一种高密度硅纳米锥结构及其在检测小分子中的应用
阅读说明：本技术 一种高密度硅纳米锥结构及其在检测小分子中的应用 (High-density silicon nanocone structure and application thereof in detecting small molecules ) 是由 吕男 窦树珍 王中舜 陈琪野 于 2021-08-03 设计创作，主要内容包括：一种高密度硅纳米锥结构及其作为表面辅助激光解吸/电离质谱基底在检测小分子中的应用,属于质谱分析技术领域。基底是通过直接无掩模版反应离子刻蚀单晶硅,再利用低浓度的氟化氢水溶液剥离表面氧化层获得。由于高密度的锥状结构的独特形貌,使得空气和基底物质之间的折射率系数呈现缓慢的递变,从而提高基底的吸光率,有利于高效地解吸以及电离分子；同时,硅纳米结构锥的尖端结构会促进能量和热电子聚集在尖端位置,有效地提高基底的解吸电离能力；另外,疏水的基底具有的浓缩效应有利于进一步提高检测灵敏度。因此利用疏水的高密度硅纳米锥结构物作为基底检测各种小分子时,不论在正离子模式还是负离子模式下,均具有高的检测灵敏度。(A high-density silicon nanocone structure and application thereof as a surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry substrate in detecting small molecules belong to the technical field of mass spectrometry. The substrate is obtained by directly carrying out mask-free reactive ion etching on monocrystalline silicon and then stripping a surface oxide layer by using a low-concentration hydrogen fluoride aqueous solution. Due to the unique morphology of the high-density conical structure, the refractive index coefficient between air and a substrate substance is slowly graded, so that the light absorption rate of the substrate is improved, and efficient desorption and molecule ionization are facilitated; meanwhile, the tip structure of the silicon nano-structure cone can promote energy and hot electrons to be gathered at the tip position, so that the desorption ionization capacity of the substrate is effectively improved; in addition, the hydrophobic substrate has a concentration effect that is advantageous for further improving the detection sensitivity. Therefore, when the hydrophobic high-density silicon nano cone structure is used as a substrate to detect various small molecules, the detection sensitivity is high no matter in a positive ion mode or a negative ion mode.)
技术领域
本发明属于质谱分析技术领域，具体涉及一种高密度硅纳米锥结构及其作为表面辅助激光解吸/电离质谱基底在检测小分子中的应用。
背景技术
表面辅助激光解吸/电离质谱具有在低分子量区干扰小、高精度、高通量、检测速度快以及操作方便等优点，是一种能够检测各种小分子的多功能分析工具。然而，要想实现大规模的实际应用，制备一种低成本、高灵敏度的表面辅助激光解吸/电离质谱的基底是有必要的。
