破碎100mg植物组织，移至1.5mL离心管中，加入1ml TRIzol，剧烈震荡，室温放置5min；

2)离心管中加入200μL氯仿，振荡30s混匀，室温放置5min；

3)4℃，12000rpm离心15min；

4)将上清液700μL移至1.5mL离心管中，下层有机相和中间层有蛋白质和其他杂质，避免触及吸取；

5)在上清液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min；

6)4℃，12000rpm离心15min，弃上清；

7)加入1mL 70％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

8)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；

9)室温干燥5～10min；

10)加入50μL无RNA酶水(RNase-free H₂O)，溶解RNA；

11)根据RNA溶液浓度取RNA 50μg，加入5μL 10X缓冲液(400mM Tris-HCL，pH 7.5，80mM MgCl₂，50mM DTT)、5μL Dnase I、2μL RNA酶抑制剂，37℃反应30min；

12)加入2.5μL 0.5M EDTA，80℃，2min失活Dnase I；

13)加入10μL 3M醋酸钠和250μL预冷的乙醇，-80℃放置20min；

14)4℃，12000rpm离心10min，弃上清；

15)加入1mL 70％乙醇清洗RNA；

16)4℃，12000rpm离心5min，弃上清；

17)室温干燥5～10min；

18)加入50μL无RNA酶水，溶解RNA；

19)检测RNA样品的纯度、浓度。

3.2转录组测序组装与注释

转录组测序利用RNA Library Prep Kit，通过Illumina HiSeq高通量测序平台，按以下步骤进行：

1)用带有Oligo(dt)的磁珠富集真核生物RNA，将mRNA进行随机打断；

2)以mRNA为模版，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入dNTPs、RNA酶H和DNA聚合酶I合成第二条cDNA链，利用微珠(beads)纯化cDNA；

3)纯化的双链cDNA再进行末端修复，并连接测序接头，然后用微珠进行片段大小选择，通过PCR富集得到cDNA文库；

4)对文库的浓度和插入片段大小进行检测；

5)利用Illumina HiSeq高通量测序平台对cDNA文库进行测序，测序读长为PE125；

6)将测序片段(reads)截除测序接头、引物序列，过滤低质量值数据后，获得高质量的测序数据；

7)利用Trinity组装软件将高质量测序read延伸成较长的片段(contig)，并利用这些片段之间的重叠，得到片段集合(component)，最后利用De Brui jn图的方法获得转录本序列(unigene)；

8)使用BLAST软件将转录本序列与NR(NCBI非冗余数据库)、Swiss-Prot(欧洲生物信息学研究所维护数据库)、GO(Gene Ontology)、COG(Clusters of OrthologousGroups)、KOG(euKaryotic Orthologous Groups)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes)数据库比对；

9)利用TransDecoder软件进行unigene的编码区序列及其对应氨基酸序列的预测，使用HMMER软件与Pfam(Protein family)数据库比对，获得unigene的注释信息。

4、结果

通过上述将万寿菊组织材料进行RNA提取、建库、高通量转录组测序，然后对测序序列进行组装和基因功能预测。利用对组装基因表达水平定量和差异表达分析，发现其中TePSY基因在万寿菊未成熟花中表达量较高，约为叶片中的7倍。对TePSY基因组装序列的注释显示其具有八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase)特征，命名为Tagetes erectaPhytoene Synthase(TePSY)。

实施例2：万寿菊TePSY基因的克隆

根据实施例1对万寿菊TePSY基因的数据组装，利用引物设计软件Primer Premier设计PCR特异引物，从万寿菊未成熟花中提取总RNA，反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)克隆获得TePSY基因。

1、试剂

植物RNA提取试剂TRIzol购于Invitrogen公司，DNA酶I(Dnase I)购于TaKaRa公司，反转录酶、dNTP、高保真DNA聚合酶购于北京全式金生物技术有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、载体与菌株

克隆载体pEASY-Blunt Simple Cloning Vector、大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α购于北京全式金生物技术有限公司。

3、培养基与试剂

LB培养基:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。用NaOH调pH至7.0，高压灭菌。

100×Mg²⁺溶液:20.33g MgCl₂.6H₂O、24.65g MgSO₄.7H₂O定容于100mL H₂O，高压灭菌。

SOC培养基:胰蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.58g/L，KCl 0.19g/L，100×Mg²⁺10mL。以NaOH调pH至7.0，高压灭菌。然后加入2mL过滤除菌的1mol/L葡萄糖。

