3-酮脂酰辅酶a硫解酶基因rkacaa1-2及其应用
阅读说明：本技术 3-酮脂酰辅酶a硫解酶基因rkacaa1-2及其应用 (3-ketoacyl-coenzyme A thiolase gene RKACAA1-2 and application thereof ) 是由 张琦 杨晓霞 陈功水 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种3-酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1-2,其核苷酸序列如SEQID NO:1所示,该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；该基因是从红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235中分离得到,将该基因通过转化转入到红冬孢酵母YM25235中,实验结果显示RKACAA1-2基因的过表达会引起YM25235菌株类胡萝卜素合成水平的提高；本发明通过基因工程手段对微生物进行改造,来提高微生物体内类胡萝卜素的产量,为类胡萝卜素大规模商业化生产奠定基础。(The invention discloses a 3-ketoacyl-coenzyme A thiolase gene RKACAA1 2, the nucleotide sequence of the gene is shown as SEQ ID NO. 1, and the amino acid sequence coded by the gene is shown as SEQ ID NO. 2; the gene is derived from Rhodosporidium toruloides ( Rhodosporidium kratochvilovae ) YM25235, transferring the gene into Rhodosporidium toruloides YM25235 by transformation, and showing the experimental results RKACAA1 Overexpression of the-2 gene leads to an increase in the carotenoid synthesis level of the YM25235 strain; the invention improves the microorganism by means of genetic engineering to improve the yield of carotenoid in the microorganism, and lays a foundation for large-scale commercial production of the carotenoid.)
技术领域
本发明属于生物
技术领域
和遗传工程领域，涉及一种3-酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1-2及其应用。背景技术
类胡萝卜素（Carotenoid）是一类重要天然色素的总称，属萜类物质中的一类，具有多个共轭双键，颜色一般呈黄色、橙色或红色。类胡萝卜素的结构以类异戊二烯为基本单位，大多数典型的类胡萝卜素化学结构中含有40个碳原子，由8个类异戊二烯聚合而成。依据碳骨架末端化学基团的类型，可将类胡萝卜素划分为两大类别。一类为含有环状结构的闭环式类胡萝卜素，如α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素、花青素等。另一类为不含有环状结构的开环式类胡萝卜素，如八氢番茄红素、番茄红素等。目前，已在高等植物、动物、真菌等生物体中发现800多种天然类胡萝卜素，其中有约50种能够转化为维生素A，α-胡萝卜素、β-叶黄素和β-胡萝卜素作为维生素A原对人体非常重要。
研究表明，类胡萝卜素是一类种类繁多、具有多种功能的脂溶性物质，其具有特殊营养价值，有转换为必需维生素的能力，它是一类能够给动植物提供天然色彩的重要天然色素，同时也是一种重要的抗氧化剂。典型的类胡萝卜素有β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素等，其中β-胡萝卜素具有抗氧化、抗癌、维生素A原、预防眼睛老年性黄斑病变、延缓衰老、提高免疫力等重要生理保健功能，番茄红素可以提高自身组织、细胞的抗氧化、增强免疫系统能力和效维持人体健康的作用，而叶黄素则是视网膜中黄斑色素的重要组成部分，可以过滤蓝光，防止视网膜受损等。类胡萝卜素种类繁多，不同的类胡萝卜素具有不同的生理功能，被广泛应用于医药、保健、食品、饲料的营养强化和着色等各个方面。
类胡萝卜素可通过生物（植物、微生物）提取法和化学合成法获取。其中化学合成色素的安全性备受质疑，一些化学合成类胡萝卜素（如虾青素）已被发现有害并且禁止药店销售。随着生物技术的发展和人们对食品安全的认识不断提高，生物提取法获得的天然来源的类胡萝卜素需求量越来越大。植物来源的天然类胡萝卜素生产成本相对较高，且受季节影响，而微生物来源的天然类胡萝卜素由于具有天然、高效、生产成本低、易实现工业化的优点而受到科研工作者的青睐。
