具体实施方式

本公开的第一实施方案是用于分析样品中包含的目标物质的荧光偏振免疫分析，并且所述荧光偏振免疫分析包括:

用于将荧光标记物质结合到样品中包含的目标物质的结合步骤，，所述荧光标记物质中用荧光染料标记对目标物质具有结合能力的单结构域抗体；和

用于测量与目标物质结合的荧光标记物质的荧光偏振的变化的测量步骤。检测灵敏度随着单结构域抗体的使用而提高，使得能够测量包含低浓度目标物质的样品和测量高分子量目标物质。

已知仅包含重链的重链抗体产生于驼科动物(如双峰驼、单峰驼、无峰驼、羊驼、骆马和原驼)和软骨鱼(如鲨鱼和鳐鱼)的体内。来源于骆驼的重链抗体的可变区称为VHH抗体，来源于软骨鱼的重链抗体的可变区称为vNAR(可变新抗原受体)抗体。重链抗体的每个重链的可变区是通过框架区和CDR发挥抗原结合特性的单结构域抗体。本文中的“单结构域抗体”是指由一个可变区组成的抗体。VHH和vNAR抗体可以用作单结构域抗体。

本公开中使用的单结构域抗体限于那些对特定目标物质具有结合能力的抗体。当目标物质的至少一部分被定义为表位时，要求单结构域抗体具有能够识别和结合该表位的结合能力。

具有这种结合能力的单结构域抗体可以通过制备与作为抗原的目标物质反应的重链抗体并通过剪切等切掉重链抗体的一部分来制备。例如，可以用目标物质作为抗原免疫产生重链抗体的动物，并且可以从所述免疫动物的B细胞中选择与抗原结合的重链抗体。通过用酶等剪切重链抗体获得的VHH抗体、vNAR抗体等的可变区可以用作单结构域抗体。此外，单结构域抗体不限于来自重链抗体的分离物。单结构域抗体可以是通过参考常规已知的VHH抗体和vNAR抗体的DNA序列或通过使用抗体文库等，通过基因工程产生的对特定物质具有特定结合能力的抗体。此外，在以这种方式制备的单结构域抗体中，为了在不损害与目标物质的结合性的程度上提高耐热性，耐化学药品性，耐压性等目的，可以将一些氨基酸替换为其他氨基酸残基。此外，常规已知的Fab抗体或scFv抗体可被分解以提取一个可变区，该可变区可用作单结构域抗体。

将本公开中使用的单结构域抗体用荧光染料标记，然后用作荧光标记物质。

这里的“荧光”是指当激发电子的光被照射时产生的光发射。此外，“荧光染料”是指发射荧光的染料。这里的荧光染料还包括发射磷光的染料，因为当原子吸收能量并像荧光一样被激发时也发射磷光。如果荧光染料发出磷光，可以基于磷光而不是荧光来测量荧光偏振。

可用于本公开的荧光染料的实例包括荧光素化合物，例如氯三嗪基氨基荧光素、4’-氨基甲基荧光素、5-氨基甲基荧光素、6-氨基甲基荧光素、6-羧基荧光素、5-羧基荧光素、5-和6-氨基荧光素、硫脲荧光素和甲氧基三嗪基氨基荧光素；硝基苯并噁二唑衍生物(例如硝基苯并噁二唑氯化物)；吲哚宁；丹磺酰基衍生物(例如丹磺酰基)；萘衍生物(例如二烷基氨基萘和二烷基氨基萘磺酰基):芘衍生物(例如N-(1-芘基)马来酰亚胺)、氨基芘、芘丁酸和炔基芘；金属络合物(例如铂、铼、钌、锇和铕)；罗丹明衍生物(例如罗丹明B、罗丹明6G和罗丹明6GP)；以及，作为注册商标或产品名称的Alexa Fluor系列(例如Alexa Fluor488、BODIPY系列、DY系列、ATTO系列、Dy Light系列、Oyster系列、HiLyte Fluor系列、Pacific Blue、Marina Blue、Acridine、Edans、Coumarin、DANSYL、FAN、Oregon Green、罗丹明绿-X、NBD-X、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、R6G、Cy3、TAMRA、罗丹明红-X、雷德蒙红、ROX、Cal Red、Texas Red、LC Red 640、Cy5、Cy5.5和LC Red 705。钌发出磷光，并且其荧光寿命为2700纳秒。