1000×氨苄青霉素：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，-20℃保存。

4、方法

4.1万寿菊未成熟花组织RNA提取

如实施例1中3.1所述操作步骤进行。

4.2 RT-PCR

4.2.1 RT

1)取1μg总RNA与1μL polyT₁₈(10μM)引物混合，用RNase-free ddH₂O补足至12.75μL，轻轻混匀；

2)65℃保温5min，立即转移至冰浴中，放置2min；

3)加入5×反应缓冲液4μL、10mM dNTP 2μL、RNA抑制剂0.25μL(40U/μL)、反转录酶1μL(100U/μL)，42℃1h，合成第一链cDNA；

4)95℃加热5min，失活反转录酶，终止反应。

4.2.2 PCR

根据实施例1所获得的TePSY基因推测序列，利用Primer Premier软件设计引物序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，具体的序列如下：

TePSYF1:5’gatcttgaaacctaacatgtggtga 3’

TePSYR1:5’tagtcaacttgttggatttatacat 3’

将本实施例步骤4.2.1所获万寿菊未成熟花组织的cDNA，进行TePSY基因的克隆。

将200μL EP管放置于冰上，加入试剂：

按以下程序进行扩增：98℃2min(预变性)；98℃10s(变性)，55℃20s(复性)，72℃90s(延伸)，所述变性-复性-延伸30个循环；72℃5min(总延伸)。

通过上述操作，获得了TePSY基因PCR扩增产物。

4.3PCR扩增产物与pEASY-Blunt载体连接

将由本实施例步骤4.2所获得的TePSY基因PCR扩增产物与克隆载体pEASY-BluntSimple Cloning Vector按摩尔分子数比1:4连接(25℃，15min)，连接体系如下：

pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(50μg/μL) 4μL

PCR产物(～150μg/μL) 1μL

4.4大肠杆菌转化

1)取出冻存的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α感受态细胞冰浴解冻；

2)将4.3所述连接产物与大肠杆菌感受态细胞轻轻混匀，冰浴30min；

3)42℃热冲击90s，立即冰浴1～2min；

4)加入0.8mL SOC，混匀，37℃温和振荡培养1h；

5)室温13000rpm离心1min，倒掉一部分上清液，留约200μL的上清液，用吸头将上清液与细胞混匀，涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB平板，37℃培养12h。

4.5菌落PCR鉴定

将本实施例步骤4.4所述大肠杆菌再进行菌落PCR鉴定，以确定插入片段是目标片段。反应体系、扩增程序如上述4.2.2。

对菌落PCR鉴定的重组载体，命名为pEASY-TePSY，进行测序。测序结果表明，获得了连接于pEASY-Blunt克隆载体的TePSY基因全长序列。其中，TePSY基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其具体的核苷酸序列如下：

TePSY基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其具体的氨基酸序列如下：

实施例3：TePSY基因在万寿菊不同组织中的表达

根据实施例2所克隆获得的TePSY基因全长序列，利用引物设计软件PrimerPremier设计定量PCR引物。分别从万寿菊叶片、花蕾、未成熟花、成熟花中提取总RNA，反转录获得cDNA，进行TePSY基因表达水平的定量分析。

1、试剂

RNA提取、反转录试剂如实施例2所述；实时定量PCR试剂TransStart Green qPCRSuperMix购于北京全式金生物技术有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、方法

分别取万寿菊叶片、花蕾、未成熟花、成熟花组织样品，液氮研磨后提取RNA，进行反转录，操作步骤如实施例1中3.1、实施例2中4.2所述。

根据高通量测序结果，以在万寿菊不同组织中均稳定表达的TranslationInitiation Factor 6(TIF6)做为内参对照基因，进行TePSY表达水平的定量PCR分析。TePSY引物为TePSYRTF和TePSYRTR，TIF6引物为TIF6F和TIF6R。引物序列分别如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，具体序列如下：

TePSYRTF:5’gctttaggcattgctaatcaactc 3’

TePSYRTR:5’caaatatgtcttcatccgacaatc 3’

TIF6F:5’taagacctggtggtggaaataga 3’

TIF6R:5’cagcaccatgaggacgaaga 3’