发明内容
本发明提供了一种3-酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1-2，该基因是从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离得到；该基因核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示或与SEQ ID NO:1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1263bp（碱基），该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。
本发明另一目的是将上述3-酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1-2应用在促进微生物生产类胡萝卜素中。
所述红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae) YM25235具有生产周期短、遗传稳定、生产安全等优点。
上述目的通过以下技术方案实现，从红冬孢酵母YM25235中提取总RNA，然后反转录合成cDNA，以合成cDNA为模板，通过PCR扩增获得目的片段，将载体pRH2034进行双酶切、回收，用一步克隆法将目的片段和载体连接，获得重组质粒pRHRKACAA1-2，连接产物转入大肠杆菌中，通过PCR筛选出阳性单克隆，重组质粒pRHRKACAA1-2用BamHⅠ、EcoRⅤ两个限制性内切酶进行酶切验证，验证阳性的克隆子培养后提取质粒，测序，获得片段大小为1263bp的3-酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1-2；利用PEG介导的原生质体法将重组载体pRHRKACAA1-2转化至红冬孢酵母YM25235中，筛选转化子，获得RKACAA1-2的过表达菌株，过表达菌株经培养，利用紫外-可见分光光度计测量总类胡萝卜素的含量。
本发明从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235的总RNA基因中分离得到3-酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1-2，该基因全长1263bp；将该基因转入到红冬孢酵母YM25235中，实验结果显示RKACAA1-2基因的过表达会引起细胞内这个基因的转录水平在一定程度上的提高，说明外源基因在菌体内发生转录；RKACAA1-2基因的过表达能够促进总类胡萝卜素的合成；本研究结果为揭示微生物提高类胡萝卜素产量机制提供了参考，将有助于通过基因工程手段对其进行改造来提高类胡萝卜素含量，对类胡萝卜素的工业化生产提供良好的应用前景和经济效益，为大规模商业化生产类胡萝卜素奠定基础。
附图说明
图1为本发明的红冬孢酵母YM25235的RKACAA1-2基因PCR扩增图；1.DNA分子量标记DL2000；2.阴性对照；3.RKACAA1-2的cDNA片段；
图2为重组质粒pRHRKACAA1-2的质粒图谱；
图3为菌落PCR验证电泳图；1.DNA分子量标记DL2000；2.阴性对照；3. RKACAA1-2的cDNA片段；4-8为转化子；
图4 重组质粒pRHRKACAA1-2限制性酶切分析；1.DNA分子标量DL10000；2.阴性对照；3.空质粒pRH2034的BamHⅠ、EcoRⅤ双酶切；4.重组质粒pRHRKACAA1-2的BamHⅠ、EcoRⅤ双酶切；5.RKACAA1-2基因的cDNA片段；6. DNA分子标量DL2000；
图5为重组质粒pRHRKACAA1-2转化YM25235菌株阳性克隆验证；图中1. DNA分子标量DL2000；2.阴性对照；3.野生型菌株特异性基因条带；4.RKACAA1-2的cDNA片段；5.转化子验证；
图6为过表达菌株YM25235/pRHRKACAA1-2与对照菌株YM25235的总类胡萝卜素含量比较。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂，使用常规方法。
实施例1：从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离3-酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1-2及其过表达载体pRHRKACAA1-2的构建
采用生工生物工程（上海）股份有限公司的UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（产品编号: SK1321）提红冬孢酵母YM25235的总RNA，然后按照Vazyme公司试剂盒（产品编号：R212-02）HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)进行反转录合成cDNA，取1μL为模板进行聚合酶链式反应，根据转录组测序中发现的RKACAA1-2序列，设计特异性引物RKACAA1-2-F和RKACAA1-2-R，以上述得到的cDNA模板在PCR仪（北京六一生物科技有限公司）上进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：