图1示意性地说明了荧光染料的荧光寿命、荧光偏振和分子量之间的关系。该图是参照"Use of a Long-Lifetime Re(I)Complex in Fluorescence PolarizationImmunoassays of High-Molecular-Weight Analytes",Analytical Chemistry,1998,Vol.70,P632创建的。图1的横轴表示分子量，纵轴表示荧光偏振。图1表明可以通过荧光偏振测量的总质量区域倚赖荧光染料的荧光寿命而不同，并且当荧光偏振在预定范围内(图1中约0.05至0.35的范围)时，可以定量目标物质的浓度。例如，当使用荧光寿命为4纳秒的荧光染料时，荧光偏振在1×10³至1×10⁵(Da)的范围内显著变化，当使用荧光寿命为100纳秒的荧光染料时，范围是1×10⁴至1×10⁷(Da)，当使用荧光寿命为2700纳秒的荧光染料时，范围是1×10⁶至1×10⁸(Da)。在激发荧光染料的时间和荧光染料发出荧光的时间之间，通过结合目标物质的荧光标记物质的旋转扩散来消除荧光偏振。如果使用寿命更长的荧光染料，可以在较高分子量区域测量荧光偏振的变化。这样，例如，当荧光寿命为4纳秒的荧光染料与150kDa的IgG抗体结合并用作荧光标记物质时，所述荧光标记物质已经具有0.37的荧光偏振，并且即使当荧光标记物质与高分子量的目标物质结合时，荧光偏振也几乎保持不变。在日本专利号3255293的一个实施例中，高分子量物质如C反应蛋白(CRP；分子量为120,000)，高密度脂蛋白(HDL；分子量约为400,000)和低密度脂蛋白(LDL；分子量为300万)是通过使用长寿命染料(例如用于抗体的芘衍生物)单独降低荧光标记物质的荧光偏振来测量的。

另一方面，在本公开中，不管目标物质的分子量如何都可以使用荧光寿命为4至3000纳秒的荧光染料。然而，可以根据测量条件，例如目标物质的分子量和激发波长，以及用于测量的样品的自发荧光，在上述荧光寿命范围内适当选择荧光染料。例如，当目标物质的质量约为15,000至2×10⁵Da时，可使用荧光寿命约为4纳秒的常规荧光染料，而当目标物质的质量约为2×10⁵至2×10⁸Da时，可使用荧光寿命约为100纳秒的荧光染料。如稍后将在实施例中描述的，在本公开中，具有大约150kDa的高分子量的目标物质可以通过使用具有短荧光寿命的荧光染料来定量，例如Alexa Fluor 488。此外，定量下限计算为0.45nM(纳摩尔/L)，允许在低浓度下检测。因此，虽然不清楚为什么可以使用高度通用的荧光染料(如Alexa Fluor 488)来测量高度灵敏和高分子量的目标物质，但是推测荧光偏振的灵敏度由于多种因素的协同作用而增加，例如具有低分子量的单结构域抗体，以及能够在抗原识别区附近结合从而减少荧光标记物质和目标物质之间结合的波动的荧光染料。

荧光标记物质可以通过用荧光染料与单结构域抗体反应并对其标记来制备。通常，在荧光染料中引入诸如氨基、羧基、卤素或硝基的官能团。由于单结构域抗体是多肽，单结构域抗体和荧光染料之间的反应可以根据本领域技术人员熟知的条件进行。例如，当荧光染料的官能团被激活并与单结构域抗体混合并在4至65℃的温度范围内反应数小时时，可以形成共价键。未反应的荧光染料可以在反应完成后通过常规方法纯化。由于单结构域抗体具有优异的耐热性，所以单结构域抗体甚至可以在高温下反应，这允许在各种反应条件下制备荧光标记物质。注意，如果通过遗传工程产生单结构域抗体，则可以在期望结合荧光染料的位置引入能够与荧光染料反应的具有氨基、羧基、巯基等的氨基酸残基，使得具有对应于氨基酸残基的官能团的荧光染料可以与氨基酸残基反应。以这种方式，荧光染料可以结合到可变区、N端、C端以及衍生自精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸的-NH₂基团、衍生自半胱氨酸的-SH基团或单结构域抗体的其他任意位置的附近。注意，单结构域抗体和荧光染料可以通过任意接头相互结合。

