一种香豆素衍生物ss-590及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种香豆素衍生物ss-590及其制备方法和应用 (Coumarin derivative SS-590 as well as preparation method and application thereof ) 是由 岳永康 阴彩霞 霍方俊 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种香豆素衍生物SS-590及其制备方法和应用,所述香豆素衍生物SS-590,中文名称为(E)-1,4-二乙基-8-(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)-1,2,3,4-四氢-7H-吡喃[2,3-g]喹喔啉-7-酮,英文名称为(E)-1,4-diethyl-8-(3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acryloyl)-1,2,3,4-tetrahydro-7H-pyrano[2,3-g]quinoxalin-7-one,缩写为SS-590。本发明提供了一种对人血清白蛋白特异性检测的方法,是基于香豆素衍生物SS-590,在PBS中检测人血清白蛋白。本发明中香豆素衍生物SS-590标记后的人血清白蛋白可用于SDS-PAGE Gel分析。在生物分子检测领域具有广阔的应用前景。(The invention provides a coumarin derivative SS-590, a preparation method and an application thereof, wherein the coumarin derivative SS-590 is named as (E) -1,4-diethyl-8- (3- (4-hydroxy-3-methoxyphenyl) acryloyl) -1,2,3,4-tetrahydro-7H-pyran [2,3-g ] quinoxaline-7-one in Chinese, and is named as (E) -1,4-diethyl-8- (3- (4-hydroxy-3-methoxy) acryl) -1,2,3,4-tetrahydro-7H-pyrano [2,3-g ] quinoxalin-7-one in English, and is abbreviated as SS-590. The invention provides a method for specifically detecting human serum albumin, which is based on coumarin derivative SS-590 to detect human serum albumin in PBS. The human serum albumin labeled by the coumarin derivative SS-590 can be used for SDS-PAGE Gel analysis. Has wide application prospect in the field of biomolecule detection.)
技术领域
本发明涉及分析化学技术领域，具体属于一种香豆素衍生物SS-590、SS-590的合成方法，以及SS-590在特异性检测、共价标记人血清白蛋白中的应用。
背景技术
人血清白蛋白是人血液系统中主要的蛋白质，由肝脏合成并进入血液循环系统，在维持血液渗透压、各种内源性和外源性物质的运载中起到了关键的作用。临床中，人血清白蛋白浓度的下降对肠胃炎症、肝硬化等多种疾病具有指示意义。作为人体内源性物质，白蛋白修饰的药物分子在体内的循环时间显著延长，对应的药物过敏反应显著减弱，是药物优化的有效途径。因此，准确地对人血清白蛋白进行浓度分析具有重要的临床意义。
近年来，基于荧光探针的方法对人血清白蛋白定量检测受到了广泛的关注。但是，这些探针普遍基于荧光染料与白蛋白的非共价结合引发测试体系荧光信号的改变。因此，这些荧光探针无法用于SDS-PAGE Gel对白蛋白的定量分析和标记。发展能够与人血清白蛋白共价结合并伴随着特异的荧光信号变化的荧光探针极度匮乏。
本发明提供了一种香豆素衍生物SS-590及其制备方法，并基于该衍生物SS-590实现了对人血清白蛋白的特异性共价标记和检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种香豆素衍生物及其制备方法，以及该衍生物可作为检测试剂用于人血清白蛋白的特异性共价标记和检测；在检测人血清白蛋白时选择性高，灵敏度高；该衍生物标记后的人血清白蛋白可用于SDS-PAGE Gel分析。
本发明提供的一种香豆素衍生物，中文名称为(E)-1,4-二乙基-8-(3-(4-羟基-3-甲氧基苯基)丙烯酰基)-1,2,3,4-四氢-7H-吡喃[2,3-g]喹喔啉-7-酮，英文名称为(E)-1,4-diethyl-8-(3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acryloyl)-1,2,3,4-tetrahydro-7H-pyrano[2,3-g]quinoxalin-7-one，缩写为SS-590。结构式为：
香豆素衍生物在PBS中对人血清白蛋白显示了优良的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏。
SS-590的制备方法：