RKACAA1-2-F: 5’-ATCACTCACCATGGCGGATCCTATGGCCAGCCTCATTTCG-3’ ，（单下划线部分为BamHⅠ位点，双下划线部分为同源臂）；
RKACAA1-2-R：5’-CCGGTCGGCATCTACGATATCCTACTCAGCGACGAAGAC-3’ ，（单下划线部分为EcoRⅤ位点，双下划线部分为同源臂）；
PCR扩增体系如下（50μL）：
；
扩增条件：95℃预变性5min，再用95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min15s，进行30个循环，最后72℃彻底延伸5min，反应完后取产物2μL，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析，结果如图1所示，扩增得到大小约1263bp的片段；将pRH2034经BamHⅠ、EcoRⅤ两个限制性内切酶进行双酶切；将以上两个片段用多功能DNA回收试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司，产品编号：DP1502）回收，使用无缝克隆试剂盒（Vazyme ClonExpressII One Step Cloning Kit，南京诺唯赞生物科技有限公司）把片段连接到载体pRH2034中，重组载体连接体系如下（20µL）：
；
使用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心将反应液收集至管底，然后37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却；
取10µL上面获得的连接产物加到100µL DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s后立即放置在冰上冷却90s，向连接体系中加入900µL LB液体培养基，于37℃、100rpm振荡培养1h，在5000rpm下离心10min后弃900µL上清，剩余约100µL左右培养基悬浮菌体并涂布含有100µg/mL壮观霉素(Spe+)的LB固体平板，于37℃倒置培养过夜，随机挑取5个平板上生长的白色菌落并编号为1-5号，通过菌落PCR验证阳性克隆，结果见图3，从图中可以看出挑取的五株单克隆菌株通过菌落PCR均扩增出与目的片段大小相同的特异性条带，说明挑取的五株DH5α菌株中均成功转入重组质粒；将验证阳性的克隆子接入LB液体培养基（含100µg/mL壮观霉素）中过夜培养，提取质粒（OMEGA Plasmid Mini Kit I，美国OMEGA公司），用BamHⅠ、EcoRⅤ两个限制性内切酶进行酶切验证；酶切验证结果见图4，从图中可以看出重组质粒pRHRKACAA1-2经BamHⅠ、EcoRⅤ双酶切后，出现与空质粒pRH2034的BamHⅠ、EcoRⅤ双酶切获得的线性载体片段大小相同的条带，以及与RKACAA1-2基因的cDNA片段大小相同的条带，说明重组质粒成功转入大肠杆菌DH5α菌株；酶切验证后，按相同方法提取质粒，测序（昆明擎科生物科技有限公司）。测序结果显示，所扩增得到的片段大小为1263bp，序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，命名为RKACAA1-2，与RKACAA1-2基因的cDNA片段大小及序列一致，说明成功构建表达载体pRHRKACAA1-2，重组载体pRHRKACAA1-2的质粒图谱见图2。
实施例2：RKACAA1-2基因与红冬孢酵母中类胡萝卜素合成关系的分析
1、转化红冬孢酵母YM25235
挑取成功转入正确重组载体pRHRKACAA1-2的DH5α菌株单克隆接入LB液体培养基（含100µg/mL壮观霉素）中过夜培养，提取质粒（OMEGA Plasmid Mini Kit I，美国OMEGA公司），并测量浓度，置于-20℃储存备用；挑取红冬孢酵母YM25235单菌落接种于5mL的YPD液体培养基中，于30℃、200rpm振荡培养过夜；将过夜培养的菌液按1%的接种量转接至50mL的YPD液体培养基中30℃、200rpm振荡培养至菌液OD600为0.5，将培养物于4℃、4500 rpm离心5min收集菌体；使用事先准备的柠檬酸缓冲液洗涤（30mM柠檬酸、83mM柠檬酸钠、600mM甘露醇、NaOH调pH值到5.4）菌体两次，并用1mL柠檬酸缓冲液悬浮菌体，于4℃、4000 