定量PCR反应体系如下：

反应条件：95℃30s；95℃5s，60℃15s，72℃10s，40个循环。其中cDNA为如实施例2中4.2.1方法所述所获得cDNA模板稀释30倍后用于定量PCR。扩增后，65℃5s，每个循环增加0.5℃，60个循环，进行熔解曲线分析。每个样品重复三次，PCR反应在Bio-Rad CFX 96上运行。

4、结果

实时定量PCR分析结果显示，TePSY基因在色素万寿菊叶片中表达量最低，在花蕾、未成熟花、成熟花中的表达水平分别为叶片的4.6、11.8和2.7倍。表明TePSY基因所表达具有八氢番茄红素合成酶特征的编码产物可能在万寿菊花中类胡萝卜素的合成中发挥功能。

实施例4：TePSY基因植物表达载体构建

以实施例2所获得pEASY-TePSY质粒为模板进行PCR扩增，并引入KpnI、Xho I酶切位点。将PCR产物、植物表达载体pBTEX-Flag，分别以KpnI、Xho I酶切，酶切产物胶回收后进行连接，并转化大肠杆菌、农杆菌。

1、试剂

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购于Omega公司；高保真DNA聚合酶、T4DNA连接酶购于北京全式金生物技术有限公司；限制性内切酶Kpn I和Xho I购于New EnglandBiolabs公司。其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、大肠杆菌菌株和农杆菌菌株

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV2260购于北京全式金生物技术有限公司。

3、培养基和抗生素

LB液体培养基、LB固体培养基、SOC培养基的配制方法如实施例2所述。

1000×卡那霉素(Kan)：100mg/mL，溶于灭菌去离子水，无菌抽滤后分装-20℃保存。

500×利福平(Rif)：50mg/mL，溶于灭菌去离子水，-20℃保存。

4、方法

4.1质粒提取

将实施例2所获得pEASY-TePSY载体、植物表达载体pBTEX-Flag进行质粒提取，实验步骤按试剂盒生产商所述进行。

1)柱平衡：向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000rpm，离心1min，弃废液，待用；

2)12000rpm，1min，离心收集菌沉淀，尽量弃尽上清；加入250μL P1(已加RNaseA)，吹吸混匀至菌沉淀彻底悬浮；

3)加入250μL P2，温和上下翻转8次离心管，使菌体充分裂解；

4)加入350μL P3，立即温和上下翻转8次离心管，12000rpm，离心10min；

5)吸出上清至新的离心管中，12000rpm，离心5min；

6)小心转移上清至吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃废液；

7)加入500μL PD，12000rpm，离心1min，弃废液；

8)加入600μL PW(已加无水乙醇)，12000rpm，离心1min，弃废液，重复操作一次；

9)12000rpm，离心2min，除尽残留的PW；

10)将吸附柱转移至新离心管中，在柱中央加入50μL无菌ddH₂O，室温放置2min，然后12000rpm，离心2min，洗脱DNA。

4.2PCR

以所获得pEASY-TePSY质粒为模板进行PCR扩增，并引入Kpn I、Xho I酶切位点对编码序列进行扩增。引物序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示，具体的序列如下：

TePSYF2:5’ggggtacccttttttcatattcaagaaccaac 3’

TePSYR2:5’gcctcgagtttaccctctgatggcatgat 3’

4.3酶切

对所获得预期大小的PCR扩增产物进行纯化，然后利用限制性内切酶Kpn I、Xho I对上述4.1、4.2所获的pBTEX-Flag质粒、TePSY基因扩增产物进行酶切。

