一种肽的固相合成方法
阅读说明：本技术 一种肽的固相合成方法 (Solid-phase synthesis method of peptide ) 是由 王刚 舒遂智 李新宇 邱心敏 付玉清 林艳霞 于 2020-05-31 设计创作，主要内容包括：本发明涉及多肽合成领域,特别涉及一种多肽的固相合成方法。该方法包括以下步骤：1)羟基树脂经活化剂活化成X-CO-O-Resin,其中X为活化基团；2)X-CO-O-Resin与NH-(2)NH-(2)反应合成NH-(2)NH-CO-O-Resin,或与Fmoc-NHNH-(2)反应合成Fmoc-NHNH-CO-O-Resin再脱除Fmoc得到NH-(2)NH-CO-O-Resin；3)NH-(2)NH-CO-O-Resin与氨基酸或肽片段按肽序偶联成肽酰肼树脂；4)肽酰肼树脂经裂解试剂裂解得到肽酰肼；5)肽肼在水中能转化为可用于偶联的酰基叠氮或肼末端结构,从而制备一些碳末端具有特殊修饰的多肽。该发特别适用碳末端为乙胺基或氨基脲的瑞林类多肽。利用肽肼方法制备瑞林类多肽,能够极大程度的降低成本,减少操作步骤,减少三废的排放。且合成过程安全稳定,无不良副反应发生,适合工业放大生产。(The invention relates to the field of polypeptide synthesis, in particular to a solid-phase synthesis method of polypeptide. The method comprises the following steps: 1) activating the hydroxyl Resin into X-CO-O-Resin by an activating agent, wherein X is an activating group; 2) X-CO-O-Resin and NH 2 NH 2 Reaction for synthesis of NH 2 NH-CO-O-Resin, or with Fmoc-NHNH 2 Fmoc-NHNH-CO-O-Resin is synthesized by reaction and then Fmoc is removed to obtain NH 2 NH‑CO‑O‑Resin；3)NH 2 Coupling NH-CO-O-Resin with amino acids or peptide fragments into peptide hydrazide Resin in peptide order; 4) cracking the peptide hydrazide resin by a cracking reagent to obtain peptide hydrazide; 5) peptide hydrazines can be converted in water to acyl azide or hydrazine terminal structures useful for conjugation, thereby producing some polypeptides with specific modifications at the carbon terminus. The method is particularly suitable for the relin polypeptide of which the carbon terminal is an ethylamino group or semicarbazide.The method for preparing the relin polypeptide by using the peptide hydrazine can greatly reduce the cost, reduce the operation steps and reduce the discharge of three wastes. And the synthesis process is safe and stable, no adverse side reaction occurs, and the method is suitable for industrial large-scale production.)
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽的固相合成方法。
背景技术