可以任意选择对于一个单结构域抗体分子的荧光染料分子结合数。每个单结构域抗体分子优选结合一个或多个荧光染料分子，并且每个单结构域抗体分子更优选结合两个至五个荧光染料分子。单结构域抗体的平均质量为12至15kDa，结合五个或更多分子可能会损害与目标物质的结合特性。

可以通过本公开测量的目标物质不受特别限制，只要能够制备能够与作为表位的目标物质的至少一部分反应的单结构域抗体。例如，优选的质量是1.5×10³至1×10⁸Da，更优选1×10⁵至1×10⁸Da。就尺寸而言，茎直径优选为1nm至10μm，更优选为3nm至10μm。测量可以在这些范围内进行。此外，当目标物质根据它们的来源和特征分类时，可以测量生物物质、药物、病毒、细菌等。所述生物物质包括生物体内部产生的各种成分、生物体排泄的各种成分以及生物体本身，其中生物体包括植物和动物。此外，药物不限于对人和动物施用的药物，并且包括农用化学品等。

所述生物物质包括：激素，其是由下丘脑、垂体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、胰腺和性腺等内分泌器官合成和分泌的生理活性物质；代谢物，如核酸、尿酸、嘌呤、C反应蛋白(CRP)、载脂蛋白、HDL、LDL和糖化血红蛋白；贝类和细菌毒素，如霉菌毒素、黄曲霉毒素B1和肉毒杆菌毒素A；植物来源的生物碱，如吗啡、阿托品、奎宁和可卡因；细菌，如大肠杆菌、链球菌、芽孢杆菌、沙门氏菌和绿脓杆菌。此外，所述药物包括抗生素(如氯霉素和环孢菌素)，以及用于提高农业效率的农用化学品(如杀菌剂、杀真菌剂、杀虫剂、除草剂、灭鼠剂和植物生长调节剂)。病毒是一种微小的传染性结构，它利用其他生物的细胞复制自己。可测量的病毒包括流感病毒、冠状病毒、乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和AIDS病毒。

根据本公开所述的荧光偏振免疫分析测量目标物质所结合的荧光标记物质的荧光偏振。根据样品中所含目标物质的特性，用纯水或其他稀释溶液适当稀释样品，如果需要，除去杂质以制备样品溶液。该样品溶液与荧光标记物质混合，从而将目标物质结合到荧光标记物质上。然后，测量目标物质和荧光标记物质的缀合物的荧光偏振。任何偏振测量装置都可以用来测量荧光偏振。测量可以在目标物质未变性的温度范围内进行，即在4至40℃的温度范围内，优选在上述范围内的恒定温度下进行。目标物质的定量可以通过通过以下进行：使用包含已知浓度的目标物质的溶液，以与上述相同的方式预先通过操作来预先准备校准曲线，并且将校准曲线与样品溶液的测量值进行比较。

这同样适用于分析作为目标物质的微生物，例如细菌。预先制备特异性结合细菌的任何部分作为表位的单结构域抗体，并制备其中结合了该单结构域抗体和荧光染料的荧光标记物质。将荧光标记物质添加到样品溶液中，以将样品溶液中包含的细菌结合到荧光标记物质上。然后，可以测量细菌所结合的荧光标记物质的荧光偏振的变化。细菌的量可以通过使用预先制备的校准曲线来定量，该校准曲线使用含有已知浓度的目标物质的溶液，并将校准曲线与样品溶液的测量值进行比较。这同样适用于测量病毒而不是细菌。

