具体实施方式

本发明提供了VdILV6基因在大丽轮枝菌生长发育中的应用。

在本发明中，所述生长发育优选包括生长速度、繁殖体产量、休眠体产量。所述繁殖体优选包括分生孢子。所述休眠体优选包括微菌核。

在本发明中，所述VdILV6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板通过克隆测序得到AHAS的调节亚基基因VdILV6。VdILV6基因预测编码蛋白含有693个氨基酸。序列分析显示，包含一个ACT结构域和一个C-末端AHAS小亚基(见图1)。

为了明确VdILV6基因敲除是否影响大丽轮枝菌分生孢子的形成，本发明在野生型菌株V592为基础菌株构建了敲除VdILV6基因的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV6，并在ΔVdILV6基础上进行基因互补，得到互补菌株ECVdILV6。所述敲除VdILV6基因的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV6的构建方法利用同源重组原理完成，具体可参见现有技术获得敲除以及互补突变体(WANG S,XING H,HUA C,GUO H S,ZHANG J.An improved single-step cloningstrategy simplifies the Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation(ATMT)-based gene-disruption method for Verticillium dahliae.Phytopathology,2016,106(6):645-652.)。

在本发明中，以野生型菌株V592、ΔVdILV6和ECVdILV6为实验对象进行一系列实验，结果表明，VdILV6基因敲除降低大丽轮枝菌菌落生长速度，同时促进大丽轮枝菌的气生菌丝的大量产生，改变了真菌的菌丝生长形态。VdILV6基因敲除使大丽轮枝菌在玻璃纸上不形成微菌核，微菌核是大丽轮枝菌生长侵染循环中的初侵染源，在土壤中的抗逆境能力强，在土壤中存活时间长导致棉花黄萎病的防治困难。VdILV6基因敲除后不形成微菌核，可采用HIGS技术，沉默VdILV6基因为棉花黄萎病的防治提供新思路。

VdILV6基因敲除使大丽轮枝菌的分生孢子量降低，说明VdILV6基因敲除有利于使大丽轮枝菌的传播能力和繁殖能力下降，有利于降低大丽轮枝菌感染寄主，降低病害发生和发展的几率。

本发明提供了VdILV6基因在大丽轮枝菌致病力中的应用。

在本发明中，所述致病力优选表现在以下指标中的一种或几种上:病情指数、微管束褐变程度、菌丝穿透能力和寄主定殖能力。

在本发明中，以野生型菌株V592、ΔVdILV6和ECVdILV6为实验对象进行致病力测定，结果表明，VdILV6基因敲除使大丽轮枝菌所致病害症状减轻最为明显，病情指数分别为16.4～18.2；互补菌株的致病力明显恢复至野生型菌株的水平，病情指数高于90。菌种接种30d时，对感病植株进行剖杆观察，敲除突变体ΔVdILV6-1和ΔVdILV6-2几乎不引起维管束褐变，这与其病情指数的结果也是一致。VdILV6基因敲除对导致大丽轮枝菌在玻璃纸上的的穿透能力丧失。同时，真菌生物量测定实验结果表明，VdILV6基因敲除使大丽轮枝菌在棉花的根和茎中定殖明显受阻，这明显降低了在棉花组织中定殖的能力。综合上述结果可知，VdILV6基因与大丽轮枝菌的致病力有关。

本发明提供了VdILV6基因在大丽轮枝菌支链氨基酸合成中的应用。

在本发明中，所述支链氨基酸优选包括以下一种或几种氨基酸：Val、Ile和Leu。实验证明，VdILV6基因敲除导致大丽轮枝菌在缺乏支链氨基酸的培养上难以生长，而添加额外的支链氨基酸后，VdILV6基因敲除突变体生长缺陷被减轻，Val和Ile能够补充VdILV6基因敲除突变体生长所需的氨基酸，这表明VdILV6参与了Val和Ile的生物合成途径，并且高浓度的Leu会反馈抑制野生型菌株V592和互补菌株的生长。并且Leu抑制VdILV6基因的表达，说明VdILV6基因与Leu的生物合成途径相关。上述实验表明，VdILV6基因参与了支链氨基酸的生物合成，是支链氨基酸生物合成的重要组成部分。

