具体实施方式

下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明中所涉及的“N倍体积”某一溶剂类的表述，N指代正数的数值或数值范围，如具体实施例中所涉及的“5倍体积”甲醇、“5倍体积”的体积分数为50％的醋酸水溶液、“10倍体积”甲醇、“15倍体积”丙酮、“20倍体积”丙酮、“25倍体积”丙酮、“50倍体积”丙酮、“1～2倍体积”注射用水等，代表的含义是指：相对于相应固体物质的质量Xg(g代表质量单位)，采用的某一溶剂的用量为N×X mL(mL代表体积单位)。

以实施例1的步骤(11)中的③中记载的“将泡沫状浓缩物I称重，以5倍体积甲醇溶解，20倍体积丙酮沉淀，过滤，滤饼用5倍体积的体积分数为50％的醋酸水溶液溶解”为例进行说明：是指相对于每1g浓缩物I，甲醇的用量为5mL，丙酮的用量为20mL；相对于每1g滤饼，体积分数为50％的醋酸水溶液的用量为5mL。

醋酸戈那瑞林的制备方法，包括如下步骤：

(a)以为起始原料，以Boc-氨基酸衍生物和pGlu为单体，逐步接肽处理，得多肽树脂

(b)将所述多肽树脂进行氨解脱树脂后，再进行纯化，然后转醋酸盐处理，得到醋酸戈那瑞林；

所述接肽处理中采用的缩合剂包括第一缩合剂和第二缩合剂，所述第一缩合剂选自HOBT和HOAT中的至少一种，所述第二缩合剂包括DCCI；

每个接肽处理的步骤中，所述单体、第一缩合剂、第二缩合剂和的摩尔比为(1.5～3)∶(1.72～3.45)∶(1.72～3.45)∶1。

的是指聚苯乙烯树脂。

本发明采用Boc法固相多肽合成醋酸戈那瑞林，在减少单体和缩合剂用量的情况下，兼顾降低原辅料成本和保证甚至提高产物收率。

在实际操作中，按的顺序在原料上依次接上含Pro、Arg、Leu、Gly、Tyr、Ser、Trp、His和pGlu的氨基酸单体结构，每个接肽步骤的原料为前一步接肽后得到的前体肽-树脂。

如在不同实施方式中，每个接肽处理的步骤中，所述单体、第一缩合剂、第二缩合剂和的摩尔比为可以为1.5∶1.72∶1.72∶1、1.5∶12∶2∶1、3∶3.45∶3.45∶1等等。

在本发明的优选实施方式中，每个接肽处理的步骤中，所述单体、第一缩合剂、第二缩合剂和的摩尔比为1.5∶2∶2∶1。

其中，的摩尔数是以树脂上结合的Boc-Gly的摩尔数计算。

如在不同实施方式中，所述缩合剂可以为HOBT和DCCI，也可以为HOAT和DCCI。在本发明的优选实施方式中，所述第一缩合剂为HOAT。优选采用HOAT和DCCI的缩合剂组合方式。

在本发明的具体实施方式中，所述Boc-氨基酸衍生物包括Boc-L-脯氨酸、Boc-L-精氨酸、Boc-L-亮氨酸、Boc-甘氨酸、Boc-L-酪氨酸、N-BOC-O-叔丁基-L-丝氨酸、Boc-L-色氨酸和N-BOC-N(咪唑)-(4-甲基苯磺酰基)-L-组氨酸。

在实际操作中，所述Boc-氨基酸衍生物还可以为各Boc-氨基酸的盐酸盐和/或一水合物。比如，Boc-L-精氨酸还可以为Boc-L-精氨酸盐酸盐(Boc-Arg-HCl)、Boc-L-精氨酸盐酸盐一水合物(Boc-Arg-HCl·H₂O)，Boc-L-亮氨酸还可以为Boc-L-亮氨酸一水合物(Boc-Leu·H₂O)。

在本发明的具体实施方式中，每步所述接肽处理包括：脱保护基、中和游离氨基末端、偶联相应单体和偶联后的洗涤处理；

所述偶联后的洗涤处理包括：采用DMF和CH₂Cl₂进行所述洗涤处理。

其中，偶合相应单体指照的顺序在原料上依次接上含Pro、Arg、Leu、Gly、Tyr、Ser、Trp、His和pGlu的氨基酸单体结构。

在本发明的优选实施方式中，所述偶联后的洗涤处理包括：采用DMF洗涤2～3次和采用CH₂Cl₂洗涤2～4次。

本发明的偶联后的洗涤处理的条件中，采用DMF和CH₂Cl₂对偶联后的树脂进行洗涤，不采用乙醇，避免乙醇洗涤造成的树脂收缩、空间变小、空间位阻变大等问题，不利于其它试剂的洗涤，导致所需洗涤工序增加，使工艺繁琐。尤其对于有侧链的氨基酸衍生物单体，影响尤其明显。

