β2-微球蛋白多抗血清的制备方法
阅读说明：本技术 β2-微球蛋白多抗血清的制备方法 (Preparation method of beta 2-microglobulin multi-antiserum ) 是由 孙丰廷 刘鹏飞 郑长龙 赵占勇 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了β2-微球蛋白多抗血清的制备方法,包括：利用β2-微球蛋白抗原免疫实验兔不多于4次,每次免疫至少选取12个皮下注射点。本发明减少了免疫次数和免疫抗原的用量,省了时间成本和原料与人力成本。(The invention discloses a preparation method of beta 2-microglobulin polyclonal antiserum, which comprises the following steps: the beta 2-microglobulin antigen is used for immunizing an experimental rabbit not more than 4 times, and at least 12 subcutaneous injection points are selected for each immunization. The invention reduces the times of immunization and the dosage of immune antigen, and saves time cost, raw material cost and labor cost.)
技术领域
本发明涉及生物诊断、抗体原料相关领域。更具体地说，本发明涉及一种β2-微球蛋白多抗血清的制备方法。
背景技术
β2-微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，β2-微球蛋白异常升高可提示多种相关疾病，β2-微球蛋白的检测被认为是衡量糖尿病患者轻度肾功能减退和疗效观察的一项简便、精确而又敏感的方法。目前，抗人β2-微球蛋白抗体的制备动物主要包括羊、兔及小鼠等，其中羊源性抗人β2-微球蛋白抗体应用最多，因羊体型大，采集血浆量多，非常适合临床生产需要，但是羊源性抗人β2-微球蛋白抗体具有稳定性差及亲和力低问题。而且，传统的免疫方法制备的抗原难以产生较高效价的抗体，且免疫次数多和抗原用量多。因此，亟需设计一种能够一定程度克服上述缺陷的技术方案。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种β2-微球蛋白多抗血清的制备方法，其有效避免了抗血清纯化过程中高血脂问题的干扰，并减少了免疫次数和免疫抗原的用量，省了时间成本和原料与人力成本。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，根据本发明的一个方面，本发明提供了β2-微球蛋白多抗血清的制备方法，包括：利用β2-微球蛋白抗原免疫实验兔不多于4次，每次免疫至少选取12个皮下注射点。
进一步地，注射点选自肩前皮下、腹股沟皮下、颈背部皮下中的两个区域或三个区域，每个区域至少选取4个注射点。
进一步地，每个注射点β2-微球蛋白抗原的注射量为0.075～0.15mg。
进一步地，将β2-微球蛋白抗原用1xPBS缓冲溶液和弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂制成乳剂，然后用于注射。
进一步地，PBS缓冲溶液中包含有免疫增强剂，所述免疫增强剂为β-葡聚糖、甘露糖、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖、人参多糖、当归多糖、枸杞多糖、灵芝多糖、姜黄素、山楂多糖中的一种或多种。
进一步地，相邻两次免疫的间隔时间为7～14天。
进一步地，还包括：在最后一次免疫结束后，对实验兔进行心脏基部采血，静置，吸取上清，离心沉淀，分离上清，获得β2-微球蛋白多抗血清。
进一步地，在对实验兔进行免疫前，在实验兔饮水中添加氨基电解多维。
进一步地，所述实验兔为日本大耳兔。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了β2-微球蛋白多抗血清的制备方法，包括：步骤一、将β2-微球蛋白抗原、1xPBS缓冲液、完全弗氏佐剂混合，制得第一抗原乳剂，第一抗原乳剂中β2-微球蛋白抗原的浓度为1mg/mL；将β2-微球蛋白抗原、1xPBS缓冲液、不完全弗氏佐剂混合，制得第二抗原乳剂，第二抗原乳剂中β2-微球蛋白抗原的浓度为0.4～0.5mg/mL；选定肩前皮下4个注射点、腹股沟皮下4个注射点及颈背部皮下4个注射点；步骤二、用第一抗原乳剂对日本大耳兔进行初次免疫，每个注射点第一抗原乳剂的注射量为150～170μL；步骤三、间隔7～14天后，利用第二抗原乳剂对日本大耳兔进行第二次、第三次、第四次免疫，每次免疫间隔7～14天，每个注射点第二抗原乳剂的注射量为150～170μL；步骤四、在第六次免疫7～14天后，进行耳缘静脉采血，进行ELISA检测，符合目标需求后，进行心脏基部采血，静置，待血清完全析出后，吸取上层血清，离心沉淀分离获得上层抗血清，取上层抗血清加入硫柳汞，保存。