鉴于VdILV6基因与大丽轮枝菌的生长与致病力直接相关，并且敲除VdILV6基因后有利于降低大丽轮枝菌的致病力和生长性能，因此，本发明提供了一种棉花病害防治的药物，包括下调VdILV6基因或蛋白表达的试剂。

在本发明中，所述试剂优选包括磺酰脲类除草剂和/或嘧啶水杨酸类除草剂。本发明对所述磺酰脲类除草剂的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的磺酰脲类除草剂的种类即可，例如苯磺隆。本发明对所述嘧啶水杨酸类除草剂的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的嘧啶水杨酸类除草剂的种类即可，例如双草醚。所述磺酰脲类除草剂优选包括苯磺隆。所述磺酰脲类除草剂的浓度优选不低于400mg/L，更优选为409.6～1638.4mg/L。所述嘧啶水杨酸类除草剂优选包括双草醚。所述嘧啶水杨酸类除草剂的浓度优选不低于400mg/L，更优选为409.6～1638.4mg/L。实验证明，苯磺隆和双草醚明显抑制了大丽轮枝菌的生长，并且导致大丽轮枝菌不产生微菌核，说明能有效防治大丽轮枝菌引起的病害。通过检测处理后的野生型菌株V592，苯磺隆和双草醚都能抑制VdILV6基因的表达，再次证明，VdILV6是支链氨基酸合成的必需基因。

本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的杀菌剂的制备方法即可。本发明对所述药物的使用方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物的使用方法即可。所述药物通过降低VdILV6基因的致病力达到防控病害发生和发展的目的。

鉴于磺酰脲类除草剂和/或嘧啶水杨酸类除草剂直接下调VdILV6基因，而VdILV6基因下调可降低大丽轮枝菌的生长性能、致病力和营养合成能力，因此，大丽轮枝菌VdILV6基因作为药物靶点在防治棉花病害中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的VdILV6基因在大丽轮枝菌生长发育、致病力和支链氨基酸合成中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种敲除VdILV6基因的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV6的构建方法

根据VdILV6基因(核苷酸序列如SEQIDNO:1所示)上下游同源臂设计引物，构建敲除载体，以野生型菌株V592为初始菌株，构建突变株。具体参见现有技术(WANG S,XING H,HUA C,GUO H S,ZHANG J.An improved single-step cloning strategy simplifies theAgrobacterium tumefaciens- mediated transformation(ATMT)-based gene-disruption method for Verticillium dahliae.Phytopathology,2016,106(6):645-652.)获得敲除VdILV6基因的大丽轮枝菌突变株(ΔVdILV6-1，ΔVdILV6-2)。

实施例2

一种大丽轮枝菌VdILV6基因互补突变体ECVdILV6的构建方法

以实施例1构建的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV6为初始菌株，参见现有技术(WANGS,XING H,HUA C,GUO H S,ZHANG J.An improved single-step cloning strategysimplifies the Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation(ATMT)-basedgene-disruption method for Verticillium dahliae.Phytopathology,2016,106(6):645-652.)获得大丽轮枝菌VdILV6基因互补突变体(ECVdILV6-1和ΔVdILV6-2)。

实施例3

1.菌落生长速率的测定

以实施例1制备的敲除VdILV6基因的大丽轮枝菌突变株、实施例2制备的VdILV6基因互补突变体以及野生型菌株V592为实验对象进行培养，分别取挑菌丝接种于PDA培养基中央，22℃黑暗培养。于接种后的第5天以及第9天，测量所有菌株的菌落直径，按照式I计算菌落的平均生长速率。