在本公开中，只要可以测量荧光偏振，对设备没有限制。另一方面，通过使用包括微通道的测量装置，可以用痕量样品进行高灵敏度的测量。荧光偏振测量方法中使用的微通道必须由不影响荧光偏振的材料制成，因此，经常使用PDMS。然而，发现当使用通过将Fab抗体结合到荧光染料而形成的荧光标记物质时，荧光标记物质和目标物质的缀合物附着到PDMS。相反，当使用通过单结构域抗体与荧光染料反应形成的荧光标记物质时，荧光标记物质和目标物质的缀合物不会附着到由PDMS形成的微通道上，这使得能够进行快速和准确的测量。虽然单结构域抗体的可变区数目是1，但是Fab抗体包含4个可变区，相应地Fab抗体的体积是3-4倍。据推测，这种体积和结构上的差异导致对PDMS的附着能力的差异。

具有这种微通道的荧光偏振测量装置的一个实例是实施例4中使用的荧光偏振测量装置，这将在后面描述。尽管通过向微通道提供荧光标记物质、样品、已经结合了目标物质的荧光标记物质等来测量荧光偏振，但是优选使用微流体通道来形成样品照明部分，其中当用激发光照射时，至少荧光标记物质发射荧光来测量荧光偏振。利用该微通道，可以在测量荧光偏振的光学观察部分的有效视场中形成多个通道，并且可以同时测量多个样品并进行图像分析。例如，即使当光学观察部分的有效视场约为时，也可以通过将每个通道间距设置为约300μm形成九个通道。通道宽度和通道间间隔可以根据该通道场地任意设置。例如，如果通道宽度和通道间间隔相等，则通道宽度可以设置为150μm，通道间间隔可以设置为150μm。由于测量灵敏度随着通道深度越深而增加，所以通道深度可以设置为900μm等。注意，为了增加测量灵敏度，可以将微通道构成材料加黑。前面提到的只是一个实例。就可制造性而言，通道深度和通道宽度尺寸之间存在密切关系，因此，例如，当通道深度为300μm时，通道宽度可以为200μm或更大。当通道宽度增加时，无论光学系统的配置如何，光提取效率都提高，这提高了测量均匀性。

根据本公开的荧光偏振测量方法，无论是否使用微通道，样品中包含的目标物质的浓度在100pM(pmol/L)至10μM(微摩尔/L)，更优选在1至1000nM(纳摩尔/L)的范围内测量。此外，根据本公开的荧光偏振测量方法，可以定量质量为1.5×10³至1×10⁸Da、更优选1×10⁵至1×10⁸Da的目标物质的浓度。具体地，在目标物质的质量约为150kDa的情况下，浓度可以在0.4至10,000nM(纳摩尔/L)的范围内测量。此外，如稍后描述的实例中所示，通过使用荧光标记物质，其中用荧光寿命为1至10纳秒的荧光染料标记单结构域抗体，即使当要定量诸如IgG的高分子量目标物质时，也可以较使用Fab抗体的情况扩大荧光偏振的波动范围。

本公开的第二个实施方案是荧光标记物质，其中荧光染料与单结构域抗体结合。如上所述，单结构域抗体是指由一个可变区组成的抗体。VHH抗体和vNAR抗体可以用作单结构域抗体。可以分解常规已知的Fab抗体或单链抗体以提取一个可以用作单结构域抗体的可变区。此外，单结构域抗体可以是通过参考常规已知的VHH抗体和vNAR抗体的DNA序列或通过使用抗体文库等由遗传工程产生的抗体。

荧光染料是一种发出荧光的染料。荧光染料优选具有能够结合羧基、氨基、羟基、硫醇基、苯基等的官能团。这是因为单结构域抗体通常具有羧基、氨基、羟基、硫醇基或苯基，并且如果荧光染料具有能够结合任何基团的官能团，则容易形成荧光标记物质。

另外，每种荧光染料都有自己的荧光寿命。在本公开中，可以根据荧光标记物质的使用目的，在荧光寿命为1至10纳秒的荧光染料、荧光寿命大于10至200纳秒的荧光染料和荧光寿命大于200至3000纳秒的荧光染料中适当选择和使用荧光染料。