4.4胶回收

将上述4.3酶切后质粒、TePSY基因扩增产物进行胶回收，实验步骤按试剂盒生产商所述进行。

1)向胶回收吸附柱中加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒去柱底部的废液。

2)带上塑胶手套，在紫外切胶仪器上回收电泳分离的片段，将切下的片段放入预先准备的EP管中。

3)根据胶的质量来确定加入溶胶液PN的体积，按照1:1体积加入。将EP管放入加热器，50℃溶解10～15min，至胶完全溶解。

4)溶胶完全后，待其冷却至室温后，将溶解液体转入胶回收吸附柱中，静置3min。

5)12000rpm离心1min，倒去收集管底部废液。向吸附管中加入600μL的洗涤液PW。

6)12000rpm离心1min，倒去收集管底部的废液。重复洗涤一次。

7)将吸附柱放入离心机中12000rpm离心3min，放置15min。

8)向吸附柱正中心吸附膜上加入30μL洗脱剂EB，静置3min，12000rpm离心3min，获得胶回收产物。

4.5酶切片段连接

将上述4.4酶切回收的TePSY基因片段、pBTEX-Flag质粒片段以T4连接酶进行连接，连接反应体系如下，25℃，3h：

4.6大肠杆菌转化

实验步骤如实施例2中4.4所述。

4.7菌落PCR鉴定重组质粒

实验方法步骤如实施例2中4.5所述。

将菌落PCR鉴定重组载体(命名为pBTEX-TePSY)，进行测序。测序结果表明，TePSY编码序列连接于pBTEX载体。将测序正确的重组大肠杆菌-80℃保存。

4.8农杆菌转化

1)按本实施例中4.1所述步骤提取pBTEX-TePSY质粒。

2)将pBTEX-TeCHX质粒加入50μL农杆菌菌株GV2260感受态细胞中，轻轻搅拌混匀，并在冰上冰浴30min。

3)放置于液氮中冷激1min。

4)将EP管移置于37℃恒温加热器上，加热5min。

5)加入SOC培养液800μL，放置于摇床中28℃，200rpm/min培养4～5h。

6)菌液于4000rpm/min离心5min。

7)在超净台中吸取上清，剩余约100μL，将菌体轻轻吹打悬浮混匀。

8)用灭菌玻璃球将菌液均匀涂布于LB+Rif+Kana固体培养基，于28℃恒温培养箱培养48h。

9)按实施例2中4.5相同方法步骤进行菌落PCR鉴定，并将鉴定转入重组质粒的阳性农杆菌-80℃保存。

实施例5：TePSY在烟草中表达

将TePSY基因通过农杆菌介导方法在烟草叶片中表达，对TePSY编码蛋白的表达进行检测，并对表达TePSY的烟草组织样品中相关类胡萝卜素的含量进行测定。

1、试剂

乙酰丁香酮、Flag标签小鼠单克隆抗体购于美国Sigma公司；PageRuler PlusPrestained Protein Ladder、Western Blot ECL Substrate购于美国Thermo Scientific公司。其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、植物材料

烟草(Nicotiana benthamiana)种植于人工气候培养室。

3、培养基和溶液

IM溶液：

475mL IM溶液：2-吗啉乙磺酸(MES)4.88g；葡萄糖2.5g；NaH₂PO₄0.126g。先将MES加入ddH₂O中，调节pH值至5.6，再加入葡萄糖和NaH₂PO₄，搅拌均匀，高温灭菌。

1L 20×AB盐溶液：NH₄Cl 20g；MgSO₄，6g；KCl，3g；FeSO₄0.05g，CaCl₂，2g。依次加入各组分，完全且均匀溶解后，高温灭菌。

200mM乙酰丁香酮(acetosyringone，1000×)：将39mg乙酰丁香酮粉末溶于1mLDMSO，-20℃避光保存。

20mL诱导培养基：IM溶液19mL，20×AB盐溶液1mL，200mM乙酰丁香酮20μL，25mg/mL卡那霉素20μL。

1L 5×蛋白质电泳缓冲液：三羟甲基氨基甲烷(Tris)15.1g，甘氨酸72.0g，SDS5.0g。

1L 10×western blot转膜缓冲液：甘氨酸144g，Tris 30.2g。将Tris、甘氨酸溶解于0.9L ddH₂O中，搅拌混匀，加ddH₂O定容至1L。配制1L 1×转膜缓冲液时，加入10×转膜缓冲液100mL、甲醇100mL，加ddH₂O定容至1L。

1L 10×TBS(Trish-buffered saline)缓冲液：NaCl 80g，KCl 2g，Tris30g。将各组分溶解于0.8L ddH₂O中，调pH至7.4，加ddH₂O定容至1L。配制1L 1×TBST(Trish-bufferedsaline with Tween)缓冲液时，加入10×TBS100mL、20％Tween-202.5mL，加ddH₂O定容至1L。

蛋白质提取缓冲液：50mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl，5mM乙二胺四乙酸，10％甘油、1％聚乙烯吡咯烷酮、20μM二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟、植物蛋白酶抑制剂(plant protease inhibitors，100μL/10mL提取缓冲液)。

