具体实施方式

本文描述了本公开内容的实施方案。但是，应当理解，公开的实施方案仅仅是实施例，且其它实施方案可以呈各种和替代形式。附图不一定按比例；一些特征可以放大或缩小以显示部件的细节。因此，本文中公开的具体结构和功能细节不应解释为限制性的，而仅仅作为教导本领域技术人员不同地采用实施方案的代表性基础。本领域普通技术人员会理解，参考任一个附图解释和描述的各种特征可以与在一个或多个其它附图中解释的特征组合，以产生没有明确地解释或描述的实施方案。解释的特征的组合为典型应用提供了代表性实施方案。但是，与本公开内容的教导一致的特征的各种组合和修饰对于应用或实现而言可能是期望的。

本公开内容不限于下面描述的具体实施方案和方法，因为具体组分和/或条件当然可以变化。此外，本文使用的术语仅仅用于描述本公开内容的实施方案的目的，且无意以任何方式限制。

如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示对象，除非上下文另外清楚地指出。例如，对单数形式的一种组分的提及意图包括多种组分。

适合用于与一个或多个实施方案有关的给定目的的一组或一类材料的描述暗示，该组或类中的任意两个或更多个成员的混合物是合适的。在化学术语中组分的描述表示向说明书中指定的任意组合添加时的组分，且不一定排除一旦混合后混合物的组分之间的化学相互作用。

除了明确地指出的情况以外，在本说明书中指示尺寸或材料性能的所有数字量应理解为在描述本公开内容的最宽范围时被词语“约”修饰。

首字母简略词或其它缩写的首次定义适用于相同缩写在本文中的所有随后应用，并在细节上做必要的修正后适用于最初定义的缩写的正常语法变体。除非明确地做出相反说明，否则性质的测量取决于在前面或在以后关于相同性质提及的相同技术。

详细参考发明人已知的实施方案的组合物、实施方案和方法。公开的实施方案仅仅是本公开内容的示例，其可以以各种和替代形式体现。因此，本文中公开的具体细节不应解释为限制性的，而仅仅作为教导本领域技术人员不同地采用本公开内容的代表性基础。

生物治疗剂，诸如蛋白和单克隆抗体(mAb)，在药物市场上快速增长。目前，超过250种被批准的生物治疗剂在市场上，且超过500种在开发中。与相对小的分子药物相比，生物治疗剂具有易于免疫应答的风险。例如，不希望的免疫原性可能导致抗药物抗体(ADA)的产生，其可以负面地影响循环中的药物水平和药物效力。在某些情况下，免疫应答可能是严重的和危及生命的。因此，为了评估对生物治疗剂的免疫应答的风险，药代动力学(PK)和药效动力学(PD)表征在临床前开发阶段和临床试验中是必要的。

为了表征生物治疗剂的PK和/或PD特性，重要的是，准确地测量水性环境中的ADA、药物或二者的浓度。但是，水性环境中的高药物水平可以不利地干扰ADA的检测，特别是在桥连测定形式中。例如，在免疫原性测定中，ADA可以与样品溶液中的药物形成复合物，由此阻止ADA、药物或二者的浓度的准确定量。这样的问题在多剂量研究中可能是更常见的，其中药物浓度在长研究阶段中保持高。

为了克服该问题，已经开发了药物耐受测定。药物耐受测定通过采用酸处理步骤可以在药物存在下测量ADA的浓度。酸处理步骤可以分解ADA-药物复合物并将ADA和药物释放至样品溶液中。药物耐受测定的一些实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、亲和力捕获洗脱ELISA (ACE)、具有酸解离的生物素-药物提取(BEAD)测定、样品预处理桥连ELISA、酸解离放射免疫测定、同质泳动率变动测定(HMSA)和沉淀和酸解离方法。

除了ADA以外，可溶性的药物靶标也可能为免疫测定带来挑战。当药物与药物靶标之比低时，药物的非常少的结合位点可用于接合在免疫测定中被固定的药物靶标。但是，当药物与药物靶标之比高时，可观察到反作用(即药物靶标的非常少的结合位点可用于结合药物)。因此，在免疫测定中不同的药物与药物靶标之比也可能对测量生物治疗剂的PK和/或PD特性的准确度具有影响。