菌落的平均生长速率＝(菌落生长速度＝(第9d平均菌落生长直径-第5d菌落平均生长直径)/4) 式I。

每个菌株设置3个重复，在第15天拍照记录菌落形态。

2.菌丝的形态观察

大丽轮枝菌不同菌株在PDA平板上划线培养，再将灭菌的盖玻片斜插到划线部位，22℃暗培养3d，取出盖玻片在显微镜下观察菌丝生长情况。

结果见图2。VdILV6基因敲除突变体的菌落生长速率显著低于V592菌株，并且产生更多的气生菌丝，改变了大丽轮枝菌的菌丝形态。

实施例4

微菌核量的测定

以实施例1制备的敲除VdILV6基因的大丽轮枝菌突变株、实施例2制备的VdILV6基因互补突变体以及野生型菌株V592为实验对象进行培养，得到菌病。分别用打孔器对每种菌株打取10个左右菌饼接种于查氏(含kan)液体培养基中，26℃摇床中200r/min摇培3～5d；过滤收集分生孢子；调孢子浓度将分生孢子浓度调为1.0×10⁶CFU/mL，吸取100μL均匀涂布于平铺玻璃纸的MM平板(NaNO₃ 2g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、KCl 0.5g，柠檬酸10mg,ZnSO₄·7H₂O 10mg、FeSO₄·7H₂O 10mg，NH₄Fe(SO₄)₂)·12H₂O 2.6mg，CuSO₄·7H₂O0.5mg，NnSO₄·H₂O 0.1mg，H₃BO₃ 0.1mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.1mg，葡萄糖2g，1.5琼脂，加蒸馏水至1L。113℃，高压灭菌20min)上，22℃黑暗条件培养15d，拍照观察，刮取玻璃纸上的培养物并进行称重测量，并记录其湿重，再将微菌核在室温下放置48h晾干，在天平上称量，记录其干重数据。

结果表明，VdILV6基因敲除突变体在玻璃纸上不形成微菌核，在显微镜下也观察不到微菌核，而V592菌株和互补菌株在显微镜下均形成微菌核聚集体(图3)。因为微菌核是大丽轮枝菌生长侵染循环中的初侵染源，这表明VdILV6基因能降低大丽轮枝菌的侵染性能，从而降低其致病性。

实施例5

为了明确VdILV6基因敲除是否影响大丽轮枝菌分生孢子的形成，具体测定方法如下：

将浓度均为1.0×10⁶CFU/mL的敲除突变体(实施例1构建所得菌株)、互补菌株(实施例2构建所得菌株)和V592分别接种到Czapek-Dox液体培养基中，在26℃、200r/min条件下摇培5d，分离孢子。将吸取1.0×10⁶CFU/mL的孢子悬浮液100μL接种于查氏(含kan)培养基中。每个菌株设置3个生物学重复实验，在26℃摇床中200r/min速度振荡培养，期间每隔24h吸取1mL菌液，连续7d用血球计数板测量孢子浓度并记录数据。

结果显示，在接种第7d时ΔVdILV6突变体产生的孢子仅为野生型菌株V592的7.2％和8.4％；所有互补菌株的产孢量几乎都恢复至野生型菌菌株的水平(图4)。显微镜下观察突变体的产孢梗，ΔVdILV6突变体与V592菌株相比，菌丝体几乎不产生轮状分枝的产孢梗，互补菌株的产孢梗恢复至野生型菌株的水平(图5)。

实施例6

为了明确VdILV6基因敲除对大丽轮枝菌致病力的影响，以野生型菌株V592和互补菌株为对照，测定了VdILV6基因敲除突变体对棉花的致病力。致病性测定方法如下：

把上述构建的敲除突变体、互补菌株和V592接种到Czapek-Dox液体培养基中26℃，200r/min摇培5d。棉苗第5片真叶长出后，通过使用根浸接种方法，每盆棉花接种200mL浓度为1.0×10⁷CFU/mL的菌液，每个菌株重复3个水培盒(共36株棉苗)。接种后每天都观察，从发病开始数病指，每隔3d数一次一般记录到发病后一个月，病害分级标准为：0级：不发病；1级：1～2片子叶发病；2级：1片真叶发病；3级：2片真叶发病；4级：3片及3片以上真叶发病。病情指数按照式II计算。

病情指数＝[Σ各级病株数×级数/(总株数×最高病级)]×100 式II

病情指数为3次生物学实验重复平均值。

第30天剖秆，用体式显微镜拍照维管束(Olympus SZX7,Japan)。

结果显示，敲除突变体ΔVdILV6-1和ΔVdILV6-2所致病害症状减轻最为明显，病情指数分别为18.2和16.4；互补菌株的致病力明显恢复至野生型菌株的水平，病情指数高于90。接种30d时，对感病植株进行剖杆观察，敲除突变体ΔVdILV6-1和ΔVdILV6-2几乎不引起维管束褐变，这与其病情指数(18.2和16.4)最小也是一致的(图6)