在本发明的具体实施方式中，接肽处理步骤中，每次洗涤所用的溶剂的量为2000～2200mL/300mmol。具体是指，每300mmol的起始原料，每次洗涤所用的溶剂的量为2000～2200mL。

进一步的，通过优化洗涤条件，能够在较少的洗涤次数下，保证洗涤的有效性，简化工艺，同时保障甚至提高收率和纯度。

在本发明的优选实施方式中，偶联N-BOC-O-叔丁基-L-丝氨酸、Boc-L-色氨酸后的洗涤处理分别包括：依次采用DMF洗涤3次、CH₂Cl₂洗涤2次。

在本发明的优选实施方式中，偶联N-BOC-N(咪唑)-(4-甲基苯磺酰基)-L-组氨酸后的洗涤处理包括：依次采用DMF洗涤3次、CH₂Cl₂洗涤3次。

在本发明的优选实施方式中，偶联pGlu后的洗涤处理包括：依次采用CH₂Cl₂洗涤3次、DMF洗涤3次、CH₂Cl₂洗涤1次。

在本发明的优选实施方式中，偶联Boc-L-脯氨酸、Boc-L-精氨酸、Boc-L-亮氨酸、Boc-甘氨酸、Boc-L-酪氨酸后的洗涤处理分别包括：依次采用DMF洗涤2次、CH₂Cl₂洗涤2次。

在本发明的具体实施方式中，所述脱保护基的方法包括：待脱保护基物料于含HCl/iPrOH的有机溶剂中，搅拌处理40～60min后抽干，进行洗涤处理。其中，待脱保护基物料是指前一步接肽后得到的前体肽-树脂物料。

在本发明的具体实施方式中，在分别接Boc-L-脯氨酸、Boc-L-精氨酸、Boc-L-亮氨酸、Boc-甘氨酸、Boc-L-酪氨酸、N-BOC-O-叔丁基-L-丝氨酸、Boc-L-色氨酸的接肽处理中，所述脱保护基的方法中，所述有机溶剂为二氯甲烷。优选的，所述HCl/iPrOH与所述二氯甲烷的体积比为1∶1。进一步的，所述HCl/iPrOH中，HCl的浓度为9～10mol/L。

在本发明的具体实施方式中，在分别接N-BOC-N(咪唑)-(4-甲基苯磺酰基)-L-组氨酸和pGlu的接肽处理中，所述脱保护基的方法中，所述有机溶剂包括二氯甲烷和巯基乙醇。优选的，所述HCl/iPrOH、二氯甲烷和巯基乙醇的体积比为5∶4∶1。进一步的，所述HCl/iPrOH中，HCl的浓度为9～10mol/L。

在本发明的具体实施方式中，所述脱保护基过程中的洗涤处理包括：采用CH₂Cl₂和DMF进行洗涤。进一步的，依次采用CH₂Cl₂洗涤3次，抽干，采用DMF洗涤1次，抽干。

在本发明的具体实施方式中，所述中和游离氨基末端的方法包括：采用含三乙胺的二氯甲烷溶液洗涤3次后抽干，再进行洗涤处理。进一步的，所述含三乙胺的二氯甲烷溶液中，三乙胺和二氯甲烷的体积比为5∶95。进一步的，所述洗涤处理包括：采用DMF洗涤1次后抽干，再采用CH₂Cl₂洗涤5～6次至呈中性，抽干。

在本发明的具体实施方式中，所述偶联相应单体的方法包括：将单体和缩合剂分别采用有机溶剂溶解，于0～5℃条件下混合活化5～30min后，固液分离，将液体与中和后的前体肽-树脂混合，于5～10℃反应12～24h后，抽干溶剂。进一步的，所述有机溶剂包括二氯甲烷。

在本发明的具体实施方式中，所述起始原料的制备方法包括：

(1)Boc-Gly和Cs₂CO₃于溶液中反应得到Boc-Gly-Cs；

(2)Boc-Gly-Cs和氯甲基树脂于溶液中反应后，后处理，得到

进一步的，步骤(1)中，Boc-Gly和Cs₂CO₃的质量比为1∶(1.15～1.25)；步骤(2)中，Boc-Gly-Cs和氯甲基树脂的摩尔比为(1～1.5)∶1。氯甲基树脂的摩尔数按照其氯取代量计算。