荧光寿命为1至10纳秒的荧光染料的实例包括吲哚醌、荧光素化合物(如氯三嗪基氨基荧光素)、4’-氨基甲基荧光素、5-氨基甲基荧光素、6-氨基甲基荧光素、6-羧基荧光素、5-羧基荧光素、5-和6-氨基荧光素、硫脲荧光素和甲氧基三嗪基氨基荧光素、罗丹明衍生物(如罗丹明B、罗丹明6G和罗丹明6GP)；以及，作为注册商标或产品名称的Alexa Fluor系列(例如Alexa Fluor 488、BODIPY系列、DY系列、ATTO系列、Dy Light系列、Oyster系列、HiLyte Fluor系列、Pacific Blue、Marina Blue、Acridine、Edans、Coumarin、DANSYL、FAN、Oregon Green、罗丹明绿-X、NBD-X、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、R6G、Cy3、TAMRA、罗丹明红-X、雷德蒙红、ROX、Cal Red、Texas Red、LC Red 640、Cy5、Cy5.5和LC Red 705。

荧光寿命大于10至200纳秒的荧光染料的实例包括萘衍生物(如二烷基氨基萘磺酰基)和芘衍生物(如N-(1-芘基)马来酰亚胺、氨基芘、芘丁酸和炔基芘)。

荧光寿命大于200至3000纳秒的荧光染料的实例包括金属络合物，例如铂、铼、钌、锇和铕。

本公开的荧光标记物质可以是荧光寿命为1至10纳秒的荧光染料结合到单结构域抗体上的荧光标记物质、荧光寿命大于10至200纳秒的荧光染料结合到单结构域抗体上的荧光标记物质、或者荧光寿命大于200至3000纳秒的荧光染料结合到单结构域抗体上的荧光标记物质。使用这些荧光标记物质，可以通过荧光偏振免疫分析来测量质量在1.5×10³至1×10⁸Da，更优选1×10⁵至1×10⁸Da范围内的目标物质的浓度。

荧光染料和单结构域抗体之间的结合优选为共价键。可以通过荧光染料的上述官能团与单结构域抗体在本领域技术人员熟知的条件下反应来产生荧光标记物质。例如，可以通过以下形成共价键：激活荧光染料的官能团，将荧光染料与单结构域抗体混合，并将混合物在4-65℃的温度范围内反应几个小时。反应完成后，通过常规方法除去未反应的荧光染料。此外，当通过基因工程生产单结构域抗体时，可以在期望结合荧光染料的位置引入能够与荧光染料反应的具有氨基、羧基、巯基等的氨基酸残基，使得具有对应于氨基酸残基的官能团的荧光染料可以与氨基酸残基反应。以这种方式，荧光染料可以结合到可变区、N端、C端以及衍生自其他单结构域抗体的精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸的-NH₂基团、衍生自半胱氨酸的-SH基团和其他任意位置的附近。此外，单结构域抗体和荧光染料可以通过接头相互结合。这种接头的实例包括低聚乙二醇和烷基链。如后述的实例所示，荧光染料结合于与单结构域抗体的可变区附近相对应的N端的荧光标记物质的荧光偏振敏感性优异。

本公开的荧光标记物质可用于荧光偏振免疫分析、夹心免疫分析和免疫染色。

所述单结构域抗体具有比Fab抗体和scFv抗体更低的分子量，它们被称为低分子量抗体，即使在变性剂(如盐酸胍或尿素)的溶液中或在变性条件(如高温或高压)下，也容易重新回到天然结构，并且具有优异的耐热性、耐压性和耐化学性。特别地，这种单结构域抗体具有优异的耐热性，其中当从90℃的高温条件返回到室温时，单结构域抗体表现出与加热前相同的抗原结合活性。单结构域抗体耐受温度变化等，这有利于分配、储存等。此外，由于单结构域抗体在水性溶剂中具有高溶解性，并且对表面活性剂的稳定性优异，所以当通过遗传工程制备能够特异性结合目标物质的单结构域抗体时，单结构域抗体在可操作性上也优异。此外，当单结构域抗体用于荧光偏振免疫分析时，可以使用荧光寿命为1至10纳秒的高度通用的荧光染料来测量高分子量目标物质，并且甚至可以在低浓度下测量样品，这在例如减少样品的量方面是有优势的。

实施例

下面将参考实施例描述本公开。然而，这些示例并不旨在以任何方式限制本公开。

(实施例1)

