具体实施方式

本发明公开了微藻蛋白激酶N_OS1P基因及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的目的是提供蛋白激酶NoS1P基因及其编码蛋白。

本发明的另一目的是提供蛋白激酶NoS1P基因在提高微藻和植物油脂合成能力中的应用。

为了实现本发明目的，本发明从海洋微拟球藻中克隆获得蛋白激酶NoS1P基因，NoS1P基因的cDNA序列为：

i)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

测序结果表明，蛋白激酶NoS1P为蛋白激酶家族成员，蛋白激酶NoS1P基因开放阅读框全长为1878bp，编码由625个氨基酸组成的蛋白(SEQ ID No.2)。通过对蛋白激酶NoS1P基因的生物信息学分析和受高光、缺氮等胁迫时的表达模式判断，该基因可能参与微藻等的油脂代谢调控途径。

本发明还提供含有所述蛋白激酶NoS1P基因的表达盒。

本发明还提供含有蛋白激酶所述NoS1P基因的过表达载体。

携带有所述目的基因的过表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中或微藻细胞中。

本发明还提供过表达蛋白激酶NoS1P基因编码区的微藻工程细胞。

本发明还提供所述蛋白激酶NoS1P基因在提高微藻(如微拟球藻等)提高油脂合成能力中的应用。

本发明还提供所述蛋白激酶NoS1P基因在制备转基因微藻中的应用。

本发明还提供一种转基因微藻的构建方法。

本发明进一步提供蛋白激酶NoS1P基因的荧光定量PCR检测引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，引物序列如下：

上游引物SEQ ID No.5序列

NoS1P-QF：5’-GGCGGTTGCCCCTGTAGA-3’

下游引物SEQ ID No.6序列

NoS1P-QR：5’-TCGGGAAATGAGGTCTTGGA-3’。

可用于检测微拟球藻工程细胞中蛋白激酶NoS1P基因的表达情况，结果表明，工程细胞中NoS1P基因的转录水平高于野生型。

可用于检测蛋白激酶NoS1P基因的表达情况，结果表明，蛋白激酶NoS1P基因受到高光，氮不足胁迫的诱导表达。

可用于检测野生型藻株、过表达藻株的干重，油脂含量，中性脂含量，结果表明，过表达海洋微拟球藻藻株的总脂含量，中性脂含量显著高于野生型藻株(P<0.05)。

本发明提供的微藻蛋白激酶N_OS1P基因及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：蛋白激酶NoS1P基因克隆

1.提取微拟球藻的总RNA，反转录得到cDNA第一链。

2.以cDNA第一链为模板，设计上游SEQ ID No.3和下游引物SEQ ID NO：4为引物，通过PCR扩增反应获得NoS1P基因的cDNA序列。

引物序列如下：

SEQ ID No.3：

5’-AGGATGACGATGACAAGCATGCACTGCCCTAATAAGAGAATG-3’，

SEQ ID No.4：

5’-TCCTCCTGGGATCCCCCGGGATCACCTATACTCCCTTTGAAG-3’。

使用2×Taq PCR MasterMix(Takara)进行PCR扩增，反应体系为：cDNA模板2微升，引物F、R(10μmol/L)各1微升，2×PCR MasterMix 25微升，加ddH₂O至50微升。

PCR扩增程序为：94℃变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火90秒，72℃延伸2分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。

3.扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，测序。

4.切下目的片段，凝胶回收纯化，并克隆到pMD18-T载体上，经菌落PCR检测，送上海生工生物技术有限公司进行测序验证，测序验证正确的质粒命名为NoS1P-18T。NoS1P基因cDNA序列(SEQ ID No.1)为1878bp，编码由625个氨基酸组成的蛋白NoS1P(SEQ IDNo.2)。

实施例2：过表达NoS1P基因的微拟球藻工程细胞的制备

1.菌株及其培养：微拟球藻在F2固体培养基和F2液体培养基生长。

2.抗性基因标签法构建微拟球藻的过表达载体，采用博来霉素抗性标签。按照本领域技术人员熟悉的分子生物学技术，扩增抗性标签，采用适当的限制性内切酶切割含有筛选标记的片段，转化微拟球藻。

3.电转化微拟球藻细胞，将含有抗性标签的片段导入细胞。即0.5微克线性化的质粒和600万个藻细胞放在0.2厘米电转化槽(Bio-Rad)，2.2kV脉冲(Bio-Rad电转化仪，50μF)。

4.通过抗生素筛选并根据下述蛋白激酶NoS1P基因特异的引物鉴定含有蛋白激酶NoS1P基因过表达外源载体的转化子细胞。

5’-TTTAACTAGGATACTGCCGGGTG-3’(如SEQ ID No.7所示)