在本发明的具体实施方式中，所述氨解的方法包括：

(b1)所述多肽树脂于醇类溶剂中，在无水液氨作用的密闭条件下振摇18～30h，然后过滤，采用醇类溶剂洗涤固体，收集合并滤洗液；

(b2)将所述滤洗液浓缩至干，加入醇类溶剂溶解再浓缩至干，重复所述溶解再浓缩至干的操作至少三次，得到泡沫状浓缩物I；

(b3)采用甲醇溶解所述浓缩物I，加入丙酮进行沉淀，过滤后，采用醋酸水溶液溶解滤饼后，浓缩至干，再加入甲醇溶解后浓缩至干，重复所述加入甲醇溶解后浓缩至干的操作至少三次，得到泡沫状浓缩物II；其中，甲醇和丙酮的体积比为1∶(4～5)；优选的，浓缩物I、甲醇、丙酮的比例为1g∶5mL∶(20～25)mL；

(b4)采用甲醇溶解所述浓缩物II，加入丙酮进行沉淀，过滤后，滤饼采用丙酮洗涤1次，采用乙醚洗涤2次后，进行干燥处理，得到戈那瑞林粗品；其中，甲醇和丙酮的体积比为1∶(1.5～2)；优选的，浓缩物II、甲醇、丙酮的比例为1g∶10mL∶(15～20)mL。

在本发明的具体实施方式中，所述醇类溶剂包括甲醇。

在本发明的优选实施方式中，步骤(b3)中，甲醇和丙酮的体积比为1∶5，步骤(b4)中，甲醇和丙酮的体积比为1∶2；或者，步骤(b3)中，甲醇和丙酮的体积比为1∶4；步骤(b4)中，甲醇和丙酮的体积比为1∶1.5。

在本发明的优选实施方式中，浓缩物I、甲醇、丙酮的比例为1g∶5mL∶20mL；浓缩物II、甲醇、丙酮的比例为1g∶10mL∶15mL。

在实际操作中，所述浓缩的条件可以为：在40～45℃条件下进行减压浓缩。进一步的，所述减压浓缩的真空度为-0.08MPa～-0.1MPa。

本发明通过进一步优化氨解过程中采用于溶解和沉淀甲醇和丙酮的比例，能够在确保收率的同时，明显提高粗品的纯度和含量。

在本发明的具体实施方式中，所述纯化的方法包括：CM纯化和HPLC纯化。

在实际操作中，CM纯化的方法包括：采用CM-Sephadex C25层析柱，平衡处理后，上样，上样完成后采用洗涤液洗涤至吸光值＜0.2为止，然后采用洗脱液进行洗脱，测定洗脱流出液在280nm处的吸光值，当吸光值OD₂₈₀上升≥0.4时，开始收集洗脱流出液，下降≤0.4时停止收集；其中，洗涤液为pH＝6.0的0.05mol/L的乙酸钠水溶液，洗脱液为pH＝6.0的0.5mol/L乙酸钠水溶液。进一步的，平衡处理包括：用纯化水冲至中性，再用pH＝6.0的0.05mol/L的乙酸钠溶液(缓冲液)进行平衡，至流出液pH值和电导率值与缓冲液基本一致。进一步的，将戈那瑞林粗品用pH＝6.0的0.05mol/L的乙酸钠水溶液溶解，过0.45μm膜，收集样品溶液进行上样；其中样品溶液中，戈那瑞林粗品的浓度约为1g/100mL；上样量为0.05mmol/mL层析柱。

在实际操作中，HPLC纯化的方法包括：将CM纯化收集的洗脱流出液过0.45μm膜后，上平衡处理后的制备型HPLC柱，进行梯度洗脱，收集合并戈那瑞林中间体纯度≥97％的洗脱流出液；其中，梯度洗脱的流动相A为含体积分数为0.5％的乙酸和体积分数为5％的乙腈的水溶液，流动相B为含体积分数为0.5％的乙酸和体积分数为80％的乙腈的水溶液，以保证分离纯化即可。

在本发明的具体实施方式中，采用反相HPLC方法转醋酸盐。进一步的，所述反相HPLC方法转醋酸盐的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶。