rpm离心5min收集菌体，置于冰上备用；配制裂解酶液（0.156g蜗牛酶、0.08g溶壁酶，用ddH2O定容至5mL），用0.22μm无菌滤膜过滤酶液，置于50mL无菌离心管中备用；取4mL酶液与菌液混合后置于30℃、90rpm振荡培养酶解2.5h，将培养物于4℃、1300rpm离心10min收集菌体；用STC（1.2M山梨醇、10mMTris-HCl、100mMCaCl2）于冰上洗涤收集的菌体两次，制成酵母感受态细胞；将酵母感受态细胞按每管100μL分装到5mL无菌离心管中备用；向100μL感受态细胞中加入2-5μgpRHRKACAA1-2重组质粒并轻轻混匀（通常加入片段体积不应超过10μL），冰上孵育10min，加入200μL预冷的PTC（50%PEG、10mMTris-HCl、100mMCaCl2），冰浴10min，再加入800μL预冷的PTC，并轻轻混匀，冰浴10min，4℃、1500rpm离心10min收集菌体；加入1.6mL 0.4M蔗糖YPD液体培养基悬浮，30℃、90rpm振荡培养12h复苏菌体；将复苏的菌体于1300rpm离心10min收集菌体，弃上清剩余100μL培养基悬浮菌体，最后涂布于含130ug/mL潮霉素B（HygB+）的0.4M蔗糖YPD固体培养基上，于30℃倒置培养2-3d；将涂布后得到的转化子编号，并转接到含150μg/mL潮霉素（Hyg B+）YPD固体培培养基上，于30℃倒置培养2d；根据该基因已知功能，以颜色筛选转化子，具体操作为将所得转化子接入5mL YPD培养基，于30℃、200rpm振荡培养120h，以YM25235野生菌株作为对照，观察颜色，筛选出颜色较YM25235更红的转化子；挑取筛选出的转化子，然后按照上海生工生物工程股份有限公司DNA 提取试剂盒说明书中步骤提取酵母转化子的基因组 DNA，后进行PCR验证，结果如图5所示，从图中可以看出以酵母转化子的基因组为模板通过PCR可扩增出与RKACAA1-2的cDNA片段大小相同的条带，重组转化子的基因验证正确，说明RKACAA1-2cDNA片段已成功连入酵母转化子的基因组中。
2、RKACAA1-2基因过表达的红冬孢酵母YM25235中类胡萝卜素含量分析
将含pRHRKACAA1-2的过表达菌株在28℃条件下培养168h，提取类胡萝卜素，以野生型红冬孢酵母YM25235菌株为对照，利用紫外-可见分光光度计在445nm下测定总类胡萝卜素的含量（mg/g干菌体），含量如图6所示；由图可知，过表达菌株YM25235/pRHRKACAA1-2的总类胡萝卜素合成量较野生型红冬孢酵母YM25235菌株明显提高，野生型红冬孢酵母YM25235菌株的类胡萝卜素合成量为5.53±0.07mg/g，而过表达菌株YM25235/pRHRKACAA1-2类胡萝卜素合成量为8.38±0.06mg/g，即过表达菌株YM25235/pRHRKACAA1-2类胡萝卜素合成量是对照菌的1.51倍；结果显示3-酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1-2的过表达能引起红冬孢酵母YM25235菌株中总类胡萝卜素含量的增加，RKACAA1-2基因能够促进总类胡萝卜素的合成。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 3-酮脂酰辅酶A硫解酶基因RKACAA1-2及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1263
<212> DNA
<213> 红冬孢酵母YM25235(Rhodosporidium kratochvilovae YM25235)
<400> 1
atggccagcc tcatttcgtc caccctcgac tcgatccgcg gctccggcaa gagcaagctc 60
ctgcgcaaga gccccgacga tgtcgtcatc accatggcgg tccgtacgcc cctccagcgc 120
gcgcgcaagg gcggcttcaa ggacatgagc gtccaggagc tcctcattgc cttcttcaag 180
acctccatcc ccgagatgaa gatcgacccg gccctcattg gcgacatctg cgtcggcact 240
gtcctcccgc ccaaggcgcc gtacgacgcc cgtgctgccg ccctcgcgtc cggcattccc 300
gaaaccgtcc ctcttcagat catcaaccgc ttctgctctt cgggcctcat ggccgtcgcc 360
aacattgcaa accagatccg caacggcgag atcgagattg gtcttgcggt cggctttgag 420
agcatgagcg cgactccgga caggggcgcg gacagctttg cggaggaggt cctcgcgcac 480
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ctcgttacct ccatgtgcat tggtctcggc atgggcgcag cgtcggtctt cgtcgctgag 1260
tag 1263
<210> 2
<211> 420
<212> PRT
<213> 红冬孢酵母YM25235(Rhodosporidium kratochvilovae YM25235)
<400> 2
Met Ala Ser Leu Ile Ser Ser Thr Leu Asp Ser Ile Arg Gly Ser Gly