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明选择具有低血脂水平以及较好的抗应激能力的实验兔，作为生产抗人β2-微球蛋白多抗血清的供体，有效避免了抗血清纯化过程中高血脂问题的干扰，并经4次多部位低剂量多点注射免疫后即达到较高的水平，为提升生物试剂产品的稳定性提供了可靠保障，并极大的减少了免疫次数和免疫抗原的用量，省了时间成本和原料与人力成本。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本申请的实施例提供了β2-微球蛋白多抗血清的制备方法，包括：利用β2-微球蛋白抗原免疫实验不多于4次，可选为4次，每次免疫至少选取12个皮下注射点，可选为12次。
在另一些实施例中，注射点选自肩前皮下、腹股沟皮下、颈背部皮下中的两个区域或三个区域，每个区域至少选取4个注射点，可选为肩前皮下、腹股沟皮下、颈背部皮下各4各注射点。
在另一些实施例中，每个注射点β2-微球蛋白抗原的注射量为0.075～0.15mg。
在另一些实施例中，将β2-微球蛋白抗原用1xPBS缓冲溶液和弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂制成乳剂，然后用于注射，可选为第一次免疫用1xPBS缓冲溶液和弗氏完全佐剂制成乳剂，后续免疫用1xPBS缓冲溶液和弗氏不完全佐剂制成乳剂。
在另一些实施例中，PBS缓冲溶液中包含有免疫增强剂，所述免疫增强剂为β-葡聚糖、甘露糖、香菇多糖、黄芪多糖、党参多糖、人参多糖、当归多糖、枸杞多糖、灵芝多糖、姜黄素、山楂多糖中的一种或多种，优选按照按0.5mg/ml-5mg/ml的浓度添加至溶解抗原的缓冲液中。
在另一些实施例中，相邻两次免疫的间隔时间为7～14天，具体而言，一次免疫结束后，对免疫兔行耳缘静脉采血，析出血清抗体效价行ELISA检测，依据抗体水平及原免疫部位抗原吸收情况决定下一次免疫时间，优选为灵芝多糖、人参多糖、当归多糖、枸杞多糖。
在另一些实施例中，还包括：在最后一次免疫结束后，对实验兔进行心脏基部采血，静置，吸取上清，离心沉淀，分离上清，获得β2-微球蛋白多抗血清。可选地，于37℃静置1h后置于4℃下，用移液枪吸取上层血清，于3000rpm 15min离心沉淀分离获得上层抗血清，取上清加入终浓度为0.01％硫柳汞，4℃长期保存。
在另一些实施例中，在对实验兔进行免疫前，在实验兔饮水中添加氨基电解多维，维持实验兔机体电解质、氨基酸及维生素供应，提升抗应激能力。
在另一些实施例中，所述实验兔为日本大耳兔。
本申请的实施例还提供了β2-微球蛋白多抗血清的制备方法，包括：步骤一、将β2-微球蛋白抗原、1xPBS缓冲液、完全弗氏佐剂混合，制得第一抗原乳剂，第一抗原乳剂中β2-微球蛋白抗原的浓度为1mg/mL；将β2-微球蛋白抗原、1xPBS缓冲液、不完全弗氏佐剂混合，制得第二抗原乳剂，第二抗原乳剂中β2-微球蛋白抗原的浓度为0.4～0.5mg/mL，免疫增强剂按0.5mg/ml-5mg/ml的浓度添加至溶解抗原的缓冲液；选定肩前皮下4个注射点、腹股沟皮下4个注射点及颈背部皮下4个注射点；步骤二、用第一抗原乳剂对日本大耳兔进行初次免疫，每个注射点第一抗原乳剂的注射量为150～170μL；步骤三、间隔7～14天后，利用第二抗原乳剂对日本大耳兔进行第二次、第三次、第四次免疫，每次免疫间隔7～14天，每个注射点第二抗原乳剂的注射量为150～170μL；步骤四、在第六次免疫7～14天后，进行耳缘静脉采血，进行ELISA检测，符合目标需求后，进行心脏基部采血，静置，待血清完全析出后，吸取上层血清，离心沉淀分离获得上层抗血清，取上层抗血清加入硫柳汞，保存。
以下以具体实施例说明：
实验对象：选取300只，体格健壮，有活力的8月龄雄性日本大耳兔，平均体重(3.0±0.5)kg，所有兔只均有耳标，耳标耳号对应了每只兔的免疫和生产档案信息，分为5组，每组60只。饲养方式为笼养、固定饮水器和料盘，饲喂颗粒饲料，自动饮水系统，饲料一日三次(早：中：晚＝3：3：4)，半开放饲养模式，免疫前3天饮水中添加氨基电解多维。
实验方法：
(1)免疫抗原制备：依据计划免疫接种动物数量进行计算抗原需求量，经弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂乳化后抗原总体积为620ml，2ml/只，于其肩前皮下4个注射点、腹股沟皮下4个注射点及颈背部皮下4个注射点，平均每个注射点注射150μl。