在本发明的具体实施方式中，所述转醋酸盐的方法包括：将纯化后的戈那瑞林中间体用水稀释后吸附到平衡处理后的HPLC制备柱上，采用乙酸铵缓冲液洗涤后，采用体积分数为3％的乙腈水溶液洗涤，然后再采用体积分数为80％的乙腈水溶液洗脱，收集有吸收值的洗脱液。

在本发明的具体实施方式中，所述乙酸铵缓冲液的洗涤体积为5～5.5倍柱体积，优选为5倍柱体积；所述体积分数为3％的乙腈水溶液的洗涤体积为10～11倍柱体积，优选为10倍体积。

进一步的，采用体积分数为3％的乙腈水溶液对所述HPLC制备柱进行所述平衡处理。

进一步的，所述乙酸铵缓冲液为pH为5.0、浓度为0.1mol/L的乙酸铵缓冲液。

本发明采用乙酸铵进行转醋酸盐，利用乙酸铵的竞争结合方式，全部转化为二醋酸盐，并且提高结合牢度。

在本发明的具体实施方式中，将所述洗脱液浓缩至干，再加入水溶解后浓缩至干，反复至少3次，得到浓缩物III。

在本发明的具体实施方式中，还包括，将所述转醋酸盐处理后的物质进行冻干处理。

在实际操作中，所述冻干处理包括：

预冻：导热油进口温度小于-40℃，保温2小时左右；

升华：导热油升温速度约10℃/小时，至油温升至38℃，过程控制前箱真空度设置不大于20Pa；

导热油温度达约38℃时，保温约18小时至干燥终点。

实施例1

本实施例提供了醋酸戈那瑞林的制备方法，包括如下步骤：

(1)的制备

①称取86.7g的Boc-Gly置于容器中，加入约300mL甲醇溶解，得到Boc-Gly的甲醇溶液；称取104.7g的Cs₂CO₃置于另一容器中，加入约300mL水溶解，得到Cs₂CO₃的水溶液；将Cs₂CO₃的水溶液缓慢加入Boc-Gly的甲醇溶液中，用手轻轻晃动至充分反应后，得到无色透明的pH为7.0～7.5的Boc-Gly-Cs溶液。

②将步骤①得到的Boc-Gly-Cs溶液在40～50℃的水浴中减压浓缩蒸去溶剂，得固体；向固体中加入约150mL甲醇，减压蒸干，再重复两次(加入甲醇后蒸干的步骤)，得到固体物质；将所述固体物质在P₂O₅干燥器中真空干燥至恒重，得Boc-Gly-Cs干燥品。

③按照的氯取代量计算，称取330mmol的氯甲基聚苯乙烯树脂(cas号：55844-94-5)置于3L三颈瓶中；将步骤②得到的Boc-Gly-Cs干燥品溶解于约2100mL的DMF中，得到Boc-Gly-Cs的DMF溶液；将Boc-Gly-Cs的DMF溶液加入前述三颈瓶中；将三颈瓶置于50℃的水浴锅中恒温搅拌反应48h；反应结束后，过滤，固体树脂采用DMF洗3次(每次使用约750mL的DMF)，再用纯化水洗至无Cl^-反应(AgNO₃试剂检测：取洗涤后的纯化水滴加硝酸银，轻微晃动，溶液应无色透明)，然后用乙醇洗4次(每次使用约300mL的乙醇)，最后用甲醇洗2次(每次使用约300mL的甲醇)；将洗涤处理后的树脂置于烘箱中于40～50℃烘干，再置于P₂O₅干燥器中真空干燥至恒重，得干燥品。

(2)接二肽

①脱保护基：按照树脂上结合的Boc-Gly的摩尔数计算，称取300mmol的干燥品，置于10L的反应釜中，CH₂Cl₂洗涤2～3次，抽干。加入9～10mol/L的HCl/iPrOH约780mL和CH₂Cl₂约780mL，搅拌40min后抽干，将固体采用CH₂Cl₂洗涤3次抽干，再采用DMF洗涤1次抽干。

②中和游离氨基末端：向步骤①得到的物料中加入体积比为5∶95的三乙胺/CH₂Cl₂洗涤3次后，抽干；再采用DMF洗涤1次，抽干，然后再采用CH₂Cl₂洗涤5～6次至呈中性后，抽干。