为了解决该问题，已经在执行免疫测定中采用酸处理步骤。酸处理步骤可以通过调节样品溶液的pH来进行，由此使药物从药物靶标解离并使药物靶标上的药物结合表位变性。然后可以将样品溶液中和并准备好以ELISA形式进行分析。该方法已经用于在血管生成素-2 (Ang2)存在下检测免疫球蛋白G1 (IgG1) mAb。

类似地，可以对样品进行温和酸处理，随后使用夹心ELISA在样品上直接分析。该方法不会使药物靶标上的药物结合表位变性，但是它利用捕获抗体在特定pH值结合药物的能力，其中药物和药物靶标保持解离(即药物未结合至药物靶标)。该方法已经用于在可溶性循环靶标存在下检测免疫球蛋白G4 (IgG4)。

进一步，在酸性pH值下进行的改进测定已经用于检测在人血浆和血清中的白介素13 (IL-13)。具体地，在酸性pH值的样品的温育可以减少来自IL-13结合蛋白的非特异性结合和干扰。已知在血液和血清中具有可溶性结合配偶体的生物标志物的实例是，但不限于，白介素1 (IL-1)、白介素18 (IL-18)、胰岛素样生长因子1 (IGF-1)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和睾酮。

为了执行桥连ELISA方案，可以将样品溶液在乙酸中稀释，并然后温育1小时。此后，可以将溶液与碱性缓冲液(例如Tris pH 9.5)混合，并然后加入含有表面结合的捕获分子(例如抗原)的测定板中。然后可以将溶液温育另外1-5小时，随后进行洗涤和信号放大步骤(例如使用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。

考虑到前述内容，手工地进行在每种方法中引入的酸处理步骤。手工操作会不可避免地引入人为失误，从而造成测定的低再现性。因此，需要以更有效和准确的方式检测免疫测定中被分析物，诸如ADA的量。

不同于手工调节样品溶液的pH，可以自动地调节样品溶液的pH。在美国专利申请系列号14/792,569和13/543,300 (其特此通过引用整体并入)中已经公开了电化学地调节样品溶液的pH，特别是改变在电极表面附近的样品溶液的pH的方法。通常，电化学地调节pH可以给执行测定提供优点，包括减少手工步骤和试剂的数目、缩短测定时间、允许多路处理、和提高测量准确度。用于电化学地调节样品溶液的pH的系统可以包括工作电极和对电极。所述系统还可以包括电化学活性剂，诸如醌，其可以加入样品溶液中。所述电化学活性剂在电流的影响下可以经历电化学氧化还原反应(即氧化或还原)。电化学活性剂的电化学氧化还原反应可以产生或消耗氢(H⁺)离子，从而造成样品溶液中的pH变化。通过控制施加于工作电极的电流，仅在工作电极的表面附近的样品溶液可以经历pH变化，而不在工作电极的表面附近的样品溶液的其它区域的pH可能不受影响。另外，所述系统还可以包括参比电极和感测电极。感测电极可以实时主动测量样品溶液的pH。从感测电极产生的信号可以传递至电子设备并送入闭环算法，所述闭环算法可以用于控制施加于工作电极并被构造成改变或维持样品溶液中的pH的电流。这样的pH调节的自动方法可以用于分析免疫测定和可能涉及具有可溶性结合配偶体的生物标志物的其它生物测定。

本公开内容的方面涉及使用电化学pH调节技术的用于检测溶液中被分析物的量的方法。所述溶液可以包含被分析物的可溶性结合配偶体，其可以结合至溶液中的被分析物以形成复合物。所述可溶性结合配偶体可以是溶液中的药物。所述溶液还可以包含用于检测溶液中被分析物的量的检测探针，其被构造成结合至溶液中的被分析物。每个检测探针可以包含与其连接的信号传递标签。在一个实施方案中，本公开内容的方面包括酸预处理步骤，其中被分析物，诸如抗药物抗体(ADA)可以从它们的结合配偶体解离，随后结合至捕获分子并结合至用于检测溶液中被分析物的量的检测探针。在另一个实施方案中，本公开内容的方面包括酸预处理步骤，其中被分析物，诸如ADA可以从它们的结合配偶体解离，随后电化学地调节(例如中和)溶液的pH，以允许被分析物结合至捕获分子并结合至用于检测溶液中被分析物的量的检测探针。在另一个实施方案中，本公开内容的方面利用用于检测溶液中被分析物，诸如ADA的量的检测探针，其具有与其连接的pH依赖性的信号传递标签，其中pH依赖性的信号传递标签当溶液是在第一pH值时可以产生第一信号，且当溶液是在不同于第一pH值的第二pH值时可以产生第二信号。