4、方法

4.1烟草叶片表达

1)将转入pBTEX-TePSY重组质粒和pBTEX-Flag空载体的农杆菌，分别在带有Rif和Kana的LB培养板上划线，28℃恒温箱中培养48h。

2)挑取单克隆28℃培养12h，取300μL菌转接至2.7mL LB+Rif+Kana培养液中，28℃培养6～8h。

3)室温条件下，3000rpm离心6min，弃上清，加入3mL IM溶液重悬菌体；重复离心一次，以3mL诱导培养基溶液重悬菌体后，28℃250rpm培养5～14h；

4)3000rpm离心6min，弃上清，加入10mM MES 2mL(pH 5.7，带有200mM乙酰丁香酮200μL)，重悬菌体，涡旋震荡。重复一次；

5)测定菌液浓度(OD₆₀₀)，配制侵染液；

6)使用一次性注射器，将侵染液从烟草叶片下表皮注射到叶片中，并标记注射范围；

7)将注射植株置于阴暗处0.5h，放于光照下生长36～48h后收取样品，液氮中速冷，-80℃保存。

4.2western杂交

1)从-80℃冰箱中取出样品，研钵中液氮磨样，将样品磨成粉末状，转入预冷的1.5mL EP管中。

2)加入300μL蛋白质提取液，在涡旋仪器上震荡，使得提取液和样品混合均匀，静置10min。

3)4℃离心机中12000rpm离心10min。

4)吸取200μL上清转移至新的EP管中，加入2×蛋白上样缓冲液100μL，95℃加热5min。

5)将样品点入聚丙烯凝胶中，电泳2h。

6)转膜后以5％脱脂牛奶封闭1h。加入Flag标签免疫小鼠抗体，室温孵育1h。

7)洗膜3次，加入辣根过氧化酶联二抗，室温孵育1h。

8)洗膜3次，加入反应底物(western blotting ECL substrate)，在化学发光仪中对蛋白表达情况进行检测。

4.3番茄红素、β-胡萝卜素含量测定

类胡萝卜素提取及HPLC含量测定方法如下：取上述注射pBETX-HA空载体、表达TePSY的烟草样品，45℃烘干，液氮研磨后称重0.2g，加入1mL乙醇(含0.1％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)，涡旋15s，加入400mL 50％KOH溶液，涡旋15s，于50℃水浴60min，每15min涡旋一次。用3.3mL正己烷提取3次，合并提取液，取50μL滤液上样。色谱条件：高效液相色谱仪(美国WATERS公司)；色谱柱SymmetryC18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈：二氯甲烷：甲醇为70：20：10(v：v：v)；流速1mL/min；检测波长450nm；柱温30℃。根据标准曲线和HPLC测定结果，计算相应类胡萝卜素成分的含量。

5、结果

Western blot蛋白印迹实验结果显示，通过农杆菌介导方法使TePSY编码蛋白在烟草叶片中表达，获得约45KD预期大小的蛋白条带。与转入空载体的对照样品相比(番茄红素19μg/g干重、β-胡萝卜素25μg/g干重)，在表达TePSY的烟草组织中含量明显提高，分别为番茄红素63μg/g干重、β-胡萝卜素96μg/g干重。在已知的植物生物合成途径中，八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase)催化下游类胡萝卜素成分番茄红素、β-胡萝卜素的合成。由本实施例结果，如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的基因在类胡萝卜素合成途径中发挥功能，能够提高类胡萝卜素成分的含量。

实施例6：TePSY在番茄中遗传转化

将TePSY基因通过农杆菌介导方法在番茄中进行遗传转化，并对遗传转化的番茄果实中相关类胡萝卜素成分含量进行测定。

1、试剂

乙酰丁香酮、2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、吲哚乙酸(IAA)、激动素(KT)购于美国Sigma公司。其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。

2、植物材料

番茄(Solanum lycopersicum)生长种植于人工气候培养室。

3、溶液和培养基

20×AB盐溶液：分别称取2g NaCl、0.3g KCl、0.005g FeSO₄、0.06gMgSO₄·7H₂O、0.3g CaCl₂·2H₂O，加入ddH₂O搅拌使其充分溶解，定容至200mL，121℃，20min灭菌，-20℃保存。

0.5M 2-吗啉乙磺酸(MES)：称取4.88g MES，先加入ddH₂O搅拌使其充分溶解，然后用0.5M NaOH溶液调pH至5.6-6.0，最后定容至50mL，抽滤灭菌(0.22μm)，-20℃保存。