多肽的合成方法主要有固相法合成和液相法合成两种方式。液相法合成主要用于短肽合成，并且有中间体纯化操作复杂、后处理操作繁琐、合成周期长等缺陷。R.BruceMerrifield在1963年首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，其合成方便、迅速、反应条件温和，迅速得到广泛使用，目前85％以上的多肽药物都是通过固相合成得到的。固相多肽合成法中的肽酰肼多肽偶联法是2011年刘磊教授报道的一种新兴化学选择性多肽偶联方法，该方法使用C-端的酰肼基团作为硫酯的前体。值得强调的是，该肽酰肼前体能够非常稳定的存在于SPPS过程以及多种多肽偶联的体系中。经SPPS制得相应肽酰肼后，肽酰肼可经亚硝酸钠在酸性条件下氧化生成酰基叠氮后再与芳基硫醇反应，从而快速、等当量的制得相应高活性的芳香多肽硫酯。该多肽硫酯能选择性的与另一多肽N-端的半胱氨酸反应，进而生成天然的肽键。目前，多肽C-端酰肼的合成主要由CTC树脂和水合肼/Fmoc-NHNH2反应所得。然而CTC树脂很不稳定，无论是存储中还是反应中。存储的CTC树脂，随着存储时间延长，会吸潮并释放出HCl，使得取代度会不断下降。同时，反应的时候也很不稳定，产物的收率波动较大。因此，CTC树脂制备酰肼只适用于实验室研究，不适用于大工业生产。
瑞林类多肽的碳末端大多数为乙胺基、氨基脲，现有合成方式与普通肽稍有不同，US2010311946A1利用Merrifield树脂进行偶联，反应完成后通过肼解的方式获得对应肽肼，再使用稀TFA溶液切除相关酸敏感保护基，最终在水溶液中通过氰酸盐处理构建氨基脲结构，得到戈舍瑞林粗品。但该专利中Fmoc-OSu和水合肼合成活化的Fmoc-NHNH2，经实验发现活化的Fmoc-NHNH2在DMF很难溶解，对固相合成造成很大困难。且肼解步骤反应时间长，产率不高，极易造成肼的残留。专利CN102653555以Sieber树脂作为固相载体，利用N，N-二琥珀酰亚胺碳酸酯与其进行偶联后再加入水合肼，得到Azagly-Resin，随后顺序进行肽链组装，得到Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Azagly-Resin，合成结束后使用10％TFA-DCM溶液对其进行切除，除去部分侧链保护基，最终通过催化氢化的方式除去Bzl和NO2保护基即可获得戈舍瑞林成品。该专利未能避免氢化步骤，由于Arg侧链NO2较为稳定，氢化过程往往需要持续几十个小时才能将其完全去保护，极大的影响了产能。并且该过程需要高压环境并且使用钯碳作为催化剂，存在巨大的安全隐患和重金属残留风险。CN 106146622以树脂为固相载体，采用逐一偶联的方式连接具有侧链保护基团的氨基酸，合成得到侧链全保护亮丙瑞林前体肽树脂；对侧链全保护肽树脂采用乙胺-THF溶液来胺解切割，再用脱保护试剂脱去侧链保护基团，得到亮丙瑞林；或先用脱保护试剂脱去侧链保护基团，再采用乙胺-THF溶液胺解切割得到亮丙瑞林。该专利方法一方面需要提前制备游离的乙胺-THF溶液，另一方面胺解时间长，一般需要24h，这种采用乙胺-THF溶液来胺解来构建碳末端乙胺基的方法在瑞林类多肽的合成中十分常见，然而该法容易产生较为明显的消旋化反应。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明建立了一种新的多肽酰肼法合成多肽，特别是碳末端为乙胺基或氨基脲的瑞林类多肽。该方法路线简易，反应难度低，能有效降低生产成本，有利于多肽的大批量生产。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种肽的固相合成方法，包括以下步骤：
步骤1：羟基树脂经活化剂活化成活泼羰基树脂X-CO-O-Resin，其中X为活化基团；
步骤2：活泼羰基树脂X-CO-O-Resin与NH2NH2反应合成NH2NH-CO-O-Resin，或与Fmoc-NHNH2反应合成Fmoc-NHNH-CO-O-Resin再脱除Fmoc得到NH2NH-CO-O-Resin；
步骤3：NH2NH-CO-O-Resin与氨基酸或肽片段按肽序偶联成Fmoc-(AA)n-CONH-NH-CO-O-Resin；
步骤4：Fmoc-(AA)n-CONH-NH-CO-O-Resin经裂解试剂裂解得到肽酰肼(AA)n-CONH-NH2；
步骤5：肽酰肼经处理得到肽。
优选地，羟基树脂选自：Wang Resin、HMBA Resin、HMPA Resin。活化后的活泼羰基树脂比羟基树脂更好的酸敏感性，能够在5％以上浓度的TFA-DCM体系中发生断裂，且所选的羟基树脂价格低廉，储存稳定性高，活化树脂的步骤操作简单，临用前反应即可，有利于工业大规模生产。
优选地，步骤1所述的活化剂可选自：光气、双光气、三光气、N,N'-羰基二咪唑、4-硝基苯基氯甲酸酯、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯。