图1描绘了用于检测测定中被分析物的量的方法的示意图。所述测定可以是桥连ELISA测定。所述被分析物可以是ADA。如在图1中所示，捕获分子10经由接头14连接至固体基质12 (例如电极)。被分析物16可以结合至捕获分子10。检测探针18可以存在于测定中且可以包括与其连接的信号传递标签20。如在图1中所示，检测探针18可以结合至被分析物16，且信号传递标签20可以产生信号。此后，基于所述信号可以计算测定中被分析物16的量。

接头14被构造成使捕获分子10固定和保持其功能性。具体地，接头14可以是被构造成通过吸附来使捕获分子固定的聚合物材料。聚合物材料可以是，但不限于，聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚丙烯、环烯烃共聚物、琼脂糖、葡聚糖或硝酸纤维素。接头也可以是被构造成通过亲和力来使捕获分子固定的肽序列或蛋白。肽序列或蛋白可以是，但不限于，抗生蛋白链菌素、蛋白A或蛋白G、适体或聚组氨酸标签(His-标签)。另外，接头可以是被构造成通过杂交来使捕获分子固定的多核酸。此外，接头可以是通过共价键合来使捕获分子固定的有机分子。有机分子可以是，但不限于，马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、(三氟甲基)苯基二氮杂环丙烷、胺、酰肼、硼酸、碘代乙酰基、环氧化物、硫醇、叠氮化物或炔烃。

信号传递标签20可以是pH依赖性的或pH独立性的。基本上，pH依赖性的信号传递标签可以根据溶液的pH而改变其行为。例如，pH依赖性的信号传递标签可以在第一pH值产生第一信号且可以在第二pH值产生第二信号，其中第一pH值和第二pH值是不同的。相反，pH独立性的信号传递标签不可以根据溶液的pH而改变其行为，而是当它存在于溶液中时产生信号。

关于组成，信号传递标签20可以是荧光标签、荧光染料、荧光蛋白、电致发光的染料、化学发光的染料或酶。

具体地，荧光标签可以是pH依赖性的或pH独立性的，其可以是，但不限于，有机染料、量子点、镧系元素离子或蛋白。荧光染料可以是，但不限于，荧光素、香豆素、罗丹明、花青或其衍生物。常用荧光染料的实例包括异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)、Alexa Fluor、Cy-3、Cy-5和ATTO染料。pH依赖性的荧光染料的实例可以包括，但不限于，pHrodo、Protonex、俄勒冈绿、LysoSensor绿、pHAb、荧光素、FAM、罗丹明B衍生物和SNARF。另外，荧光蛋白可以是pH依赖性的或pH独立性的，其可以是，但不限于，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或蓝绿色荧光蛋白。此外，电致发光的染料可以是fluolid染料，诸如Fluolid绿、Fluolid橙和Fluolid红。化学发光的染料可以是，但不限于，鲁米诺、萤光素或呫吨染料。pH依赖性的酶的实例包括辣根过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶和碱性磷酸酶。

参考图1，由信号传递标签20产生的信号可以是光信号、电子信号或化学信号。具体地，光信号可以是，但不限于，荧光、比色法、浊度测定法、化学发光或电致发光的形式。此外，化学信号可以是，但不限于，辐射或pH变化的形式。

图2描绘了解释被分析物的可溶性结合配偶体的存在对测定中被分析物的量的检测的干扰的示意图。所述测定可以是桥连ELISA测定。所述被分析物可以是ADA。所述可溶性结合配偶体可以是测定中的药物。如在图2中所示，测定中的结合配偶体30可以结合至被分析物32，由此形成复合物，其可以阻止被分析物32结合至捕获分子34或甚至结合至检测探针36。复合物的形成因而可以影响测定中被分析物的量的检测的准确度。