20％葡萄糖溶液：称取20g葡萄糖，溶解定容于100mL ddH₂O中，抽滤灭菌(0.22μm)，-20℃保存。

50×磷酸盐缓冲液：先分别配制0.078g/mL NaH₂PO₄溶液和0.087g/mL K₂HPO₄溶液，然后按照5:1(v/v)的比例将二者均匀混合，抽滤灭菌(0.22μm)，-20℃保存。

250×乙酰丁香酮(ACE)：称取0.5g ACE，溶解定容于50mL 70％乙醇中，抽滤灭菌(0.22μm)，分装至1.5mL灭菌EP管中，-20℃保存。

500×6-苄氨基嘌呤(6-BA)：称取50mg 6-BA置于100mL烧杯中，先用5mL1M KOH溶液将其充分溶解，然后用ddH₂O定容至50mL，抽滤灭菌(0.22μm)，-20℃保存。

500×吲哚乙酸(IAA)：称取50mg IAA置于100mL烧杯中，先用无水乙醇将其充分溶解，然后用ddH₂O定容至50mL，抽滤灭菌(0.22μm)，-20℃保存。

5000×2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)：称取50mg 2,4-D置于100mL烧杯中，先用1MKOH溶液将其充分溶解，然后以ddH₂O定容至50mL，抽滤灭菌(0.22μm)，-20℃保存。

10000×激动素(KT)：称取50mg激动素置于100mL烧杯中，先加入1M HCl溶液将其充分溶解，然后用ddH₂O定容至50mL，抽滤灭菌(0.22μm)，-20℃保存。

500×特美汀(Timentin)：称取5g特美汀，溶解定容于50mL ddH₂O中，抽滤灭菌(0.22μm)，-20℃保存。

组培侵染液(50mL)：在超净工作台中依次向灭菌器皿中加入20×AB盐溶液2.5mL、0.5M MES 1mL、20％葡萄糖溶液2.5mL、50×磷酸盐缓冲液1mL、250×ACE 200μL，混匀备用。

1/2MS培养基：称取10g蔗糖、1.5g MS培养基粉末、3.5g琼脂粉于1000mL烧杯中，先加入ddH₂O，搅拌使其充分溶解，再以1M KOH溶液调pH至5.6-6.0，最后以ddH₂O定容至500mL，121℃灭菌20min备用。

预培养基：1/2MS培养基(500mL)在灭菌后冷却至60℃左右时，加入500×6-BA 500μL、500×IAA 20μL充分混匀，分装至灭菌培养皿中备用。

共培养基：MS培养基(500mL)灭菌后冷却至60℃左右时，加入250×ACE 735μL、5000×2,4-D 100μL、10000×KT 50μL至培养基中，充分混匀，分装至灭菌培养皿中备用。

筛选培养基：MS培养基(500mL)在灭菌冷却后，加入500×6-BA 1mL、500×IAA 100μL、500×Timent in 1mL、卡那霉素至培养基中，充分混匀，分装至灭菌培养皿或组培瓶中备用。根据卡那霉素的终浓度，分为60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL三种筛选培养基。

生根培养基：MS培养基(500mL)在灭菌后冷却至60℃左右时，加入500×IAA 1mL、500×Timentin 1mL、1000×卡那霉素700μL至培养基中充分混匀，分装至灭菌组培瓶备用。

4、方法

4.1番茄遗传转化

1)番茄无菌幼苗培养：取适量野生型番茄种子置于50mL离心管中，在超净台中以75％乙醇处理种子5min、灭菌水清洗，然后以15％次氯酸钠溶液处理种子15min、无菌水清洗种子。将种子平铺于无菌滤纸上，随后以灭菌镊子将均匀点种于1/2MS培养基的表面，25℃避光培养一周左右至种子露白，随后转移至光照条件下培养生长无菌幼苗。

2)番茄外植体预培养：在超净台中用灭菌镊子夹取无菌幼苗，剪去根部，子叶与茎剪为约5mm长度愈伤组织段，置于预培养基，25℃光照条件下培养2d。

3)农杆菌侵染：从-80℃冰箱取出已转入TePSY基因植物遗传转化载体的农杆菌菌株，划线于含有Rif和Kana抗生素的LB培养基，28℃培养2d。挑取单克隆置于3mL含有相同抗生素的液体培养基中，28℃培养12h。吸取2mL菌液加至含有相同抗生素的LB培养基中扩大培养至OD₆₀₀约为0.5时，5000rpm离心5min。将菌体重悬于诱导液中，使终浓度为OD₆₀₀＝0.1。将预培养2d的番茄子叶与茎段移至诱导液中，浸泡15min。然后将外植体取出均匀摆放于灭菌滤纸上，吸干菌液，转移至共培养基中，25℃培养2d。