③偶联单体Boc-Pro-OH：称量Boc-Pro-OH 97g(450mmol)、HOAT 81g(600mmol)、DCCI 124g(600mmol)，将Boc-Pro-OH、HOAT和DCCI分别采用DMF溶解，然后在0～5℃条件下混合均匀后反应5～30min；反应结束后，过滤后收集液体，将液体加入步骤②处理后的树脂物料中，密塞瓶口，于5～10℃条件下反应18h后，抽干溶剂，得偶联后树脂物料。

④偶联后的洗涤处理：将步骤③得到的偶联后树脂物料依次采用DMF洗涤2次，采用CH₂Cl₂洗涤2次后，抽干，得到

(3)接三肽

参考接二肽的方法，区别在于：

步骤①脱保护基的原料为上述制得的全部

步骤③偶联单体为Boc-Arg-HCl·H₂O，称量Boc-Arg-HCl·H₂O 148g(450mmol)、HOAT 81g(600mmol)、DCCI 124g(600mmol)；单体不局限于此，也可以称量Boc-Arg-HCl140g(450mmol)；

步骤④最终得到

(4)接四肽

参考接二肽的方法，区别在于：

步骤①脱保护基的原料为上述制得的全部

步骤③偶联单体为Boc-Leu·H₂O，称量Boc-Leu·H₂O112g(450mmol)、HOAT 81g(600mmol)、DCCI 124g(600mmol)；单体不局限于此，也可以称量Boc-Leu 105g(450mmol)；

步骤④最终得到

(5)接五肽

参考接二肽的方法，区别在于：

步骤①脱保护基的原料为上述制得的全部

步骤③偶联单体为Boc-Gly，称量Boc-Gly 79g(450mmol)、HOAT 81g(600mmol)、DCCI 124g(600mmol)；

步骤④最终得到

(6)接六肽

参考接二肽的方法，区别在于：

步骤①脱保护基的原料为上述制得的全部

步骤③偶联单体为Boc-Tyr，称量Boc-Tyr 127g(450mmol)、HOAT 81g(600mmol)、DCCI 124g(600mmol)；

步骤④最终得到

(7)接七肽

参考接二肽的方法，区别在于：

步骤①脱保护基的原料为上述制得的全部

步骤③偶联单体为Boc-Ser(tBu)-OH，称量Boc-Ser(tBu)-OH 118g(450mmol)、HOAT 81g(600mmol)、DCCI 124g(600mmol)；

步骤④将步骤③得到的偶联后树脂物料依次采用DMF洗涤3次，采用CH₂Cl₂洗涤2次后，抽干，得到

(8)接八肽

参考接二肽的方法，区别在于：

步骤①脱保护基的原料为上述制得的全部 且脱保护反应的搅拌时间为60min；

步骤③偶联单体为Boc-Trp，称量Boc-Trp 137g(450mmol)、HOAT 81g(600mmol)、DCCI 124g(600mmol)；

步骤④将步骤③得到的偶联后树脂物料依次采用DMF洗涤3次，采用CH₂Cl₂洗涤2次后，抽干，得到

(9)接九肽

参考接二肽的方法，区别在于：

步骤①脱保护基的原料为上述制得的全部且脱保护体系为：9～10mol/L的HCl/iPrOH约780mL、CH₂Cl₂约624mL和巯基乙醇156mL，脱保护反应的搅拌时间为60min；

步骤③偶联单体为Boc-His(Tos)，称量Boc-His(Tos)184g(450mmol)、HOAT 81g(600mmol)、DCCI 124g(600mmol)；

步骤④将步骤③得到的偶联后树脂物料依次采用DMF洗涤3次，采用CH₂Cl₂洗涤3次后，抽干，得到

(10)接十肽

参考接二肽的方法，区别在于：

步骤①脱保护基的原料为上述制得的全部 且脱保护体系为：9～10mol/L的HCl/iPrOH约780mL、CH₂Cl₂约624mL和巯基乙醇156mL，脱保护反应的搅拌时间为60min；

步骤③偶联单体为pGlu，称量pGlu 58g(450mmol)、HOAT 81g(600mmol)、DCCI124g(600mmol)；

步骤④将步骤③得到的偶联后树脂物料依次采用CH₂Cl₂洗涤3次，DMF洗涤3次，CH₂Cl₂洗涤1次后，抽干。将固体物料置于40～50℃烘箱中干燥0.5h以上，再置于P₂O₅干燥箱中干燥12h以上，得多肽树脂

(11)氨解

①将步骤(10)制得的多肽树脂置于裂解瓶中，加入3000mL甲醇，然后加入4500mL无水液氨，密闭，于室温下振摇24h，冷却条件下打开裂解瓶，过滤，固体树脂物料用甲醇洗涤4次，合并滤洗液；