(2)免疫接种程序：将免疫增强剂中的一种或多种不同组合分5组，第一组为β-葡聚糖、甘露糖，第二组为党参多糖、人参多糖、当归多糖、枸杞多糖，第三组为党参多糖、人参多糖、当归多糖、枸杞多糖，第四组为灵芝多糖、人参多糖、当归多糖、枸杞多糖，第五组为山楂多糖、枸杞多糖、香菇多糖、黄芪多糖，60只/组，按0.5mg/mL-5mg/ml的浓度与纯化的血清β2-微球蛋白抗原2mg 0.1ml、1x PBS 0.9ml混合后与完全弗氏佐剂1ml经电动搅拌乳化后总体积为2ml，作为初次免疫；相同抗原1mg 0.1ml、1x PBS 0.9ml及不完全弗氏佐剂1ml经电动搅拌乳化后总体积为2ml，作为第二次免疫；相同抗原1mg 0.1ml、1x PBS 0.9ml及不完全弗氏佐剂1ml经电动搅拌乳化后总体积为2ml，作为第三、四、五次免疫；相同抗原0.8mg0.1ml、1x PBS 1.9ml均匀混合后总体积为2ml，作为第六、七次免疫。
(3)兔抗人β2-微球蛋白血清采集
依据免疫程序需要，第五次免疫后5天进行兔耳缘静脉采血2-3ml/只，室温(37℃)静置1h后，待血清析出，以3000rpm离心15min，取上清加入0.01％硫柳汞，4℃保存。
经血清检测达到目标效价后，于第六次免疫后7-14d行心脏采血。静脉注射麻醉后，仰卧保定，于胸骨剑突处近心脏处，剪毛并进行皮肤常规消毒，用左手中指、食指及拇指轻轻向左胸部推移心脏至固定后，选择16号针头连接凝血管于心搏较强的心脏基部刺入，收集血量20-25ml，停止采血，并静脉滴注含止血敏的生理盐水125-250ml，辅助补液止血。采集的血液轻轻倒转混合后，置于室温凝固1h以上，于3000rpm离心20min后分离血清，并做好编号保存于4℃。
兔抗人血清用β2-微球蛋白测定试剂盒(ELISA法)测定比较结果。
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中β2-微球蛋白水平。用纯化的β2-微球蛋白抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被单抗的微孔中依次加入β2微球蛋白，再与HRP标记的β2-微球蛋白抗原结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的β2-微球蛋白呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中β2-微球蛋白浓度。
表1-5为不同分组四免后血清效价水平、兔的数量占比。
表1第一组
血清抗体效价
兔数量(只)
兔占比％
>200万
30
50％
72-200万
18
30％
24-72万
2
3.3％
<24万
10
16.7％
表2第二组
血清抗体效价
兔数量(只)
兔占比％
>200万
21
35％
72-200万
15
25％
24-72万
10
16.7％
<24万
14
23.3％
表3第三组
血清抗体效价
兔数量(只)
兔占比％
>200万
30
50％
72-200万
21
35％
24-72万
3
5％
<24万
6
10％
表4第四组
血清抗体效价
兔数量(只)
兔占比％
>200万
36
60％
72-200万
18
30％
24-72万
1
1.7％
<24万
5
8.3％
表5第五组
血清抗体效价
兔数量(只)
兔占比％
>200万
24
40％
72-200万
18
30％
24-72万
3
5％
<24万
15
25％
表6-10为不同分组六免后血清效价水平、兔的数量占比。
表6第一组
血清抗体效价
兔数量(只)
兔占比％
>200万
27
45％
72-200万
12
20％
24-72万
9
15％
<24万
12
20％
表7第二组
血清抗体效价
兔数量(只)
兔占比％
>200万
24
40％
72-200万
9
15％
24-72万
9
15％
<24万
18
30％
表8第三组
血清抗体效价
兔数量(只)
兔占比％
>200万
33
55％
72-200万
21
35％
24-72万
0
0％
<24万
6
10％
表9第四组
血清抗体效价
兔数量(只)
兔占比％
>200万
36
60％
72-200万
21
35％
24-72万
0
0％
<24万
3
5％
表10第五组
血清效价评定结果：实施例四免后获得的免疫兔血清效价第四组效果较好；本发明兔抗人β2-微球蛋白血清抗体效价范围大于等于72万为合格(表1-5)；
血清效价评定结果：实施例六免后获得的免疫兔血清效价第四组效果较好；本发明兔抗人β2-微球蛋白血清抗体效价范围大于等于72万为合格(表6-10)；
综上效价检测结果可知：使用日本大耳兔作为免疫动物，经4次多部位低剂量多点注射免疫后即达到较高的水平(通常情况下需要免疫6～8次)，这充分证明以本申请的方法免疫日本大耳兔可以制备高效价稳定的兔抗人β2-微球蛋白多抗，为提升生物试剂产品的稳定性提供了可靠保障，并极大的减少了免疫次数和免疫抗原的用量，省了时间成本和原料与人力成本。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明β2-微球蛋白多抗血清的制备方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。