5’-TTACGGCTGAAGTCCACATCCT-3’(如SEQ ID No.8所示)。

实施例3：工程细胞NoS1P基因转录水平鉴定

1.用离心管取S1Poe藻株样品一定量于1.5毫升离心管中，使用艾德莱植物RNA提取试剂盒提取S1Poe RNA。

2.取500微升CLB裂解液至1.5毫升离心管(若裂解液有晶体析出，在65℃水浴中一段时间即可)，向裂解液中加入25微升5％β-巯基乙醇，上述溶液混匀后于65℃预热。

3.研磨用玻璃珠于200℃烘箱中烘烤3小时，室温晾凉。取适量晾干后的玻璃珠和100微升晾凉的裂解液于样品中，珠磨器振荡1-2分钟。将剩余的425微升的裂解液加入样品中，振荡器振荡15秒。65℃水浴5分钟，每分钟颠倒混匀一次。

4.上述产物于离心机中13000r/min，10分钟。收集500微升上清液于新的离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，移液枪吹打混匀。

5.将上述溶液全部转移至基因组清除柱中(注意每次应少于700微升溶液，需要离心后分次加入)，13000r/min，2分钟离心，倒掉滤液。

6.将基因组清除柱重新放到新的离心管中，加入500微升RLT plus裂解液，13000r/min，30秒离心。收集滤液，加入0.5倍体积的无水乙醇混匀。

7.将上述混合液加入一个新的吸附柱中，13000r/min，2分钟离心。弃掉滤液后向吸附柱中加入700微升去蛋白液，室温放置1分钟，13000r/min，2分钟离心，倒掉滤液。

8.向上述步骤的吸附柱中加入500微升的漂洗液，13000r/min，2分钟离心，弃掉滤液。重复该步骤一次，将弃掉滤液的吸附柱13000r/min，2分钟离心一次。

9.将吸附柱取出，放在无酶离心管中，加入30-50微升无酶水，室温放置溶液解1分钟，13000r/min，1分钟。凝胶电泳验证后，-20℃保存备用。

10.使用TaKaRa PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒按如下体系配制溶液去除基因组DNA，于冰上进行。

表1

混匀该溶液，PCR仪预热后，42℃条件下，反应2分钟，4℃保温。

11.使用TaKaRaPrimeScript^TMRT reagent Kitwith gDNA Eraser试剂盒将RNA反转为cDNA，按如下表配制反应体系，于冰上进行。

表2

混匀，PCR仪预热后，设置反转录条件37℃，15分钟；85℃，5秒；4℃。

12.荧光定量检测S1P基因表达水平。

表3

荧光定量操作为：

step1：预变性，95℃，30s，20℃/s，1cycle。

step2：PCR反应，95℃，5s，20℃/s；55℃，30s，20℃/s；72℃，30s，20℃/s，40cycles。

Step3：，绘制溶解曲线。

95℃，0s，20℃/s

65℃，15s，20℃/s

95℃，0s，0.1℃/s

检测结果如图2～4、表4所示，S1Poe的NoS1P相对表达量显著高于野生型海洋微拟球藻藻株。

表4.高光(200μmol/m²/s^-1)，氮不足培养下WT，33-2，33-6的S1P基因相对表达量

其中，33-2对应图1中的2号泳道，33-6对应图1中的6号泳道。

33-2和33-6都是SIP过表达的转化子，均为本发明实验过程中筛选到的微拟球藻。

实施例4：过表达蛋白激酶NoS1P基因的微拟球藻工程细胞生产油脂

利用实施例1中获得的过表达NoS1P基因的微拟球藻工程细胞S1Poe，用于油脂生产，具体方法如下：

活化微拟球藻野生型和S1Poe藻株，分别接种于含有新鲜改良型的F2培养基的光生物反应器中(PBR；直径33mm，高60cm)。

将PBR置于表5设定的培养条件下培养，高光(200μmol/m²/s^-1)，氮不足即为改良型的F2培养基不添加作为氮源的硝酸钠。

改良型的F2培养基，35g/L海盐的自制海水，1.21g Tris，1000mg/LNaNO₃，67mg/LNaH₂PO₄·H₂O，0.0196mg/L CuSO₄·5H₂O，0.0126mg/LNaMoO₄·2H₂O，0.044mg/L ZnSO₄·7H₂O，0.01092mg/L CoCl₂·6H₂O，0.36mg/L MnCl₂·4H₂O，3.65mg/L FeCl₃·6H₂O，4.37mg/LNa₂EDTA·2H₂O，0.005mg/L钴胺素，0.005mg/L生物素，0.1mg/L盐酸硫胺素