②将步骤①得到的滤洗液于40～45℃减压浓缩(真空度为-0.08MPa～-0.1MPa)至干，加甲醇溶解再减压浓缩(40～45℃，真空度为-0.08MPa～-0.1MPa)至干，如此反复三次，得到泡沫状浓缩物I；

③将泡沫状浓缩物I称重，以5倍体积甲醇溶解，20倍体积丙酮沉淀，过滤，滤饼用5倍体积的体积分数为50％的醋酸水溶液溶解，40～45℃减压浓缩(真空度为-0.08MPa～-0.1MPa)至干，加甲醇溶解再减压浓缩(40～45℃，真空度为-0.08MPa～-0.1MPa)至干，如此反复至少三次，至得到泡沫状浓缩物II。

④将泡沫状浓缩物II称重，以10倍体积甲醇溶解，15倍体积丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮洗涤1次，乙醚洗涤2次，抽干；将抽干得到的固体真空干燥，得到戈那瑞林粗品。步骤③和步骤④中过滤产生的滤液可回收利用，重复上述步骤③和步骤④，得戈那瑞林粗品回收。

(12)CM纯化

①柱选择：填料为CM-Sephadex C25的预处理层析柱；按照0.05mmol/mL的上样量选择适宜体积的预处理层析柱，比如投入量为100mmol戈那瑞林粗品时，选用约2000mL的预处理层析柱。

②层析柱平衡：用纯化水冲至中性，再用pH＝6.0的0.05mol/L的乙酸钠缓冲液进行平衡，至流出液pH值和电导率值与缓冲液基本一致，备用。

③上样和处理：将步骤(11)得到的戈那瑞林粗品用pH＝6.0的0.05mol/L的乙酸钠缓冲液溶解，过0.45μm膜后，上层析柱；上样完毕后，采用洗涤液(pH＝6.0的0.05mol/L的乙酸钠缓冲液)洗涤至吸光值＜0.2为止，然后采用洗脱液(pH＝6.0的0.5mol/L乙酸钠水溶液)进行洗脱，测定洗脱流出液在280nm处的吸光值，当吸光值OD₂₈₀上升≥0.4时，开始收集洗脱流出液，下降≤0.4时停止收集。

(13)HPLC纯化

①柱平衡：用流动相A平衡制备型HPLC柱(4L的反相C18液相色谱柱)，流速为400mL/min，平衡至基线稳定，备用。

②上样：将步骤(12)收集的洗脱流出液过0.45μm膜后，上步骤①平衡处理后的制备型HPLC柱。

③梯度洗脱：采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱；流动相A为含体积分数为0.5％的乙酸和体积分数为5％的乙腈的水溶液，流动相B为含体积分数为0.5％的乙酸和体积分数为80％的乙腈的水溶液。

④收集：分段收集主峰溶液，经HPLC法检测，纯度≥97.0％的部分为合格，不合格部分回收后再次进行HPLC纯化，合并所有纯度≥97.0％的部分，混合均匀后即得戈那瑞林中间体。

(14)转盐-浓缩

①柱平衡：采用含体积分数为3％的乙腈的水溶液平衡制备型HPLC柱(4L的反相C18液相色谱柱)，直至基线稳定，备用。

②将步骤(13)得到的戈那瑞林中间体用1～2倍体积注射用水稀释后再吸附到步骤①平衡处理后的HPLC制备柱上，采用pH为5.0、0.1mol/L的乙酸铵缓冲液洗涤5倍柱体积后，采用体积分数为3％的乙腈水溶液洗涤10倍柱体积，然后再采用体积分数为80％的乙腈水溶液洗脱，收集有吸收值的洗脱液；将收集的洗脱液经40～45℃减压浓缩(真空度为-0.08MPa～-0.1MPa)至干，然后加入适量的注射用水溶解后再次浓缩至干，反复至少3次，得浓缩物。

(15)冻干处理：将步骤(14)得到的浓缩物加适量注射用水溶解，通过两个串联的0.22μm过滤器过滤，过滤至局部A级层流下的已灭菌的容器内。最终控制过滤收集液的浓度为8％～10％；将过滤收集液倒入灭菌处理过的冻干盘中，进灭菌处理过的冻干箱冻干，出箱后得到无菌的醋酸戈那瑞林原料药(药用级)；