4)愈伤组织筛选培育：将共培养基中侵染农杆菌的叶片和茎段放置于卡那霉素浓度为60mg/mL的筛选培养基，25℃培养约30d。然后依次转移至抗生素浓度为65mg/mL、70mg/mL的筛选培养基进行继代培养。

5)生根培养：取出筛选培养基中生长高度约为5cm的分化幼苗，置于生根培养基中，25℃培养约30d至形成根系。然后将分化幼苗取出，冲洗根部琼脂后移入土壤培养盆内，在人工培养室中生长。利用筛选标记和TePSY基因对转化植株进行分子鉴定。

4.2番茄红素、β-胡萝卜素含量测定

提取及含量测定方法如下：将番茄外果皮切碎放入研钵中，加入液氮研磨成粉末。称取1g样品置于试管中，加入5mL丙酮-正己烷溶液(2：3，v/v)，涡旋振荡混匀，25℃静置萃取12h。吸取1mL提取液，利用分光光度法分别测定663nm、645nm、505nm、453nm波长下吸收值。根据计算公式：番茄红素(μg/mL)＝-0.0458×A₆₆₃+0.204×A₆₄₅+0.372×A₅₀₅-0.0806×A₄₅₃；β-胡萝卜素(μg/mL)＝0.216×A₆₆₃-1.22×A₆₄₅-0.304×A₅₀₅+0.452×A₄₅₃，计算相应类胡萝卜素成分的含量。

5、结果

通过农杆菌介导法获得了TePSY基因遗传转化番茄植株。与野生型相比(番茄红素92μg/g鲜重、β-胡萝卜素37μg/g鲜重)，转化TePSY的番茄果实中番茄红素和β-胡萝卜素含量明显升高，分别为165μg/g鲜重、58μg/g鲜重。由本实施例结果，如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的基因在类胡萝卜素合成途径中发挥功能，本实施例从色素万寿菊中所克隆基因TePSY能够用于提高植物体内类胡萝卜素成分的含量。

以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。

序列表

<110> 合肥工业大学

<120> 一种八氢番茄红素合成酶基因及应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1931

<212> DNA

<213> 万寿菊(Tagetes erecta)

<400> 1

gatcttgaaa cctaacatgt ggtgactgtc caaatctaat tttttttata atgagtggac 60

taaaaatagg cagcacccat ttccccaagt agaatgaata tggttttttg ttctacttat 120

attaattttt aatccttgtt cacatttgca tattttcttt ctttcagtta atttgctctt 180

cactgttcta tttgggttga tcttaaacaa cctcatccaa ttaacattca acaagaacct 240

ttaatttcat catattcaat cacaaaaagt tccaaaattg gtacaaattt tgattaaatt 300

ttcaatcttt gtgggaaatt catcatcttt ccactgaatg tgaagtgggg tttcattctt 360

tttttaaaac aagtttttta gtgcgtgttt ttagtatgtg ttatccacac acagaaagaa 420

actagcataa tctttattga cagcaccaaa agtttatctt ttttcatatt caagaaccaa 480

cccaccatgt ctgttgctct gatttgggtt gtttccccta attctgagct ctgcaaccga 540

ttggaaacaa caaagtttgc agatttatca aaatcaagaa actgtttgag ggccagcaaa 600

atcaagaatt ttgaaaagaa agacaaatgc aaatcttttt gctacatgaa tgcagatttc 660

agtgggtttt cgggatcgaa ttatgcgaaa aatccgggtt tgatttcgag ggtggtggct 720

aatccaggtg gggaattggc tgtttcatca gagcaattgg tttatgatgt ggttttgaag 780

caagcagctt tggttaaaga acaaatgaga tcaagagcag cagaagaagt agaagatgtt 840

gaggtcaaac cagatgttgt tcttcctggg acacttggtt tgttgaatga agcttatgat 900

agatgtggtg aagtttgtgc tgagtatgcc aagacttttt atttaggaac attgttgatg 960

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ctcgttgatg ggcctaatgc atcacatatt actcccaaag ctctagatcg atgggagtcg 1080

agattagagg atctttacaa cggacgccct tttgatatgc tcgatgctgc tttatcagat 1140

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gaactagcac aagccggatt gtcggatgaa gacatatttg caatgaaagt aaccgacaaa 1500

tggagattct tcatgaaaaa acaaataaaa cgagcaagaa cattctttga tcaagcagag 1560

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tatgtaagca agccgaagaa gatagttgct ttgccaattg cttatgcaaa atctctggtg 1740