在一些实施方案中，活化剂采用光气、双光气或三光气，X为Cl，即活泼羰基树脂为Cl-CO-O-Resin，具体结构为：在一些实施方案中，活化剂采用N,N'-羰基二咪唑，X为咪唑基，即活泼羰基树脂为咪唑-CO-O-Resin，具体结构为：在一些实施方案中，活化剂采用4-硝基苯基氯甲酸酯，X为4-硝基苯基，即活泼羰基树脂为4-硝基苯基-CO-O-Resin，具体结构为：
在一些实施方案中，活化剂采用N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，X为丁二酰亚胺基，即活泼羰基树脂为丁二酰亚胺基-CO-O-Resin，具体结构为：
在一些实施方案中，该方法可用于结构为H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Y的多肽，其中X选自：D-Leu、D-Ser(tBu)、D-Ala、D-Trp，Y选自：NHC2H5、NHNHCONH2。X为D-Leu，Y为NHC2H5时，所述多肽为亮丙瑞林；X为D-Ser(tBu)，Y为NHC2H5时，所述多肽为布舍瑞林；X为D-Ala，Y为NHC2H5时，所述多肽为阿拉瑞林；X为D-Trp，Y为NHC2H5时，所述多肽为得舍瑞林；X为D-Ser(tBu)，Y为NHNHCONH2时，所述多肽为戈舍瑞林。
优选地，在制备戈舍瑞林或布舍瑞林的实施方案中，所述步骤4中TFA、TIS、DCM的体积比为5～20:5～10:70～90。通过控制酸的浓度，可保证准确裂解树脂及部分保护基团；同时，由于裂解过程采用与水互不相溶的溶剂，且相对于该裂解体系，肽酰肼产物在水中溶解度更好，可在裂解结束后直接用水进行抽提，使得整个合成过程无需使用乙醚、异丙醚等沉降剂去除裂解液中的捕获试剂及三氟乙酸等试剂，节省操作步骤，提高了生产效率；且由于避免醚类试剂的使用，降低了成本，提高了生产安全性。
优选地，在制备戈舍瑞林的实施方案中，所述步骤5为：肽酰肼经氰酸盐处理得到戈舍瑞林，其中，氰酸盐选自：氰酸钾、氰酸钠、异氰酸酯。申请人意外的发现，在制备戈舍瑞林的实施例中，肼的使用处于工艺起始端，由于是固相合成，多余的水合肼可通过过滤和反复的洗涤除去，大大降低残留的可能性。在树脂的选择上无须使用昂贵的Sieber树脂，而是使用廉价易得的树脂(如Wang树脂等)代替，利用活化的树脂构建酰肼的方法，最终裂解步骤可使用相对低浓度的TFA溶液进行裂解，在保证D-Ser(tBu)侧链不脱除的同时保证目标肽肼的释放。并且，由于最终构建步骤是在水中进行，因此无需使用乙醚等沉降剂，而是直接用水抽提后保留水相进行下一步即可。反应结束后直接进行纯化，即得目标肽。
优选地，在制备碳末端为乙胺基的多肽，例如亮丙瑞林、布舍瑞林、阿拉瑞林、得舍瑞林等的实施方案中，所述步骤5为：肽酰肼经亚硝基化合物制备成酰基叠氮，再与乙胺水溶液反应得到多肽。申请人意外的发现，采用肽肼多肽偶联法制备此类多肽时，肽肼的酸性水溶液可在一定程度上直接进行结构转化，得到酰基叠氮，然后直接在水相中与乙胺水溶液进行偶联。在目前已知的所有偶联方法中，叠氮法的消旋化程度是最低的，因此能最大程度的降低最后偶联步骤的消旋化影响。同时，酰基叠氮十分温和，肽链中除NH2外的其它基团均可不用保护，并且能够在水相中实现偶联。其次，与现有技术相比，该方法无须提前制备乙胺-THF溶液，仅使用水溶液即可完成最后阶段的缩合，极大降低了合成成本，适合于工业放大生产。
在一些实施方案中，使用本发明技术方案合成戈舍瑞林或布舍瑞林所用的精氨酸可选自：Fmoc-Arg-OH·HF、Fmoc-Arg-OH·HCl、Fmoc-Arg-OH·HBr、Fmoc-Arg-OH·CF3COOH、Fmoc-Arg-OH·TosOH、Fmoc-Arg-OH·H2SO4。使胍基质子化，代替有保护基的Fmoc-Arg(Pbf)-OH或者Fmoc-Arg(NO2)-OH，可以避免脱除保护基时所需的高浓度酸环境或者催化氢化反应，降低工业生产的反应难度以及安全隐患。
本发明建立了一种用于合成多肽的肽肼法工艺，该工艺以廉价易得的羟基树脂作为起始载体，通过常规反应合成得到对应肽肼树脂。该树脂对酸敏感，可通过选择不同浓度的TFA裂解液，保留部分保护基的同时释放出肽肼产物。肽肼在水中能转化为可用于偶联的酰基叠氮或肼末端结构，从而制备一些碳末端具有特殊修饰的多肽，特别是碳末端为乙胺基或氨基脲的瑞林类多肽。利用肽肼方法制备以上化合物，能够极大程度的降低成本，减少操作步骤，减少三废的排放。且合成过程安全稳定，无不良副反应发生，适合工业放大生产。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1 Wang Resin的活化1