冻干工艺条件为：预冻-导热油进口温度小于-40℃，保温2h左右；升华-导热油升温速度约10℃/h，至油温升至38℃，过程控制前箱真空度设置不大于20Pa；导热油温度达约38℃时，保温约18h至干燥终点。

实施例2

本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：接二肽至接十肽的过程中，各相应的偶联单体、HOAT、DCCI和起始原料干燥品的摩尔比不同；具体如下：

起始原料干燥品300mmol；

接二肽：偶联单体Boc-Pro-OH 193.5g(900mmol)、HOAT 139.7g(1035mmol)、DCCI213.0g(1035mmol)；

接三肽：偶联单体Boc-Arg-HCl·H₂O 295.5g(900mmol)、HOAT 139.7g(1035mmol)、DCCI 213.0g(1035mmol)；

接四肽：偶联单体Boc-Leu·H₂O 225.0g(900mmol)、HOAT 139.7g(1035mmol)、DCCI 213.0g(1035mmol)；

接五肽：偶联单体Boc-Gly 157.5g(900mmol)、HOAT 139.7g(1035mmol)、DCCI213.0g(1035mmol)；

接六肽：偶联单体Boc-Tyr 253.5g(900mmol)、HOAT 139.7g(1035mmol)、DCCI213.0g(1035mmol)；

接七肽：偶联单体Boc-Ser(tBu)-OH 235.5g(900mmol)、HOAT 139.7g(1035mmol)、DCCI 213.0g(1035mmol)；

接八肽：偶联单体Boc-Trp 274.5g(900mmol)、HOAT 139.7g(1035mmol)、DCCI213.0g(1035mmol)；

接九肽：偶联单体Boc-His(Tos)369.0g(900mmol)、HOAT 139.7g(1035mmol)、DCCI213.0g(1035mmol)；

接十肽：偶联单体pGlu 115.5g(900mmol)、HOAT 139.7g(1035mmol)、DCCI 213.0g(1035mmol)。

实施例3

本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：接二肽至接十肽的过程中，各相应的偶联单体、HOAT、DCCI和起始原料干燥品的摩尔比不同；具体如下：

起始原料干燥品300mmol；

接二肽：偶联单体Boc-Pro-OH 97g(450mmol)、HOAT 70g(517mmol)、DCCI 107g(517mmol)；

接三肽：偶联单体Boc-Arg-HCl·H₂O 148g(450mmol)、HOAT 70g(517mmol)、DCCI107g(517mmol)；

接四肽：偶联单体Boc-Leu·H₂O 112g(450mmol)、HOAT 70g(517mmol)、DCCI 107g(517mmol)；

接五肽：偶联单体Boc-Gly 79g(450mmol)、HOAT 70g(517mmol)、DCCI 107g(517mmol)；

接六肽：偶联单体Boc-Tyr 127g(900mmol)、HOAT 70g(517mmol)、DCCI 107g(517mmol)；

接七肽：偶联单体Boc-Ser(tBu)-OH 118g(450mmol)、HOAT 70g(517mmol)、DCCI107g(517mmol)；

接八肽：偶联单体Boc-Trp 137g(450mmol)、HOAT 70g(517mmol)、DCCI 107g(517mmol)；

接九肽：偶联单体Boc-His(Tos)184g(450mmol)、HOAT 70g(517mmol)、DCCI 107g(517mmol)；

接十肽：偶联单体pGlu 58g(450mmol)、HOAT 70g(517mmol)、DCCI 107g(517mmol)。

实施例4

本实施例参考实施例2的制备方法，区别仅在于：

缩合剂为HOBT和DCCI，各接肽步骤按照单体、HOBT、DCCI和的摩尔比为3∶3.45∶3.45∶1投料；

各接肽处理中的偶联后的洗涤处理条件不同，具体如下：

接二肽至接九肽的偶联后的洗涤处理均为：依次采用CH₂Cl₂洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH₂Cl₂洗涤3次后，抽干；