在激光解吸/电离过程中，激光提供原始能量，而基底作为分析物的载体和能量容器，吸收激光能量并将能量转移到吸附的分子，促使分子解吸附并离子化。目前，辅助激光解吸/电离的媒介主要分为两大类:无机纳米结构表面(如:硅基纳米结构表面、金属/金属氧化物基纳米结构表面以及复合纳米结构表面)和无机纳米材料(例如：贵金属纳米粒子、金属氧化物纳米材料以及碳纳米材料)。总的来说，与纳米材料相比，纳米结构表面在激光辐照下具有更高的稳定性，因此背景干扰峰更少，有利于提高检测灵敏度。此外，以芯片形式出现的纳米结构表面更有助于构建集成和自动化系统。
现有的表面辅助激光解吸/电离质谱芯片大多基于硅材料，因为硅基基底具有明显的优势。首先，硅的热容大，导热系数低，能有效地促进热能从基底传递给分析物。其次，硅是一种电子-空穴复合效率较低的间接带隙半导体，可以延长光生载流子的寿命，促进电子从基底转移到分析物。此外，硅的加工技术已经很成熟，通过湿法刻蚀和干法刻蚀技术可以制备多种纳米结构。
不同形貌的硅纳米结构会导致其物理性质产生差异，因此往往表现出不同的激光解吸/电离效率。例如，多孔硅是首次也是经典的将硅纳米结构作为基底应用于表面辅助激光解吸/电离质谱的案例，其高比表面积的结构作为支架可负载更多的分析物小分子；强紫外吸收能力保证了基底吸收更多的激光能量；低导热系数有利于吸收的激光能量从基底传输给分析物小分子。因此，多孔硅表面经过硅烷分子功能化后可检测各种类型的小分子(Wei J.，Buriak J.M.，Siuzdak G.，Nature，1999，399(6733)，243—246)。然后，具有更大比表面积的硅纳米线结构被引入表面辅助激光解吸/电离质谱，实现了amol水平的检测灵敏度(Go E.P.，Apon J.V.，Luo G.，Saghatelian A.，Daniels R.H.，Sahi V.，Dubrow R.，Cravatt B.F.，Vertes A.，Siuzdak G.，Anal.Chem.，2005，77(6)，1641—1646)。最近，Jianmin Wu等人证实了垂直的硅纳米线结构可增强电子转移，并促进分子的离子化，表明了有尖端的突状结构在表面辅助激光解吸/电离质谱中的重要作用(Go E.P.，Apon J.V.，Luo G.，Saghatelian A.，Daniels R.H.，Sahi V.，Dubrow R.，Cravatt B.F.，Vertes A.，Siuzdak G.，Anal.Chem.，2005，77(6)，1641—1646)。随后，更多的突状结构，如硅微、纳柱和纳米锥阵列受到了越来越多的关注，因为能量倾向于定位在缺陷附近，而突起和边缘位置使这些区域在激光解吸/电离过程中更加活跃(Walker B.N.，Razunguzwa T.，PowellM.，Knochenmuss R.，Vertes A.，Angew.Chem.Int.Ed.，2009，48(9)，1669—1672；FincherJ.A.，Jones D.R.，Korte A.R.，Dyer J.E.，Parlanti P.，Popratiloff A.，BrantnerC.A.，Morris N.J.，Pirlo R.K.，ShanmugamV.K.，Vertes A.，Sci.Rep.，2019，9(1)，17508—17510；Wang Y.D.，Zeng Z.F.，Li J.，Chi L.F.，Guo X.H.，Lu N.，J.Am.Soc.MassSpectrom.，2013，24(1)，66—73)。由此可见，高密度的硅纳米锥结构表面会促进能量积累以及电子转移，这将有利于激光解吸/电离过程，应该是一个合格的表面辅助激光解吸/电离质谱基底。
另外，表面辅助激光解吸/电离质谱基底的实际应用还依赖于低成本的大面积制备方法。最常用的湿法刻蚀(如多孔硅，硅纳米线的制备)是一种使用剧毒氟化氢进行刻蚀的危险的制备方法，且湿法刻蚀不利于大面积制备均匀的结构。干法刻蚀是一种无毒的且具有高度重复性的刻蚀方法，但通常需要掩模版的辅助(如硅微柱阵列和纳米锥阵列的制备)，这不仅降低了结构的密度，还使得制备过程更加复杂。因此，需要一种简单且易于控制的方法来制造大面积的高密度硅纳米锥结构。
发明内容
本发明的目的是利用简单可控的方法制备大面积的高密度硅纳米锥结构，并将其作为表面辅助激光解吸/电离质谱的基底用于检测小分子。
本发明所述的一种高密度硅纳米锥结构，其是由如下步骤制备得到：
(1)利用无掩模版反应离子刻蚀技术，直接刻蚀干净的硅片，得到超亲水的高密度硅纳米锥结构；伴随着刻蚀过程的进行，刻蚀气体与硅反应形成5～20nm厚的SixOyFz薄层，并沉积在硅纳米锥结构表面；
(2)将步骤(1)刻蚀得到的具有高密度硅纳米锥结构的硅片浸入低浓度的氟化氢水溶液中，剥离硅纳米锥结构表面的SixOyFz薄层，得到本发明所述的作为表面辅助激光解吸/电离质谱基底的疏水的高密度硅纳米锥结构。