称取5.00g Wang树脂(取代度0.84mmol/g)，加入50ml二氯甲烷浸泡15min使其充分溶胀，过滤除去溶剂，重新加入50ml二氯甲烷，置于冰浴下冷却。加入1.27g三乙胺(3eq)，再分批加入1.25g三光气，低温下保持30min，移至室温继续反应2h。反应结束后抽滤除去溶液，树脂以DMF洗涤三次，二氯甲烷洗涤三次后真空干燥得树脂5.27g。
实施例2 Wang Resin的活化2
称取5.00g Wang树脂(取代度0.84mmol/g)，加入50ml THF浸泡15min使其充分溶胀，过滤除去溶剂，重新加入50ml THF，于室温下加入2.05g羰基二咪唑，搅拌反应2h。反应结束后抽滤除去溶液，树脂以DMF洗涤三次，二氯甲烷洗涤三次后真空干燥得树脂5.40g。
实施例3 Wang Resin的活化3
称取5.00g Wang树脂(取代度0.84mmol/g)，加入50ml二氯甲烷浸泡15min使其充分溶胀，过滤除去溶剂，重新加入50ml二氯甲烷，置于冰浴下冷却。加入1.27g三乙胺(3eq)，再分批加入2.54g氯甲酸对硝基苯酯，低温下保持30min，移至室温继续反应2h。反应结束后抽滤除去溶液，树脂以DMF洗涤三次，二氯甲烷洗涤三次后真空干燥得树脂5.69g。
实施例4 Wang Resin的活化4
称取5.00g Wang树脂(取代度0.84mmol/g)，加入50ml DMF浸泡15min使其充分溶胀，过滤除去溶剂，重新加入50ml DMF，于室温下加入5.34g(5eq)N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，再加入0.26g DMAP催化，室温搅拌反应6h。反应结束后抽滤除去溶液，树脂以DMF洗涤三次，二氯甲烷洗涤三次后真空干燥得树脂5.60g。
实施例5 HMBA Resin的活化1
称取5.00g HMBA树脂(取代度0.69mmol/g)，加入50ml二氯甲烷浸泡15min使其充分溶胀，过滤除去溶剂，重新加入50ml二氯甲烷，置于冰浴下冷却。加入1.05g三乙胺(3eq)，再分批加入1.02g三光气，低温下保持30min，移至室温继续反应2h。反应结束后抽滤除去溶液，树脂以DMF洗涤三次，二氯甲烷洗涤三次后真空干燥得树脂5.22g。
实施例6 HMBA Resin的活化2
称取10.00g HMBA树脂(取代度0.69mmol/g)，加入100ml THF浸泡15min使其充分溶胀，过滤除去溶剂，重新加入100ml THF，于室温下加入3.36g(3eq)N,N'-羰基二咪唑，搅拌反应2h。反应结束后抽滤除去溶液，树脂以DMF洗涤三次，二氯甲烷洗涤三次后真空干燥得树脂10.66g。
实施例7 HMPA Resin的活化1
称取3.00g HMPA树脂(取代度0.54mmol/g)，加入30ml二氯甲烷浸泡15min使其充分溶胀，过滤除去溶剂，重新加入30ml二氯甲烷，置于冰浴下冷却。加入0.49g N-甲基吗啉(3eq)，再分批加入0.98g 4-硝基苯基氯甲酸酯，低温下保持30min，移至室温继续反应2h。反应结束后抽滤除去溶液，树脂以DMF洗涤三次，二氯甲烷洗涤三次后真空干燥得树脂3.27g。
实施例8 HMPA Resin的活化2
称取5.00g HMPA树脂(取代度0.54mmol/g)，加入50ml DMF浸泡15min使其充分溶胀，过滤除去溶剂，重新加入50ml DMF，于室温下加入3.43g(5eq)N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，再加入0.16g DMAP催化，室温搅拌反应6h。反应结束后抽滤除去溶液，树脂以DMF洗涤三次，二氯甲烷洗涤三次后真空干燥得树脂5.38g。
实施例9 NH2NH-CO-O-Resin的合成1
量取2.5ml水合肼，加入DMF至50ml，得到5％肼-DMF溶液。将实施例1中的树脂悬浮于50ml DMF中浸泡溶胀，抽滤除去溶剂后将预先配制好的5％肼-DMF加入其中，室温反应1.5h，反应结束后抽滤收集树脂，以DMF洗涤三次后直接用于后续反应。
实施例10 NH2NH-CO-O-Resin的合成2
将实施例6中的树脂悬浮于100ml DMF中浸泡溶胀，抽滤除去溶剂后再次加入100ml DMF，称取17.55g Fmoc-NHNH2(10eq)加入其中，并加入8.90g(10eq)DIPEA，室温反应2h。反应结束后抽滤收集树脂，以DMF洗涤三次后进行脱保护处理。量取100ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应5min，过滤除去反应液，再次加入100ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应10min，过滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后直接用于后续反应。