八天后收集细胞，测定干重和总脂含量。

结果表明，缺氮处理下，与野生型对比，微拟球藻株S1Poe的油脂含量有所提高(图5～6)。

表5.高光(200μmol/m²/s^-1)，氮不足，高光和缺氮培养下WT、33-2、33-6的油脂含量和TAG含量

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南大学

<120> 提高海洋微拟球藻油脂合成的基因及其用途

<130> MP2028191

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1878

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcaagcct tcgtgaccag catcttctgt cgcaccaagt ctgacatctc cagctccacg 60

tccgcctcct ccactgccgt gtctgacaaa cctcctcggc cacccattcc catcaccgtc 120

acagacgtaa attcgacgac agatacgtat tctttttcct ttcctaaagt gttgaacaag 180

gaggaggacg aggaggggga ggacgaggag gacgacgaag atactgtggc tacagcgctc 240

agcaatgcgt gcatcaccga aagtgcgaag gaaaaggaag caatgaagga tgtcccgcag 300

cttgacctgg tatttgtggt tgactctacg agctcaatgg atgcctacat ccgagcagcg 360

caagagagca tccacggcat catcacccgc ctggcctgcg atgacggggt ctctgtccgc 420

tttgctctta tctcttaccg agatcatgct ccacaggact cttcctacgt gacgcgggtc 480

ttcccattca cctcccacct accaaccatc accgacaacg taaacagcat aacggctgaa 540

ggcggaggtg acggtcccga agccatggcg gacgccctgt acgacctcct tcatcttgaa 600

tggcgctcct ccctccctcc ctctccttcc tcctcccctt cgatccagac aagcaaagtc 660

gctgtgctca ttgccgatgc tccccctcac ggattgggag agcgtgaaga cggttttcca 720

aatggctgcc ctctccatca tgaccctctc gctttgactc gacagctcgc agcttgcggc 780

attactctct atactgtggg gtgtgaaccc gccatttcca cctatgagaa ttgtaaggat 840

atattgatct ttatggcgga ggcaacggga gggcaggcct tggtgctgga gagtgcgagt 900

ctgttggctt ctgttatttt agcgggggcg caggaggagg tggggctgac acgactggag 960

agggaggtga aggaggtgat gagggaggca gggagggagg caggggaaga ggaggatgaa 1020

gatgtgtggg tggcgagggt taaggaggcg ttgaggagga aagggactag aacaaggcag 1080

ttaaagacaa acatgaggag gatgacgtca gttcaaactg aggtgattgc gtcatgctct 1140

tcccttgagg aggcgaagag gaggttgggg agcgagagag cgcgggaggt agaggaggaa 1200

aacggggaga gggtatcgat atcgacgggc ctgtcgagta ggtcgtttgt gtctgcggcg 1260

gaggcggttg cccctgtaga catgcgttgg gaagcggaca attcgtcgtc aatgccgact 1320

tcaggtgtag gatgggaagg agagagggag ggaggaaagg gcggaggacg aggttgcgga 1380

cgactcatgg tccaagacct catttcccga cggggaggcg gtggtattat ttccgctcct 1440

actgttcgtg ctgctcctac tcatgctgct gctaccacta cgactactgt tggtgcagcc 1500

acccctactt ctactgctgc tactgagata ccgtccgcag aagccacgcc gaaaagaggt 1560

ggtcttcctc ggagcaggga gaaggagctt tcggcctccc acactgaagc gaccgataca 1620

tttccacgga ctgtggttcc tactccatgc tcctcttccg tctcctcctc ctcctccccc 1680

ttcctcccgg cccccctctt ctcccccacg catacgtact cgcttacggc atgtgccacg 1740

gttggtgctg gaggaggagg aggaagggct ggtgggcggg agggagggag ggccgaggtg 1800

gcggaagagg agatttcgat cgatcaaatt cgacggttgg tccgcaaagc ccagagcctt 1860

caaagggagt ataggtga 1878

<210> 2

<211> 625

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Ala Phe Val Thr Ser Ile Phe Cys Arg Thr Lys Ser Asp Ile