1 5 10 15
Lys Ser Lys Leu Leu Arg Lys Ser Pro Asp Asp Val Val Ile Thr Met
20 25 30
Ala Val Arg Thr Pro Leu Gln Arg Ala Arg Lys Gly Gly Phe Lys Asp
35 40 45
Met Ser Val Gln Glu Leu Leu Ile Ala Phe Phe Lys Thr Ser Ile Pro
50 55 60
Glu Met Lys Ile Asp Pro Ala Leu Ile Gly Asp Ile Cys Val Gly Thr
65 70 75 80
Val Leu Pro Pro Lys Ala Pro Tyr Asp Ala Arg Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Ser Gly Ile Pro Glu Thr Val Pro Leu Gln Ile Ile Asn Arg Phe Cys
100 105 110
Ser Ser Gly Leu Met Ala Val Ala Asn Ile Ala Asn Gln Ile Arg Asn
115 120 125
Gly Glu Ile Glu Ile Gly Leu Ala Val Gly Phe Glu Ser Met Ser Ala
130 135 140
Thr Pro Asp Arg Gly Ala Asp Ser Phe Ala Glu Glu Val Leu Ala His
145 150 155 160
Pro Val Ala Lys Asp Thr Gln Phe Pro Met Gly Trp Thr Ser Glu Asn
165 170 175
Val Ser Ser Asp Phe Asn Ile Thr Arg Glu Arg Met Asp Glu Leu Ala
180 185 190
Ala Ile Ser Gln Gln Arg Ala Ala Gln Ala Gln Ala Ala Gly Leu Phe
195 200 205
Asp Lys Glu Ile Ile Pro Ile Glu Ala Leu Gln Ala Pro Ser Thr Pro
210 215 220
Ala Ala Ala Gly Ala Pro Ala Pro Gln Arg Val Lys Val Leu Val Thr
225 230 235 240
Lys Asp Asp Gly Ile Arg Pro Gly Thr Thr Lys Glu Gly Leu Gly Lys
245 250 255
Ile Arg Gln Ala Phe Pro Gln Trp Gly Asn Gly Thr Thr Thr Gly Gly
260 265 270
Asn Ala Ser Gln Ile Thr Asp Gly Ala Ala Gly Val Leu Leu Met Thr
275 280 285
Arg Arg Lys Ala Glu Glu Leu Gly Leu Glu Ile Leu Gly Lys His Val
290 295 300
Ala Thr Ser Val Ala Gly Leu Pro Pro Arg Ile Met Gly Ile Gly Pro
305 310 315 320
Ala Phe Ala Ile Pro Lys Val Leu Ala Arg Cys Gly Ile Ser Lys Glu
325 330 335
Asp Val Asp Leu Trp Glu Val Asn Glu Ala Phe Ala Ser Met Leu Ser
340 345 350
Tyr Cys Ile Asp Ile Phe Gly Leu Pro His Asp Lys Val Asn Val Lys
355 360 365
Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Leu Gly Cys Thr Gly Ala Arg
370 375 380
Gln Ile Ala Thr Gly Leu His Glu Ile Arg Arg Arg Glu Gly Lys Ile
385 390 395 400
Leu Val Thr Ser Met Cys Ile Gly Leu Gly Met Gly Ala Ala Ser Val
405 410 415
Phe Val Ala Glu
420
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
atcactcacc atggcggatc ctatggccag cctcatttcg 40
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
ccggtcggca tctacgatat cctactcagc gacgaagac 39
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