实施例11 NH2NH-CO-O-Resin的合成3
量取1.5ml水合肼，加入DMF至30ml，得到5％肼-DMF溶液。将实施例7中的树脂悬浮于30ml DMF中浸泡溶胀，抽滤除去溶剂后将预先配制好的5％肼-DMF加入其中，室温反应1.5h，反应结束后抽滤收集树脂，以DMF洗涤三次后直接用于后续反应。
实施例12 Fmoc-NHNH-CO-O-Resin的合成4
将实施例4中的树脂悬浮于50ml DMF中浸泡溶胀，抽滤除去溶剂后再次加入50mlDMF，称取10.68g Fmoc-NHNH2(10eq)加入其中，并加入5.40g(10eq)DIPEA，室温反应2h。反应结束后抽滤收集树脂，以DMF洗涤三次后进行脱保护处理。量取50ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应5min，过滤除去反应液，再次加入50ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应10min，过滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后直接用于后续反应。
实施例13 NH2NH-CO-O-Resin的合成5
将实施例3中的树脂悬浮于50ml DMF中浸泡溶胀，抽滤除去溶剂后再次加入50mlDMF，称取10.68g Fmoc-NHNH2(10eq)加入其中，并加入5.40g(10eq)DIPEA，室温反应2h。反应结束后抽滤收集树脂，以DMF洗涤三次后进行脱保护处理。量取50ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应5min，过滤除去反应液，再次加入50ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应10min，过滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后直接用于后续反应。
实施例14 NH2NH-CO-O-Resin的合成5
将实施例5中的树脂悬浮于50ml DMF中浸泡溶胀，抽滤除去溶剂后再次加入50mlDMF，称取8.78g Fmoc-NHNH2(10eq)加入其中，并加入4.40g(10eq)DIPEA，室温反应2h。反应结束后抽滤收集树脂，以DMF洗涤三次后进行脱保护处理。量取50ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应5min，过滤除去反应液，再次加入50ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应10min，过滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后直接用于后续反应。
实施例15
量取2.5ml水合肼，加入DMF至50ml，得到5％肼-DMF溶液。将实施例2中的树脂悬浮于50ml DMF中浸泡溶胀，抽滤除去溶剂后将预先配制好的5％肼-DMF加入其中，室温反应1.5h，反应结束后抽滤收集树脂，以DMF洗涤三次后直接用于后续反应。
实施例16
量取2.5ml水合肼，加入DMF至50ml，得到5％肼-DMF溶液。将实施例8中的树脂悬浮于50ml DMF中浸泡溶胀，抽滤除去溶剂后将预先配制好的5％肼-DMF加入其中，室温反应1.5h，反应结束后抽滤收集树脂，以DMF洗涤三次后直接用于后续反应。
实施例17亮丙瑞林肽酰肼的合成
将实施例9所得的树脂转移至固相多肽合成管中，加入50ml DMF浸泡溶胀，洗去溶剂，顺序进行偶联操作；
偶联步骤：称取12.6mmolFmoc-氨基酸，2.04g HOBt，溶于50ml DMF中，置于冰浴下冷却，慢慢滴入1.58g DIC，活化5min，将活化后的反应液加入树脂中，N2鼓泡反应2h，抽滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后进行茚三酮检测；其中偶联所用氨基酸依次为：Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-D-Leu-OH,Fmoc-Tyr(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,H-Pyr-OH.