(1)为了定量兔IgG，兔IgG(Sigma-Aldrich Co.LLC制造)溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)中，制备9级兔IgG溶液，3,230nM(纳摩尔/L)、1,080nM、360nM、120nM、40nM、13nM、4.4nM、1.5nM和0.49nM。

(2)抗兔IgG羊驼单抗，重组VHH Alexa Fluor 488修饰的(VHH)(由ChromoTekGmbH制造，质量15kDa)用作荧光标记物质，其中用荧光染料标记对目标物质(兔IgG)具有结合能力的单结构域抗体。荧光标记物质用PBS稀释100倍以制备荧光标记物质溶液。

(3)用PBS将胎牛血清(FBS)(Biowest制造)稀释10倍，得到FBS溶液。

(4)将荧光标记物溶液16μL(含5μg/mL VHH)、60μL FBS溶液、60μL 9级兔IgG溶液和464μL PBS混合，制备9种600μL样品，用于建立标准曲线。通过这种制备，抗体浓度变为10nM(纳摩尔/L)。制备样品后，在室温下在黑暗中放置2小时后测量每个样品的荧光偏振。

(5)作为荧光偏振测量装置，使用荧光分光光度计F7100(日立高科技公司制造)以荧光偏振模式进行测量。激发波长设定为490nm；检测波长，510-540nm；扫描速度，60nm/分钟；初始等待时间，0s；荧光侧狭缝，10nm；激发侧狭缝，10nm；响应时间是0.002秒。将用于制备标准曲线的含有0.049nM(纳摩尔/L)兔IgG的150μL的样品放入孔中，并测量G值。将用于制备标准曲线的样品置于石英池中，并测量荧光偏振。所有数据测量3次。VHH抗体(15kDa)结果如图2所示。

(对比例1)

以与实施例1相同的方式进行操作，不同之处在于使用抗兔IgG Alexa标记的Fab片段(Fab)(由Jackson ImmunoResearch Inc.制造，质量50kDa)代替抗兔IgG羊驼单抗，重组VHH Alexa Fluor 488修饰的(VHH)。Fab抗体(50kDa)结果如图2所示。

如图2所示，使用Fab抗体的对比例1的荧光偏振在0.108至0.138的范围内波动，并且波动范围为0.03。另一方面，使用VHH抗体的实施例1的荧光偏振在0.082至0.13的范围内波动，波动范围为0.048。通过使用VHH抗体，与使用Fab抗体的情况相比，波动范围扩大了1.6倍。

此外，在表1所示的条件下，使用实施例1和对比例1的结果来创建sigmoid曲线，并且计算定量下限和定量上限。

表1

结果，使用Fab抗体的对比例1的定量下限计算为5.4nM(纳摩尔/L)，定量上限为18nM(纳摩尔/L)，而使用VHH抗体的实施例1的定量下限计算为0.45nM(纳摩尔/L)，定量上限为41nM(纳摩尔/L)。发现甚至低至0.45nM(纳摩尔/L)的浓度也是可测量的。

(实施例2)

(1)抗Her2羊驼，单克隆，重组VHH(由QVQ Holding BV制造；1毫克/毫升)用作对目标物质Her2(由R&D系统公司制造，ErbB2/Her2 Fc嵌合重组蛋白)具有结合能力的单结构域抗体。

(2)将该抗体20μL和2.75当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)水溶液(由FUJIFILM Wako Pure化学公司制造)混合，并在37℃的黑暗中放置2小时。六当量AlexaFluor 488马来酰亚胺(由Thermo Scientific Inc.制造)加入到该溶液中，混合物在室温下在黑暗中放置2小时，然后用Zeba柱(7kDa)纯化两次，产生荧光标记物质。在这种荧光标记物质中，Alexa Fluor 488与抗体的SH基结合。

(3)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(由FUJIFILM Wako Pure化学公司制造)将目标物质Her2稀释50倍。将该稀释溶液用PBS进一步连续稀释5倍，制备6种浓度水平的Her2溶液：410nM(纳摩尔/L)、82nM、16nM、3.3nM、0.66nM和0.13nM。