实施例7

为了分析VdILV6基因敲除导致大丽轮枝菌致病力下降是否与其穿透寄主的能力有关，以V592为对照，对各敲除突变体菌株进行了玻璃纸穿透实验，具体方法如下：

在倒好的MM基本培养基上铺己高温灭菌处理过的大小基本与培养皿一致的玻璃纸。用牙签挑取菌丝接种到至玻璃纸中央，分别培养3d、4d和5d将玻璃纸揭掉，让菌株再长7d，看培养皿上是否能长出菌落，每个菌株设3个重复。

VdILV6基因敲除突变体在接种第5d时甚至7d时都不能穿透玻璃纸(图7)。结果表明，VdILV6基因敲除导致大丽轮枝菌在玻璃纸上的穿透能力丧失。

实施例8

对VdILV6基因敲除是否影响大丽轮枝菌在寄主体内的定殖进行分析，通过qPCR对VdILV6基因敲除突变体在棉花中的生物量进行测定。接种3种不同菌株后26d，取棉花的根(红茎线以下取根5cm)、茎(棉苗一半株高处取茎5cm)、叶，分别提取根、茎、叶的总DNA。qPCR所用引物[转录间隔区(Internaltranscribed spacer，ITS)-F(5'-tgttgcttcggcggctcgtt-3'，SEQ ID NO:6)和ITS-R(5'-gcgtttcgctgcgttcttca-3'，SEQ ID NO:7)]是基于大丽轮枝菌核糖体RNA(Z29511)的ITS1和ITS2区设计的。以组成型表达的β-tubulin基因(DQ266153)作为内参基因(内参基因:β-tubulin-F：tcaccagccgtggcaaggttg，SEQIDNO:8；β-tubulin-R:agcaaagggcggtctggacgttg，SEQ ID NO:9)，对每个样品的总DNA进行标准化定量。每个反应设3个重复。

采用RT-qPCR检测定殖棉花不同组织中VdILV6的表达情况，采用试剂盒法提取棉花不同组织的RNA，反转录得到的cDNA为模板进行RT-qPCR检测，设计的引物序列如下：

VdILV6-qPCR-F：ATGGCGTCTCGCTGCCTC(SEQ ID NO:2)；

VdILV6-qPCR-R：TTGTAGGCGAGAGCCGAGGT(SEQ ID NO:3)；

β-tubulin-F：TCACCAGCCGTGGCAAGGTTG(SEQ ID NO:4)；

β-tubulin-R：AGCAAAGGGCGGTCTGGACGTTG(SEQ ID NO:5)。

大丽轮枝菌β-tubulin(DQ266153)是内参基因。

反应体系(10μL)：

PowerUp^TM SYBR^TM Green Master Mix(2×)5μL

正向引物0.2μL

反向引物0.2μL

DNA模板4.6μL。

RT-qPCR检测的反应程序如下：50℃ 2min；95℃ 2min；95 3s，60℃ 30s，共40个循环。结果的数据用7500 Fast Real-Time PCR System进行分析，以2^-ΔΔCt的方法计算。结果表明，ΔVdILV6突变体在根中的生物量显著高于V592菌株和2个互补体菌株，在茎组织中的生物量显著低于V592菌株和互补体菌株(图8)。这表明，VdILV6基因敲除却使大丽轮枝菌在根中积累、在茎中定殖明显受阻。该结果与ΔVdILV6突变体在棉苗上引起的病情指数和维管束褐变程度一致。

实施例9

以野生型菌株V592和互补菌株为对照，将VdILV6基因敲除接种至FGA培养基(FGA培养基：果糖10.0g/L，明胶2.0g/L，K₂HPO₄ 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，NaNO₃ 2g/L，调节pH于7.0，在115℃下高压灭菌30min)上，接种位置见图9A。

ΔVdILV6在FGA培养基上培养9天时几乎不能生长。为进一步确定了ΔVdILV6在FGA上的生长缺陷是否是由缺乏一个或几个氨基酸引起的，对野生型菌株V592和敲除突变体以及互补体，分别添加不同浓度的单个或多个支链氨基酸于FGA培养基。