茚三酮检测：取1～5mg树脂，置于离心管中，以乙醇洗涤三次，洗去上清液，加入数滴5％茚三酮-乙醇溶液，置于100℃金属浴上加热5min。若树脂及检测液呈黄色，则表示反应完全，可进行脱保护操作；若呈蓝黑色，则表示仍有部分未反应完，重复投料，直至反应完全。脱保护步骤：量取50ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应5min，过滤除去反应液，再次加入50ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应10min，过滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后重复进行偶联步骤；
裂解步骤：将偶联结束后的肽树脂以DMF洗涤三次，再以二氯甲烷洗涤三次，抽干后转移至圆底烧瓶中。量取90ml TFA，5ml TIS，5ml H2O，混合后置于-20℃下预冻30min。将裂解液一次性加入至树脂中，裂解1.5h。反应结束后抽滤收集滤液，树脂以二氯甲烷洗涤三次后与滤液合并，减压浓缩除去大部分溶剂，加入300ml冰冻乙醚后洗出大量固体，离心收集固体后N2吹干，得粗肽肼5.12g。
实施例18戈舍瑞林/布舍瑞林肽酰肼的合成1
将实施例10所得的树脂转移至固相多肽合成管中，加入100ml DMF浸泡溶胀，洗去溶剂，顺序进行偶联操作；
偶联步骤：称取20.7mmolFmoc-氨基酸，3.35g HOBt，溶于100ml DMF中，置于冰浴下冷却，慢慢滴入2.87g DIC，活化5min，将活化后的反应液加入树脂中，N2鼓泡反应2h，抽滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后进行茚三酮检测；其中偶联所用氨基酸依次为：Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg-OH·HCl,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Tyr-OH,Fmoc-Ser-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,H-Pyr-OH.
茚三酮检测：取1～5mg树脂，置于离心管中，以乙醇洗涤三次，洗去上清液，加入数滴5％茚三酮-乙醇溶液，置于100℃金属浴上加热5min。若树脂及检测液呈黄色，则表示反应完全，可进行脱保护操作；若呈蓝黑色，则表示仍有部分未反应完，重复投料，直至反应完全。脱保护步骤：量取100ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应5min，过滤除去反应液，再次加入100ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应10min，过滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后重复进行偶联步骤；
裂解步骤：将偶联结束后的肽树脂以DMF洗涤三次，再以二氯甲烷洗涤三次，抽干后转移至圆底烧瓶中。量取30ml TFA，15ml TIS，105ml二氯甲烷混合后置于-20℃下预冻30min。将裂解液一次性加入至树脂中，裂解1.5h。反应结束后抽滤收集滤液，树脂以二氯甲烷洗涤三次后与滤液合并，减压浓缩除去大部分溶剂，加入600ml冰冻乙醚后洗出大量固体，离心收集固体后N2吹干，得粗肽肼8.31g。
实施例19戈舍瑞林/布舍瑞林肽酰肼的合成2
将实施例11所得的树脂转移至固相多肽合成管中，加入30ml DMF浸泡溶胀，洗去溶剂，顺序进行偶联操作；
偶联步骤：称取4.9mmolFmoc-氨基酸，0.79g HOBt，溶于30ml DMF中，置于冰浴下冷却，慢慢滴入0.67g DIC，活化5min，将活化后的反应液加入树脂中，N2鼓泡反应2h，抽滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后进行茚三酮检测；其中偶联所用氨基酸依次为：Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg-OH·HBr,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-D-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Tyr-OH,Fmoc-Ser-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,H-Pyr-OH.