1 5 10 15

Ser Ser Ser Thr Ser Ala Ser Ser Thr Ala Val Ser Asp Lys Pro Pro

20 25 30

Arg Pro Pro Ile Pro Ile Thr Val Thr Asp Val Asn Ser Thr Thr Asp

35 40 45

Thr Tyr Ser Phe Ser Phe Pro Lys Val Leu Asn Lys Glu Glu Asp Glu

50 55 60

Glu Gly Glu Asp Glu Glu Asp Asp Glu Asp Thr Val Ala Thr Ala Leu

65 70 75 80

Ser Asn Ala Cys Ile Thr Glu Ser Ala Lys Glu Lys Glu Ala Met Lys

85 90 95

Asp Val Pro Gln Leu Asp Leu Val Phe Val Val Asp Ser Thr Ser Ser

100 105 110

Met Asp Ala Tyr Ile Arg Ala Ala Gln Glu Ser Ile His Gly Ile Ile

115 120 125

Thr Arg Leu Ala Cys Asp Asp Gly Val Ser Val Arg Phe Ala Leu Ile

130 135 140

Ser Tyr Arg Asp His Ala Pro Gln Asp Ser Ser Tyr Val Thr Arg Val

145 150 155 160

Phe Pro Phe Thr Ser His Leu Pro Thr Ile Thr Asp Asn Val Asn Ser

165 170 175

Ile Thr Ala Glu Gly Gly Gly Asp Gly Pro Glu Ala Met Ala Asp Ala

180 185 190

Leu Tyr Asp Leu Leu His Leu Glu Trp Arg Ser Ser Leu Pro Pro Ser

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Pro Ser Ile Gln Thr Ser Lys Val Ala Val Leu Ile

210 215 220

Ala Asp Ala Pro Pro His Gly Leu Gly Glu Arg Glu Asp Gly Phe Pro

225 230 235 240

Asn Gly Cys Pro Leu His His Asp Pro Leu Ala Leu Thr Arg Gln Leu

245 250 255

Ala Ala Cys Gly Ile Thr Leu Tyr Thr Val Gly Cys Glu Pro Ala Ile

260 265 270

Ser Thr Tyr Glu Asn Cys Lys Asp Ile Leu Ile Phe Met Ala Glu Ala

275 280 285

Thr Gly Gly Gln Ala Leu Val Leu Glu Ser Ala Ser Leu Leu Ala Ser

290 295 300

Val Ile Leu Ala Gly Ala Gln Glu Glu Val Gly Leu Thr Arg Leu Glu

305 310 315 320

Arg Glu Val Lys Glu Val Met Arg Glu Ala Gly Arg Glu Ala Gly Glu

325 330 335

Glu Glu Asp Glu Asp Val Trp Val Ala Arg Val Lys Glu Ala Leu Arg

340 345 350

Arg Lys Gly Thr Arg Thr Arg Gln Leu Lys Thr Asn Met Arg Arg Met

355 360 365

Thr Ser Val Gln Thr Glu Val Ile Ala Ser Cys Ser Ser Leu Glu Glu

370 375 380

Ala Lys Arg Arg Leu Gly Ser Glu Arg Ala Arg Glu Val Glu Glu Glu

385 390 395 400

Asn Gly Glu Arg Val Ser Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ser Arg Ser Phe

405 410 415

Val Ser Ala Ala Glu Ala Val Ala Pro Val Asp Met Arg Trp Glu Ala

420 425 430

Asp Asn Ser Ser Ser Met Pro Thr Ser Gly Val Gly Trp Glu Gly Glu

435 440 445

Arg Glu Gly Gly Lys Gly Gly Gly Arg Gly Cys Gly Arg Leu Met Val

450 455 460

Gln Asp Leu Ile Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ile Ile Ser Ala Pro

465 470 475 480

Thr Val Arg Ala Ala Pro Thr His Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr

485 490 495

Val Gly Ala Ala Thr Pro Thr Ser Thr Ala Ala Thr Glu Ile Pro Ser

500 505 510

Ala Glu Ala Thr Pro Lys Arg Gly Gly Leu Pro Arg Ser Arg Glu Lys

515 520 525

Glu Leu Ser Ala Ser His Thr Glu Ala Thr Asp Thr Phe Pro Arg Thr

530 535 540

Val Val Pro Thr Pro Cys Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Ser Ser Pro

545 550 555 560

Phe Leu Pro Ala Pro Leu Phe Ser Pro Thr His Thr Tyr Ser Leu Thr

565 570 575

Ala Cys Ala Thr Val Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Arg Ala Gly Gly

580 585 590

Arg Glu Gly Gly Arg Ala Glu Val Ala Glu Glu Glu Ile Ser Ile Asp

595 600 605

Gln Ile Arg Arg Leu Val Arg Lys Ala Gln Ser Leu Gln Arg Glu Tyr

610 615 620

Arg

625

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggatgacga tgacaagcat gcactgccct aataagagaa tg 42

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcctcctggg atcccccggg atcacctata ctccctttga ag 42

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcggttgcc cctgtaga 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgggaaatg aggtcttgga 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tttaactagg atactgccgg gtg 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttacggctga agtccacatc ct 22