外源添加氨基酸1mM的单个氨基酸对ΔVdILV6无影响，当5mM Val和5mMIle被补充到FGA时，ΔVdILV6的生长缺陷被减轻，Val和Ile能够补充ΔVdILV6生长所需的氨基酸，促使ΔVdILV6生长且菌落直径最大(图9B)，VdILV6参与了Val和Ile的生物合成途径。

选择了3种浓度(409.6mg/L、819.2mg/L和1638.4mg/L)的苯磺隆和双草醚分别处理V592，测定VdILV6基因的相对表达量，测定方法同实施例8记载。

5mM Leu抑制了VdILV6基因的表达(图10)。VdILV6参与了支链氨基酸的生物合成途径，是支链氨基酸生物合成的重要组成部分。

实施例10

AHAS抑制剂处理实验

选择了2种不同化学类型的除草剂，分别为苯磺隆(磺酰脲类除草剂)和双草醚(嘧啶水杨酸类除草剂)，分别配制浓度为409.6mg/L、819.2mg/L和1638.4mg/L的药液，分别接种至野生型菌株V592的菌落上，观察药剂对菌株生长的影响。

AHAS是除草剂作用的靶标，选择了2种不同化学类型的除草剂：苯磺隆(磺酰脲类除草剂)和双草醚(嘧啶水杨酸类除草剂)，接种野生型菌株V592，观察菌落形态发现在1638.4mg/L作用下苯磺隆和双草醚明显抑制了大丽轮枝菌的生长，V592不产生微菌核(见图11)。

采用RT-qPCR法检测3种浓度的苯磺隆和双草醚处理V592后VdILV6基因的相对表达量，具体方法同实施例5。

选择了3种浓度的苯磺隆和双草醚分别处理V592。采用RT-qPCR法检测3种浓度的苯磺隆和双草醚处理V592后VdILV6基因的相对表达量，具体方法同实施例5。结果所显示的Ct值(Threshold cycle)定义为达到超出荧光信号的检测阈值时所需要的循环数，结果的数据用7500Fast Real-Time PCR System进行分析，以2^-ΔΔCt的方法计算。结果表明，VdILV6基因的相对表达量呈下调趋势，且浓度越高下调越显著(图12)。这些结果表明，苯磺隆和双草醚都能抑制VdILV6基因的表达。再次证明，VdILV6是支链氨基酸合成的必需基因。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 石河子大学

<120> VdILV6基因在大丽轮枝菌生长发育、致病力和支链氨基酸合成中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 945

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcgtctc gctgcctcgc cgcgcccatg cggctcgctg cccgactgca ggccgccccg 60

actgcgacat cgctcgcctc ccagcgctgg agctcctcca gctcgacctc ggctctcgcc 120

tacaaggcca tccgccgtcg ctcctccccc cttcccgtcg accagacgcc cgcctggtcc 180

gcccaggctg ccgtctccaa catcctctac gagacgccca ccccgtcgat ggccccgccc 240

aagcgtcaca tcctcaactg tctcgtccag aacgagcccg gtgtcctgtc gcgcgtctcc 300

ggcattctcg ccgcccgcgg cttcaacatt gactcgctcg tcgtctgcag caccgaggtc 360

gaggacctgt cgcgcatgac catcgtcctg accggccagg acggcgtcgt cgagcaggcg 420

cgccgccagc tggaagacct cgtccccgtc tgggccgtgc tcgactacac caacgccgct 480

ctcgtccaga gggagctggt gctcgccaag atcaacattc tcggccccga gtactttgag 540

gagctcctcg cccaccaccg cgagatgacg gctggcgact ccgagtacga ggacggccac 600

gacgtctccc tcgagcagac cgccaaggat ttccacccca gcaagctggc gctcagcgag 660

gcccttcgcc acaagcacga gcacctgaag accatcacct acttcactca ccagtttggc 720

ggcaaggttc tcgacatcag caccaacagc tgcattgtcg aggtttccgc gaaacaatcc 780

aggattgact ccttcctcaa gcttgtcggc ccctttggta tcctcgagtc ggcccgcacc 840

ggtctcatgg ccctgccccg ttctcccctg cagaacagcc aagacgacgc tctcatcaag 900

gaggcggacg aggttgtcga tgccagccag ctgccccccg gttaa 945

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcgtctc gctgcctc 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgtaggcga gagccgaggt 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaccagccg tggcaaggtt g 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcaaagggc ggtctggacg ttg 23