将8-乙酰基-1,4-二乙基-1,2,3,4-四氢-7H-吡喃并[2,3-g]喹喔啉-7-酮和香草醛按摩尔比为1：1.2溶于乙醇中，加入催化量的哌啶，回流70h至反应完全；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，然后柱色谱分离(洗脱剂按体积比乙酸乙酯：石油醚＝1：1)得到荧光探针SS-590
本发明香豆素衍生物SS-590的用途：该衍生物可以对人血清白蛋白特异性检测，该染料标记后的人血清白蛋白可用于SDS-PAGE Gel分析；所述的检测包含荧光检测和SDS-PAGE Gel成像分析。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、所述香豆素衍生物合成简单，成本低廉，易于大规模生产；
2、所述检测方法能够实现人血清白蛋白的特异性检测，其它氨基酸、无机离子、牛血清白蛋白和鼠血清白蛋白不干扰对人血清白蛋白的测定；
3、所述检测方法能够用于人血清白蛋白的SDS-PAGE Gel分析。
附图说明
：图1SS-590氢谱表征。
图2SS-590碳谱表征。
图3SS-590质谱表征。
图4实施例2SS-590与人血清白蛋白作用的荧光光谱图。
图5实施例3SS-590与各种分析物作用在590nm处的荧光强度对比图。
图6实施例4SS-590与人血清白蛋白作用后SDS-PAGE Gel分析。
具体实施方式
：
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1
SS-590的制备及表征：
将8-乙酰基-1,4-二乙基-1,2,3,4-四氢-7H-吡喃并[2,3-g]喹喔啉-7-酮(0.5mmol,0.15g)、香草醛(0.6mmol,0.09g)溶于20mL乙醇中，加入3～5滴哌啶，回流70h至反应完全；体系减压蒸干溶剂得到粗产品，然后柱色谱分离(洗脱剂按体积比乙酸乙酯：石油醚＝1：1)得到荧光探针SS-590。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ8.52(s,1H),8.07(d,J＝15.6Hz,1H),7.78(d,J＝15.6Hz,1H),7.23–7.18(m,2H),6.92(d,J＝8.6Hz,1H),6.54(s,1H),6.43(s,1H),5.89(s,1H),3.96(s,3H),3.59–3.55(m,2H),3.45(q,J＝7.1Hz,2H),3.36(q,J＝7.1Hz,2H),3.27–3.23(m,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H),1.21(t,J＝7.1Hz,3H)(图1)。13C NMR(151MHz,CDCl3)δ186.73,161.52,153.39,148.12,147.96,146.70,143.38,132.50,128.26,124.20,122.83,116.37,114.59,109.71,109.35,107.79,95.49,56.06,47.77,46.36,45.46,44.51,10.62,9.70(图2)。HR-MS[SS-1+H]+:m/z理论值435.1914,实验值435.1740(图3)。
实施例2
配制PBS溶液，配制2mM SS-590的DMSO溶液，配制20mg/mL人血清白蛋白的水溶液；取1950μL的PBS、5μL SS-590的DMSO溶液加到一个荧光比色皿中，加入50μL人血清白蛋白的水溶液混匀，10min后在荧光分光光度仪上检测(505nm激发)。590nm的荧光强度逐渐增强，荧光发射图见图4。
实施例3
配制PBS溶液，配制2mM SS-590的DMSO溶液，配制20mg/mL人血清白蛋白的水溶液，配制20mg/mL牛血清白蛋白的水溶液，配制10mg/mL鼠血清白蛋白的水溶液，分别配制8mMGlu，Ile，Lys，Leu，Met，Phe，Ser，Hyp，Gln，Pro，Tyr，Cystine，Arg，Thr，Asp，Na2SO3，Na2S，H2O2，NaClO，4mM Hcy，40mM Cys和80mM GSH的水溶液；在27个荧光比色皿中，取1950μL的PBS、5μL SS-590的DMSO溶液分别加到荧光比色皿中，分别加入50μL PBS，Glu，Ile，Lys，Leu，Met，Phe，Ser，Hyp，Gln，Pro，Tyr，Cystine，Arg，Thr，Asp，Na2SO3，Na2S，Cys，Hcy，GSH，H2O2，NaClO，Gly，鼠血清白蛋白，牛血清白蛋白，人血清白蛋白溶液混匀，10min后在荧光分光光度仪上检测荧光强度(505nm激发)。仅人血清白蛋白加入组出现显著的荧光强度升高。荧光发射强度图见图5，其中1.空白；2.Glu；3.Ile；4.Lys；5.Leu；6.Met；7.Phe；8.Ser；9.Hyp；10.Gln；11.Pro；12.Tyr；13.Cystine；14.Arg；15.Thr；16.Asp；17.Na2SO3；18.Na2S；19.Cys；20.Hcy；21.GSH；22.H2O2；23.NaClO；24.Gly；25.鼠血清白蛋白；26.牛血清白蛋白；27.人血清白蛋白。
实施例4
配制2mM SS-590的DMSO溶液，配制2mg/mL人血清白蛋白的SDS(2％)水溶液；分别取40μL人血清白蛋白的SDS(2％)水溶液于2支离心管中，分别在其中加入1μL PBS、SS-590溶液，分别加入10μL上样缓冲液。混匀10min后用4-12％SDS-PAGE Precast Gel进行分离，先后设置80V电泳20min、120V电泳40min，取出胶条，用PBS洗涤，在凝胶成像仪下成像。仅加有染料条带中存在荧光信号。荧光成像图见图6。