进一步，步骤(1)所述的无掩模版反应离子刻蚀技术，具体步骤如下：
①将硅片依次用丙酮、氯仿、乙醇和去离子水在40～100W下超声清洗3～10min，再用去离子水冲洗并用氮气吹干，得到干净的硅片；
②将步骤①得到的干净的硅片在5×10-5～8×10-5Pa真空度下进行反应离子刻蚀，刻蚀的参数为：O2流量为30～50sccm，SF6流量为30～50sccm，且O2与SF6的流量比例为1：1，CHF3流量为5～15sccm，腔体压力为10～50mtorr，射频功率为10～200W，电感耦合等离子体功率为0W，刻蚀时间为10～50min；刻蚀得到超亲水性的高密度硅纳米锥结构，锥的密度为80～200个/μm2，锥的高度为300～600nm，锥的底面直径为10～40nm，硅纳米锥结构表面的水接触角小于等于1°；
步骤(2)所述的利用低浓度的氟化氢水溶液中剥离硅纳米锥结构表面的SixOyFz薄层，具体步骤如下：
将步骤(1)刻蚀得到的具有高密度硅纳米锥结构的硅片浸入到体积浓度为0.01％～0.10％的氟化氢水溶液中，保持5～20min，以剥离表面SixOyFz薄层，形成以氟离子为终端的硅纳米结构表面，降低了结构的表面能，从而得到疏水性的高密度硅纳米锥结构，水接触角范围为110～130°；
本发明所述的高密度硅纳米锥结构可以在检测小分子中得到应用，具体的是滴加分析物小分子溶液到疏水性的高密度硅纳米锥结构表面，晾干后进行质谱检测。
进一步，步骤(1)所述的滴加分析物小分子溶液到疏水性的高密度硅纳米锥结构表面，具体是用移液枪吸取0.5～10μL的分析物小分子溶液滴加到疏水性的高密度硅纳米锥结构表面。分析物小分子包括但不限于氨基酸(具体如肌氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、组氨酸)，寡肽(具体如谷胱甘肽，血管紧张素III)，小分子药物(具体如美沙酮、戊脉安)，染料分子(具体如甲基橙、孔雀石绿)，以及胞嘧啶核苷等；小分子溶液的溶剂可为去离子水、人血清或湖水。
步骤(2)所述的晾干步骤(1)中制备的样品，进行质谱检测，是在空气中晾干步骤(3)制得的样品，将晾干的样品粘贴到质谱靶板上放入仪器进行质谱测试，该测试是在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱联用仪(Autoflex speed TOF/TOF，布鲁克，德国)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV，每张质谱图都是经过100～1000次激光照射后累加得到的。
本发明所述的高密度硅纳米锥结构作为表面辅助激光解吸/电离质谱的基底有以下几个特点：
(1)提高基底的吸光率。由于高密度的锥状结构的独特形貌，使得空气和基底物质之间的折射率系数呈现缓慢的递变，从而提高基底的吸光率，而激光能量是解吸/电离的原始能量，因此提高的基底的吸光率有利于高效地解吸以及电离分子，从而提高检测灵敏度；
(2)使能量聚集。锥硅纳米结构促进能量聚集在锥的尖端位置，这种能量聚焦效应主要促进分子的解吸，也避免了激光导致的硅基底自解吸，降低了基底表面相关的背景离子干扰，提高检测灵敏度；
(3)锥具有的尖端形状也能促进电子转移，电子从基底转移到待测物分子，有效地提高基底的电离能力，提高了检测灵敏度；
(4)高密度的锥。高密度的锥结构不仅可以在单位面积上负载更多的分子，同时激光斑点覆盖下有足够多的锥，能够提高解吸/电离效率，从而提高检测灵敏度；
(5)浓缩富集作用。疏水性的高密度硅纳米锥结构可以使得样品液滴在基底有着较大的接触角，这种浓缩效应有利于进一步提高检测灵敏度；
(6)制备方法简单。通过无掩模版等离子刻蚀技术可实现大面积、重复地制备基底。
附图说明
图1：本发明所述的高密度硅纳米锥结构的构筑过程示意图；
图2：剥离氧化层前后的高密度硅纳米锥结构的静态水接触角图片。图a是剥离氧化层前的高密度硅纳米锥结构的水接触角图片；图b剥离氧化层后的高密度硅纳米锥结构的水接触角图片；
图3：高密度硅纳米锥结构的光学图片以及扫描电子显微镜图片。图a是高密度硅纳米锥结构的光学图片(厘米尺度)，图a中的插图是未经刻蚀的单晶硅光学图片；图b是高密度硅纳米锥结构的倾斜45°的扫描电子显微镜图片；图c是高密度硅纳米锥结构的倾斜90°的扫描电子显微镜图片；
图4：高密度硅纳米锥结构的反射光谱图片；
图5：以高密度硅纳米锥结构作为表面辅助激光解吸/电离质谱基底，在双极性模式下(正离子模式和负离子模式)检测(a)3nmol肌氨酸，(b)3nmol精氨酸，(c)3nmol胞嘧啶核苷和(d)3nmol谷胱甘肽的质谱谱图；