茚三酮检测：取1～5mg树脂，置于离心管中，以乙醇洗涤三次，洗去上清液，加入数滴5％茚三酮-乙醇溶液，置于100℃金属浴上加热5min。若树脂及检测液呈黄色，则表示反应完全，可进行脱保护操作；若呈蓝黑色，则表示仍有部分未反应完，重复投料，直至反应完全。脱保护步骤：量取30ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应5min，过滤除去反应液，再次加入30ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应10min，过滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后重复进行偶联步骤；
裂解步骤：将偶联结束后的肽树脂以DMF洗涤三次，再以二氯甲烷洗涤三次，抽干后转移至圆底烧瓶中。量取5ml TFA，2.5ml TIS，42.5ml二氯甲烷，混合后置于-20℃下预冻30min。将裂解液一次性加入至树脂中，裂解1.5h。反应结束后向其中加入30ml纯水，室温搅拌10min后分液除去有机相，有机相再加入30min纯水搅拌10min，分液除去有机相，水相合并后加入醋酸钠固体调节pH至3～4，待用。得到戈舍瑞林/布舍瑞林肽酰肼水溶液。
实施例20戈舍瑞林/布舍瑞林肽酰肼的合成3
将实施例12所得的树脂转移至固相多肽合成管中，加入50ml DMF浸泡溶胀，洗去溶剂，顺序进行偶联操作；
偶联步骤：称取12.6mmolFmoc-氨基酸，2.04g HOBt，溶于50ml DMF中，置于冰浴下冷却，慢慢滴入1.75g DIC，活化5min，将活化后的反应液加入树脂中，N2鼓泡反应2h，抽滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后进行茚三酮检测；其中偶联所用氨基酸依次为：Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg-OH·1/2H2SO4,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-D-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Tyr-OH,Fmoc-Ser-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,H-Pyr-OH.
茚三酮检测：取1～5mg树脂，置于离心管中，以乙醇洗涤三次，洗去上清液，加入数滴5％茚三酮-乙醇溶液，置于100℃金属浴上加热5min。若树脂及检测液呈黄色，则表示反应完全，可进行脱保护操作；若呈蓝黑色，则表示仍有部分未反应完，重复投料，直至反应完全。脱保护步骤：量取50ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应5min，过滤除去反应液，再次加入50ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应10min，过滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后重复进行偶联步骤；
裂解步骤：将偶联结束后的肽树脂以DMF洗涤三次，再以二氯甲烷洗涤三次，抽干后转移至圆底烧瓶中。量取7.5ml TFA，4ml TIS，38.5ml二氯甲烷这个比例是5～20:5～10:70～90，确认一下有没有问题)，混合后置于-20℃下预冻30min。将裂解液一次性加入至树脂中，裂解1.5h。反应结束后向其中加入30ml纯水，室温搅拌10min后分液除去有机相，有机相再加入30min纯水搅拌10min，分液除去有机相，水相合并后加入醋酸钠固体调节pH至3～4，待用。得到戈舍瑞林/布舍瑞林肽酰肼水溶液。
实施例21阿拉瑞林肽酰肼的合成
将实施例13所得的树脂转移至固相多肽合成管中，加入50ml DMF浸泡溶胀，洗去溶剂，顺序进行偶联操作；
偶联步骤：称取15.1mmolFmoc-氨基酸，2.45g HOBt，溶于60ml DMF中，置于冰浴下冷却，慢慢滴入2.10g DIC，活化5min，将活化后的反应液加入树脂中，N2鼓泡反应2h，抽滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后进行茚三酮检测；其中偶联所用氨基酸依次为：Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-D-Ala-OH,Fmoc-Tyr-OH,Fmoc-Ser-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,H-Pyr-OH.
茚三酮检测：取1～5mg树脂，置于离心管中，以乙醇洗涤三次，洗去上清液，加入数滴5％茚三酮-乙醇溶液，置于100℃金属浴上加热5min。若树脂及检测液呈黄色，则表示反应完全，可进行脱保护操作；若呈蓝黑色，则表示仍有部分未反应完，重复投料，直至反应完全。
脱保护步骤：量取60ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应5min，过滤除去反应液，再次加入60ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应10min，过滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后重复进行偶联步骤；
裂解步骤：将偶联结束后的肽树脂以DMF洗涤三次，再以二氯甲烷洗涤三次，抽干后转移至圆底烧瓶中。量取54ml TFA，3ml TIS，3ml H2O，混合后置于-20℃下预冻30min。将裂解液一次性加入至树脂中，裂解1.5h。反应结束后减压浓缩反应液，加入300ml冰乙醚后析出大量固体。真空干燥后得到肽肼粗品，为白色块状固体5.94g，粗产率102.06％实施例22德舍瑞林肽酰肼的合成
将实施例16所得的树脂转移至固相多肽合成管中，加入30ml DMF浸泡溶胀，洗去溶剂，顺序进行偶联操作；
偶联步骤：称取16.2mmolFmoc-氨基酸，2.62g HOBt，溶于100ml DMF中，置于冰浴下冷却，慢慢滴入2.24g DIC，活化5min，将活化后的反应液加入树脂中，N2鼓泡反应2h，抽滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后进行茚三酮检测；其中偶联所用氨基酸依次为：Fmoc-Pro-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-D-Trp-OH,Fmoc-Tyr-OH,Fmoc-Ser-OH,Fmoc-Trp-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,H-Pyr-OH.