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aatttactca ctatacagtt tagatgatga gaatggtcaa tatcatctgt aaatcacaaa 1860

ttgttgttac agattcaaag caaatataga atagaaatat ttgtttatgt ataaatccaa 1920

caagttgact a 1931

<210> 2

<211> 428

<212> PRT

<213> 万寿菊(Tagetes erecta)

<400> 2

Met Ser Val Ala Leu Ile Trp Val Val Ser Pro Asn Ser Glu Leu Cys

1 5 10 15

Asn Arg Leu Glu Thr Thr Lys Phe Ala Asp Leu Ser Lys Ser Arg Asn

20 25 30

Cys Leu Arg Ala Ser Lys Ile Lys Asn Phe Glu Lys Lys Asp Lys Cys

35 40 45

Lys Ser Phe Cys Tyr Met Asn Ala Asp Phe Ser Gly Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Tyr Ala Lys Asn Pro Gly Leu Ile Ser Arg Val Val Ala Asn Pro

65 70 75 80

Gly Gly Glu Leu Ala Val Ser Ser Glu Gln Leu Val Tyr Asp Val Val

85 90 95

Leu Lys Gln Ala Ala Leu Val Lys Glu Gln Met Arg Ser Arg Ala Ala

100 105 110

Glu Glu Val Glu Asp Val Glu Val Lys Pro Asp Val Val Leu Pro Gly

115 120 125

Thr Leu Gly Leu Leu Asn Glu Ala Tyr Asp Arg Cys Gly Glu Val Cys

130 135 140

Ala Glu Tyr Ala Lys Thr Phe Tyr Leu Gly Thr Leu Leu Met Thr Pro

145 150 155 160

Glu Arg Arg Lys Ala Ile Trp Ala Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr

165 170 175

Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro Asn Ala Ser His Ile Thr Pro Lys Ala

180 185 190

Leu Asp Arg Trp Glu Ser Arg Leu Glu Asp Leu Tyr Asn Gly Arg Pro

195 200 205

Phe Asp Met Leu Asp Ala Ala Leu Ser Asp Thr Val Ser Lys Phe Pro

210 215 220

Val Asp Ile Gln Pro Phe Lys Asp Met Ile Asp Gly Met Arg Met Asp

225 230 235 240

Leu Arg Lys Ser Arg Tyr Glu Asn Phe Asp Glu Leu Tyr Leu Tyr Cys

245 250 255

Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val Gly Leu Met Ser Val Pro Ile Met Gly

260 265 270

Ile Ala Pro Glu Ser Asn Ala Pro Thr Glu Ser Val Tyr Asn Ala Ala

275 280 285

Leu Ala Leu Gly Ile Ala Asn Gln Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val

290 295 300

Gly Glu Asp Ala Arg Arg Gly Arg Val Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu

305 310 315 320

Ala Gln Ala Gly Leu Ser Asp Glu Asp Ile Phe Ala Met Lys Val Thr

325 330 335

Asp Lys Trp Arg Phe Phe Met Lys Lys Gln Ile Lys Arg Ala Arg Thr

340 345 350

Phe Phe Asp Gln Ala Glu Glu Gly Val Thr Gln Leu Ser Ser Ala Ser

355 360 365

Arg Trp Pro Val Trp Ala Ser Leu Leu Leu Tyr Arg Gln Ile Leu Asp

370 375 380

Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr Asn Asn Phe Thr Lys Arg Ala Tyr Val

385 390 395 400

Ser Lys Pro Lys Lys Ile Val Ala Leu Pro Ile Ala Tyr Ala Lys Ser

405 410 415

Leu Val Pro Pro Ser Ser Arg Asn Leu Val Ser Asn

420 425

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

gatcttgaaa cctaacatgt ggtga 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tagtcaactt gttggattta tacat 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gctttaggca ttgctaatca actc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

caaatatgtc ttcatccgac aatc 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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taagacctgg tggtggaaat aga 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

cagcaccatg aggacgaaga 20

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ggggtaccct tttttcatat tcaagaacca ac 32

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

gcctcgagtt taccctctga tggcatgat 29