图6：以高密度硅纳米锥结构作为表面辅助激光解吸/电离质谱基底，在负离子模式下检测(a)3nmol甘氨酸，(b)3nmol丙氨酸，(c)3nmol苏氨酸，(d)3nmol半胱氨酸，(e)3nmol异亮氨酸，(f)3nmol赖氨酸，(g)3nmol酪氨酸和(h)3nmol组氨酸的质谱谱图；
图7：以高密度硅纳米锥结构作为表面辅助激光解吸/电离质谱基底，在正离子模式下检测(a)3nmol美沙酮，(b)3nmol戊脉安，(c)3nmol甲基橙和(d)3nmol孔雀石绿的质谱谱图；
图8：以高密度硅纳米锥结构作为表面辅助激光解吸/电离质谱基底，在负离子模式下检测(a)300amol丙氨酸，(b)300amol组氨酸，(c)300amol精氨酸，(d)300amol酪氨酸(e)300amol谷胱甘肽以及在正离子模式下检测(f)600amol血管紧张素III的质谱谱图；
图9：以高密度硅纳米锥结构作为表面辅助激光解吸/电离质谱基底，在正离子模式下检测(a)血清中的戊脉安和(b)湖水中的结晶紫的质谱谱图。
如图1所示，是实施例1中得到的高密度硅纳米锥结构的构筑示意图。直接将硅片进行反应离子刻蚀技术，得到表面覆盖有SixOyFz薄层的高密度硅纳米锥结构，随后用低浓度的氟化氢水溶液浸泡剥离表面的氧化层，并形成以氟离子为终端的高密度硅纳米锥结构。
如图2所示，是实施例2中，高密度硅纳米锥结构在剥离表面氧化层前后的静态水接触角图片。从中看出，剥离氧化层前，高密度硅纳米锥结构是超亲水的，接触角是1°；经氟化氢水溶液浸泡后，表面的氧化层被溶解，并形成以氟离子为终端的硅纳米结构表面，降低了结构的表面能，从而得到疏水性的高密度硅纳米锥结构，接触角达到了121°。
如图3所示，是实施例3中，疏水性的高密度硅纳米锥结构的光学图片以及扫描电子显微镜图片。从光学图片中可以看出，由于结构优异的减反性能，硅基底表面呈现黑色。从扫描电子显微镜图看出，锥结构在整片硅表面排列紧密，高度为493nm。
如图4所示，是实施例4中，疏水性的高密度硅纳米锥结构的光谱图片。从中可以看出，由于硅纳米锥独特的形貌，尺寸以及适当的有效折射系数，使得在紫外可见很宽的波段内有低的光反射(低于5％)，保证了基底对波长为355nm激光能量的吸收。
如图5所示，是实施例5中得到的肌氨酸、精氨酸、胞嘧啶核苷和谷胱甘肽水溶液滴加在疏水性的高密度硅纳米锥结构上，干燥后进行双极模式检测收集到的质谱图片。从质谱图片可以看出，不论在正离子模式下还是负离子模式下，所有分子均被检测到，且都表现出高信号强度和低背景干扰。其中在正离子模式下，分子以[M+H]+和/或[M+Na]+、[M+K]+加合峰的形式被检测到，而在负离子模式下4种分子均以[M-H]-的形式被检测到。这说明疏水性的高密度硅纳米锥结构可以在正离子和负离子模式下灵敏地检测生物小分子。
如图6所示，是实施例6中得到的甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸和组氨酸水溶液滴加在疏水性的高密度硅纳米锥结构上，干燥后进行负离子模式检测收集到的质谱图片。从质谱图片可以看出，在负离子模式下，8种氨基酸都以脱质子分子离子的形式被检测到，重要的是，所有的质谱图都表现出干净的背景，进一步展示了疏水性的高密度硅纳米锥结构在负离子模式下检测生物小分子的潜力。
如图7所示，是实施例2中得到美沙酮、戊脉安、甲基橙以及孔雀石绿水溶液滴加在疏水性的高密度硅纳米锥结构上，干燥后进行正离子模式检测收集到的质谱图片。从中可以看出，在正离子模式下，2种药物小分子和2种染料分子都被检测到，且所有的质谱图都表现出干净的背景，进一步表明了疏水性的高密度硅纳米锥结构在正离子模式下检测小分子的能力，同时证明了其普适性，适用于检测各种类型的小分子。
如图8所示，是实施例8中得到的丙氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、谷胱甘肽和血管紧张素III水溶液滴加在疏水性的高密度硅纳米锥结构上，干燥后进行正离子或负离子模式检测收集到的质谱图片。从中可以看出，在低至amol时，氨基酸和寡肽均可检测到明显特征峰，信噪比分别为4.3、4.9、5.8、5.9、6.4和3.1。证明了高密度硅纳米锥结构作为表面辅助激光解吸/电离基底的高检测灵敏度。
如图9所示，是实施例9中得到的人血清中1×10-3mol/L和1×10-9mol/L戊脉安溶液，以及湖水中1×10-5mol/L和1×10-12mol/L的结晶紫溶液滴加在疏水性的高密度硅纳米锥结构上，干燥后进行正离子模式检测收集到的质谱图片。从中可以看出，即使在复杂的实际样品中，高密度硅纳米锥结构仍然具有高的解吸/电离效率，证明了高密度硅纳米锥结构作为表面辅助激光解吸/电离基底的高检测灵敏度以及实用性。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步阐明本发明的方法及应用，而不是要用这些实施例来限制本发明。本发明的目的是利用简单的方法制备大面积的高密度硅纳米锥结构作为表面辅助激光解吸/电离质谱基底。这种制备简单且检测灵敏度高的基底有利于推进质谱检测的研究。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