(4)将荧光标记物质溶液用PBS稀释至浓度为44nM(纳摩尔/L)获得的92.5μL溶液、每种浓度的Her2溶液200μL、5μL的胎牛血清(FBS)(Biowest制造)和402.5μL的PBS混合，以获得用于创建标准曲线的六种500μL样品。通过这种制备，样品中的VHH变成了8.2nM(纳摩尔/L)。此外，将80μL的荧光标记物质溶液、2μL的胎牛血清(FBS)(由Biowest制造)和161μL的PBS混合，以获得总共200μL的不含Her2的对照样品。制备每个样品后，让样品在室温下在黑暗中放置2小时，然后测量荧光偏振。

(5)荧光偏振测量装置采用Tecan Infinite 200PRO F Plex。激发波长设定为490nm，检测波长设定为510至540nm。

结果如图3所示。可以根据浓度在0.66至1.6nM(纳摩尔/L)范围内的Her2浓度来确认荧光偏振的增加。

(实施例3)

(1)抗Her2羊驼，单克隆，重组VHH(由QVQ Holding BV制造；1mg/mL)用作对目标物质Her2(由R&D Systems，Inc.制造ErbB2/Her2 Fc嵌合重组蛋白)具有结合能力的单结构域抗体。20μL的该抗体和5当量的Alexa Fluor 488SDP酯(由Thermo Scientific Inc.制造)在pH 8.5的条件下混合，混合物在室温下在黑暗中搅拌1小时。然后，使用Zeba柱(7kDa)将混合物纯化两次，以制备荧光标记物质。在这种荧光标记物质中，荧光染料Alexa Fluor488与抗体的-NH₂基团结合。

(2)除了使用上述(1)中获得的荧光标记物质之外，通过与实施例2相同的操作测量荧光偏振。结果如图4所示。当使用与Alexa Fluor 488-NH₂基团结合的VHH抗体时，可以根据浓度在0.66至8.2nM(纳摩尔/L)范围内的Her2浓度确认荧光偏振的增加。此外，荧光偏振在0.158和0.187之间波动，并且可以确认，与实施例2(其中Alexa Fluor 488与单结构域抗体的-SH基团结合)相比，荧光偏振根据浓度更敏感和波动。

(实施例4)

(1)对兔IgG进行定量，兔IgG(由Sigma-Aldrich Co.LLC制造)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)用于制备1,080nM(纳摩尔/L)、360nM、120nM、40nM、13nM、4.4nM和0.15nM的7级兔IgG溶液。

(2)抗兔IgG羊驼单抗，重组VHH Alexa Fluor 488修饰的(VHH)(由ChromoTekGmbH制造，质量15kDa)用作荧光标记物质，其中用荧光染料标记对目标物质(兔IgG)具有结合能力的单结构域抗体。荧光标记物质用PBS稀释100倍以制备荧光标记物质溶液。

(3)牛血清白蛋白(BSA)(由Abcam公司制造)溶解在PBS中，得到1％BSA溶液。

(4)用PBS将胎牛血清(FBS)(Biowest制造)稀释10倍，得到FBS溶液。

(5)将荧光标记物溶液8μL(含5μg/mL的VHH)、30μL BSA溶液、30μL各浓度兔IgG溶液和232μL的PBS混合，得到7级300μL样品，用于制备标准曲线。

(6)另外，分别制备30μL的分别含13nM和120nM兔IgG的兔IgG溶液，将8μL荧光标记物溶液(含10nM VHH)、30μL FBS溶液、30μL兔IgG溶液和232μL PBS混合，制备测量样品。