茚三酮检测：取1～5mg树脂，置于离心管中，以乙醇洗涤三次，洗去上清液，加入数滴5％茚三酮-乙醇溶液，置于100℃金属浴上加热5min。若树脂及检测液呈黄色，则表示反应完全，可进行脱保护操作；若呈蓝黑色，则表示仍有部分未反应完，重复投料，直至反应完全。
脱保护步骤：量取100ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应5min，过滤除去反应液，再次加入100ml 20％哌啶-DMF溶液，加入至树脂中，N2鼓泡反应10min，过滤除去反应液，树脂以DMF洗涤六次，抽干后重复进行偶联步骤；
裂解步骤：将偶联结束后的肽树脂以DMF洗涤三次，再以二氯甲烷洗涤三次，抽干后转移至圆底烧瓶中。量取90ml TFA，5ml TIS，5ml H2O，混合后置于-20℃下预冻30min。将裂解液一次性加入至树脂中，裂解1.5h。反应结束后减压浓缩反应液，加入600ml冰乙醚后析出大量固体。真空干燥后得到肽肼粗品，为白色块状固体6.89g，粗产率98.43％。
实施例23亮丙瑞林的合成
将实施例17所得的肽酰肼溶于200ml 30％甲醇-水溶液，使用稀盐酸调节pH＝3左右。置于-10℃下冷却。称取1.45g NaNO2溶于20ml水中，缓缓滴入肽肼溶液中，低温反应30min。吸取2.7ml乙胺水溶液(70％，10eq)，慢慢滴入反应体系中，维持在低温环境中持续反应6h，HPLC监测反应完成，取样检测，亮丙瑞林粗品纯度为80.6％，合成收率为65.2％。
实施例24布舍瑞林的合成
将实施例18中所得的60ml肽肼溶液加入30ml甲醇稀释后置于-10℃下冷却，称取0.56g NaNO2，溶于10ml水中，慢慢滴入反应体系中。低温下保持30min，随后加入1ml乙胺水溶液(70％，10eq)，低温反应6h，HPLC监测反应结束，取样检测，布舍瑞林粗品纯度为55.4％，合成收率为53.1％。
实施例25戈舍瑞林的合成
将实施例19中所得的肽肼溶液于室温下搅拌，称取1.02g氰酸钾，溶于10ml水中，慢慢滴入肽肼溶液中，室温搅拌20min，HPLC监控反应完成，取样检测，戈舍瑞林粗品纯度为60.25％，合成收率为50.8％，。
实施例26戈舍瑞林的合成
将实施例20中所得的肽肼溶液于室温下搅拌，吸取1.45g异氰酸三甲基硅脂，慢慢滴入肽肼溶液中，室温搅拌20min，HPLC监控反应完成，取样检测，戈舍瑞林粗品纯度为57.3％，合成收率为46.2％。
实施例27阿拉瑞林的合成
将实施例21中的肽酰肼溶于150ml 30％甲醇-水溶液，使用稀盐酸调节pH＝3左右。置于-10℃下冷却。称取1.04g NaNO2溶于20ml水中，缓缓滴入肽肼溶液中，低温反应30min。吸取3.2ml乙胺水溶液(70％，10eq)，慢慢滴入反应体系中，维持在低温环境中持续反应6h，HPLC监测反应完成，取样检测，阿拉瑞林粗品纯度为78.7％，合成收率为61.5％。
实施例28德舍瑞林的合成
将实施例22中的肽酰肼溶于150ml 30％甲醇-水溶液，使用稀盐酸调节pH＝3左右。置于-10℃下冷却。称取1.12g NaNO2溶于20ml水中，缓缓滴入肽肼溶液中，低温反应30min。吸取3.5ml乙胺水溶液(70％，10eq)，慢慢滴入反应体系中，维持在低温环境中持续反应6h，HPLC监测反应完成，取样检测，德舍瑞林粗品纯度为72.6％，合成收率为69.3％。
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