接十肽的偶联后的洗涤处理为：依次采用CH₂Cl₂洗涤3次，无水乙醇洗涤4次，DMF洗涤2次，CH₂Cl₂洗涤2～3次，甲醇洗4～5次后抽干。

实施例5

本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：

步骤(11)氨解的步骤③中，以5倍体积甲醇溶解，25倍体积丙酮沉淀，其余操作相同；

步骤(11)氨解的步骤④中，以10倍体积甲醇溶解，20倍体积丙酮沉淀，其余操作相同。

实施例6

本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：

步骤(11)氨解的步骤③中，以5倍体积甲醇溶解，50倍体积丙酮沉淀，其余操作相同；

步骤(11)氨解的步骤④中，以10倍体积甲醇溶解，50倍体积丙酮沉淀，其余操作相同。

实施例7

本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：

(14)转盐-浓缩

①柱平衡：采用含体积分数为0.5％的乙酸和体积分数为5％的乙腈的水溶液平衡制备型HPLC柱(4L的反相C18液相色谱柱)，直至基线稳定，备用。

②将步骤(13)得到的戈那瑞林中间体用1～2倍体积注射用水稀释后再吸附到步骤①平衡处理后的HPLC制备柱上，采用pH为5.0、0.1mol/L的乙酸铵缓冲液洗涤后，采用含体积分数为0.5％的乙酸和体积分数为5％的乙腈的水溶液洗涤，然后再采用含体积分数为0.5％的乙酸和体积分数为40％的乙腈的水溶液洗脱，收集有吸收值的洗脱液；将收集的洗脱液经40～45℃减压浓缩(真空度为-0.08MPa～-0.1MPa)至干，然后加入适量的注射用水溶解后再次浓缩至干，反复至少3次，得浓缩物。

实施例8

本实施例参考实施例1的制备方法，区别仅在于：

缩合剂为HOAT和DCCI，各接肽步骤按照单体、HOBT、DCCI和的摩尔比为1.5∶2∶2∶1投料；

各接肽处理中的偶联后的洗涤处理条件不同，具体如下：

接二肽至接九肽的偶联后的洗涤处理均为：依次采用CH₂Cl₂洗涤3次、无水乙醇洗涤4次、DMF洗涤2次、CH₂Cl₂洗涤3次后，抽干；

接十肽的偶联后的洗涤处理为：依次采用CH₂Cl₂洗涤3次，无水乙醇洗涤4次，DMF洗涤2次，CH₂Cl₂洗涤2～3次，甲醇洗4～5次后抽干。

实验例1

为了对比说明本发明的醋酸戈那瑞林的制备方法的工艺差别，从多个方面对不同实施例的醋酸戈那瑞林的制备方法收率和/或纯度等进行测试。测试结果见表1～表3。

表1各接肽步骤单体、缩合剂用量对接十肽后得到的多肽树脂的影响

从实施例1至实施例4的接肽工艺条件可知，当第一缩合剂选用HOBT时，并且洗涤处理条件没有优化之前，偶联单体、第一缩合剂及第二缩合剂用量均较大，成本较高，而此时多肽树脂的收率偏低[即(800g/900g)×100％＝88.9％]；本发明通过大量创造性实验发现，当第一缩合剂选用HOAT，可减少单体的用量，并且反应杂质减少，在此基础上进一步采用本发明特定的洗涤处理条件，不仅提高了反应效率，还能显著提高多肽树脂的收率，并且在偶联单体、第一缩合剂及第二缩合剂的用量降低到每1mol的仅用1.5mol偶联单体、2mol第一缩合剂、2mol第二缩合剂的情况下，即可达到收率96.3％以上[即(867g/900g)×100％＝96.3％]。可见，通过采用特定的缩合剂、偶联后的洗涤处理条件，能够在显著降低偶联单体和缩合剂的用量的情况下，提高多肽树脂的收率，大大降低了原辅料成本和洗涤所用溶剂的成本、简化了工艺。

表2氨解步骤具体工艺对戈那瑞林粗品纯度、含量、收率的影响

其中，粗品纯度：通过HPLC检测粗品，得到的HPLC图谱中，目标肽的峰面积与图谱中总峰面积(HPLC图谱中所有峰的面积之和)的比值，即为粗品纯度(HPLC检测过程中，并非所有物质均会被检测到并出峰)；粗品纯度主要体现目标肽与相关杂质(比如非目标肽的其它肽链等)之间的关系；

粗品含量：粗品中的目标肽的质量与粗品的总质量的比值；粗品含量主要体现粗品中目标肽的含量。

从实施例1、实施例5和实施例6的氨解工艺条件可知，通过采用特定的氨解过程溶解沉淀条件，能够在兼顾保证收率的同时，显著提高粗品的纯度，并且有机溶剂(甲醇和丙酮)的用量相对更少。

表3转盐-浓缩步骤具体工艺对单次上样量的影响

从实施例1和实施例7的转盐-浓缩工艺条件可知，本发明通过对转盐-浓缩步骤工艺条件进行改进，能够避免上样和洗涤过程中的流穿导致的损失，提高上样量，且提高处理效率。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。