先将硅片切成5.0cm×5.0cm的块状，然后依次用丙酮、氯仿、乙醇和去离子水在40W下各超声清洗5min。最后用去离子水冲洗并用氮气吹干。
将清洗干净的硅片在7.29×10-5Pa真空度下开始刻蚀，刻蚀的参数为：SF6流量为40sccm，CHF3流量为10sccm，O2流量为40sccm，腔体压力为30mtorr，射频功率为100W，电感耦合等离子体功率为0W，刻蚀时间为40min。
将刻蚀完的硅片浸入体积浓度为0.04％的氟化氢水溶液中，保持10min，以剥离表面氧化层，最后用去离子水冲洗并用氮气吹干。得到接触角为121°的高密度硅纳米锥结构。
实施例2
将实施例1得到的剥离氧化层前后的高密度硅纳米锥结构进行静态水接触角表征。该测试是在液滴形状分析系统(DSA10 MK2，克鲁斯，德国)进行的。
实施例3
将实施例1得到的剥离氧化层后的高密度硅纳米锥结构进行光学表征以及扫描电子显微镜表征。光学照片采用红米手机(K30 Ultra，小米，中国)拍摄，扫描电子显微镜测试是在场发射扫描电子显微镜(SU8020，日立，日本)进行的。
实施例4
将实施例1得到的剥离氧化层后的高密度硅纳米锥结构放入仪器进行光谱测试，该测试是在紫外可见近红外分光光度计(UV-3600，岛津，日本)进行的。
实施例5
将3μL的1×10-3mol/L的肌氨酸、精氨酸、胞嘧啶核苷和谷胱甘肽的水溶液分别滴加在疏水性的高密度硅纳米锥结构上，将晾干的样品粘贴到质谱靶板上放入仪器进行质谱测试。该测试是在基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱联用仪(Autoflex speed TOF/TOF，布鲁克，德国)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
实施例5
将6μL的1×10-3mol/L的甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、酪氨酸和组氨酸水溶液分别滴加在疏水性的高密度硅纳米锥结构上，将晾干的样品粘贴到质谱靶板上放入仪器进行质谱测试。该测试是在基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱联用仪(Autoflex speed TOF/TOF，布鲁克，德国)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
实施例7
将3μL的1×10-3mol/L的美沙酮、戊脉安、甲基橙以及孔雀石绿水溶液分别滴加在疏水性的高密度硅纳米锥结构上，将晾干的样品粘贴到质谱靶板上放入仪器进行质谱测试。该测试是在基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱联用仪(Autoflex speed TOF/TOF，布鲁克，德国)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
实施例8
将3μL的1×10-10mol/L丙氨酸、组氨酸、精氨酸、酪氨酸、谷胱甘肽水溶液和6μL的1×10-10mol/L血管紧张素III水溶液分别滴加在疏水性的高密度硅纳米锥结构上，将晾干的样品粘贴到质谱靶板上放入仪器进行质谱测试。该测试是在基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱联用仪(Autoflex speed TOF/TOF，布鲁克，德国)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
实施例9
将3μL人血清中1×10-3mol/L和1×10-9mol/L戊脉安溶液，以及3μL湖水中1×10- 5mol/L和1×10-12mol/L的结晶紫溶液分别滴加在疏水性的高密度硅纳米锥结构上，将晾干的样品粘贴到质谱靶板上放入仪器进行质谱测试。该测试是在基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱联用仪(Autoflex speed TOF/TOF，布鲁克，德国)上进行的，激光是氮激光器发出的波长为355nm的激光，加速电压为20kV。每张质谱图都是经过500次激光照射后累加得到的。
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