(7)使用具有九个微通道的荧光偏振测量装置，用470±5nm的激发波长和520±5nm的检测波长测量用于制备标准曲线的样品和用于测量的样品的荧光偏振。注意，在九个微通道中，七个微通道被注射了七级样品用于产生上述(4)中描述的标准曲线，剩余的两个微通道被注射了用于测量上述(5)中描述的两级的样品，并且所有的样品被同时测量。图5示出了所使用的荧光偏振测量设备的示意性配置。装置10主要包括LED光源1、激发滤光器2、荧光滤光器3、二向色滤光器4、物镜5、成像透镜6、液晶元件7、数字成像装置(CMOS或CCD照相机)8和样品照明部分9。来自中心波长为470nm的LED光源1的激发光经由激发滤光器2和物镜5照射到样品照明部分9中的样品，并且样品发射的荧光透射通过二向色滤光器4和荧光滤光器3，然后，透射光由CMOS照相机8获取。当向布置在荧光滤光器3和成像透镜6之间的液晶元件7施加电压并进行调制时，可以调制透射荧光的偏振方向。在CMOS照相机8处的调制频率和捕获频率被同步以获取和计算图像，并且偏振度P被计算为二维图像。该装置10的样品照明部分9的光学观察部分的有效视野约为九个通道用于同时测量标准曲线样品和测量样品。如图6所示，通道宽度11和通道间距12在图示为圆形的的有效视野内等距隔开，通道宽度为150μm，通道间距为150μm。注意，通道深度为900μm。通过在样品照明部分9中形成多个微通道，可以同时测量多个样品。图7示出了实施例4中使用的微通道的测量荧光偏振的图像。

(8)结果如图8所示。在图8中，黑色圆圈代表标准曲线，黑色方块是含有1.3nM(纳摩尔/L)和12nM(纳摩尔/L)IgG的样品的测量结果。使用VHH抗体，即使使用配备有微通道的测量仪器也可以进行测量。

(实施例5)

(1)为了定量兔IgG，兔IgG(Sigma-Aldrich Co.LLC制造)溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)中以制备9级兔IgG溶液，3,280nM(纳摩尔/L)、1,080nM、360nM、120nM、40nM、13nM、4.4nM、1.5nM和0.49nM。

(2)抗兔IgG羊驼单抗，重组VHH Alexa Fluor 488修饰的(VHH)(Chromotek GmbH，质量15kDa)用作荧光标记物质，其中用荧光染料标记对目标物质(兔IgG)具有结合能力的单结构域抗体，荧光标记物质用PBS稀释1000倍以制备荧光标记物质溶液。

(3)将荧光标记物溶液2.7μL(含0.5μg/mL的VHH)、各浓度的兔IgG溶液10μL和87.3μL的PBS混合，得到9级100μL样品，用于制备标准曲线。

(4)使用荧光偏振测量装置测量用于产生标准曲线的样品的荧光偏振，该荧光偏振测量装置具有9个微通道，激发波长为470±5nm，检测波长为520±5nm。注意，九个微通道被注入九级样品，用于产生上述(4)中所述的标准曲线，并同时进行测量。使用的荧光偏振测量装置与实施例4中的相同。图9示出了实施例5的测量结果。

(对比例2)

以与实施例5相同的方式进行操作，不同之处在于使用抗兔IgG Alexa标记的Fab片段(Fab)(由Jackson ImmunoResearch Inc.制造，质量50kDa)代替抗兔IgG羊驼单抗，重组VHH Alexa Fluor 488修饰的(VHH)。图10示出了对比例2的测量结果。

(结果)

实施例5的结果如图9所示，具有微通道的测量装置能够使用VHH抗体容易地定量IgG的量。另一方面，如图10所示，当Fab抗体与具有微通道的测量装置一起使用时，没有观察到如实施例1中观察到的根据浓度的荧光偏振的增加，并且难以定量IgG的量。这被认为是因为Fab抗体具有比VHH抗体更大的分子量，并且容易吸附在微通道的壁表面上。如同Fab抗体，当抗体被吸附时，抗体分子的旋转扩散被抑制，因此，即使抗体没有与抗原反应，抗体也表现出高荧光偏振值。因此，认为具有微通道的测量装置不能获得如实施例1中根据抗原浓度增加荧光偏振值的结果，并且抗原的测量变得困难。另一方面，如同VHH抗体，当抗体几乎不吸附在通道上时，即使使用具有微通道的测量装置，荧光偏振值也随着抗原浓度的增加而增加，这使得能够如实施例1中那样以高测量灵敏度进行测量。

出于解释的目的，前面描述了一些示例实施方案。尽管前面的讨论已经给出了具体的实施方案，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的更广泛的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行改变。因此，说明书和附图被认为是说明性的，而不是限制性的。因此，该详细描述不应被认为是限制性的，并且本发明的范围仅由所包括的权利要求以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围来限定。