图3描绘了解释酸预处理步骤以使被分析物从测定中被分析物的可溶性结合配偶体解离的示意图。所述测定可以是桥连ELISA测定。所述被分析物可以是ADA。所述可溶性结合配偶体可以是测定中的药物。如在图2中所述，可溶性结合配偶体可以结合至被分析物，由此在测定中形成复合物。类似地，如在图3中所示，当测定中溶液的pH为7时，发生这样的复合物的形成，其中可溶性结合配偶体52结合至被分析物50。为了使被分析物50从结合的结合配偶体52解离，可以将电化学活性剂，诸如氢醌(HQ) 54加入溶液中。电化学活性剂可以通过电化学氧化还原反应(即氧化或还原)在溶液中产生或消耗氢(H⁺)离子，这相应地改变溶液的pH。

参考图3，溶液可以包含HQ 54和苯醌(BQ) (未显示)。控制施加于与溶液接触的电极的电流，可以诱导HQ 54的氧化反应或BQ的还原反应，从而分别在溶液中产生H⁺离子或消耗H⁺离子。

图3解释了这样的情形：其中HQ 54在施加于电极56的电流(I)的影响下被氧化，从而在溶液中产生BQ和H⁺离子。

HQ → BQ + 2H⁺ + 2e^- (1)

HQ的氧化反应因而可以使溶液的pH，特别是靠近电极56的溶液中的区域的pH，从pH 7改变至pH 4。温育在pH 4的溶液可以允许被分析物50从结合配偶体52解离。

其它电化学活性剂也可以用于电化学地调节溶液的pH，诸如醌、儿茶酚、氨基酚、肼、萘醌、其衍生物或它们的组合。每种电化学活性剂可以在电流的影响下经历电化学氧化还原反应(即氧化或还原)，这可以在溶液中产生或消耗H⁺离子以调节溶液的pH。

图4描绘了解释用于检测测定中被分析物的量的第一方法实施方案的示意图。所述测定可以是桥连ELISA测定。所述被分析物可以是ADA。如在图3中所述，可以进行酸预处理步骤，以通过电化学地调节溶液的pH而使被分析物从它们的结合至被分析物的可溶性结合配偶体(例如药物)解离。所述溶液可以包含HQ和BQ二者。类似地，如在图4中所示，在将电流(I)施加于与溶液接触的电极70后，电化学活性剂72诸如HQ可以被氧化。HQ的氧化在溶液中产生H⁺离子，其诱导溶液的从pH 7至pH 4的pH变化。温育在pH 4的溶液可以允许被分析物74从结合配偶体76解离并结合至捕获分子78。捕获分子78可以经由接头80连接至电极70。接头80被构造成通过吸附、亲和力、杂交或共价键合而使捕获分子78固定。

为了准确地测量测定中被分析物74的量，可以将过量的检测探针82加入在pH 4的溶液中。每个检测探针82可以具有与其连接并被构造成在pH 4产生信号的信号传递标签84。如在图4中所示，被分析物74可以在pH 4结合至检测探针82。在pH 4的结合结束后，可以进行洗涤步骤以除去溶液中任何未结合的检测探针82。所述方法然后可以测量由保留在溶液中的信号传递标签84产生的信号并基于所述信号计算测定中被分析物74的量。

图5描绘了解释用于检测测定中被分析物的量的第二方法实施方案的示意图。所述测定可以是桥连ELISA测定。所述被分析物可以是ADA。如在图3和4中所述，可以进行酸预处理步骤，以通过电化学地调节溶液的pH而使被分析物从它们的结合至被分析物的可溶性结合配偶体(例如药物)解离。所述溶液可以包含HQ和BQ二者。因此，如在图5中所示，在pH7，在将第一电流(I₁)施加于与溶液接触的电极100后，电化学活性剂102，诸如HQ，可以被氧化。HQ的氧化在溶液中产生H⁺离子，其诱导溶液的从pH 7至pH 4的pH变化。温育在pH 4的溶液可以允许被分析物104从结合配偶体106解离。

为了提供在测定中被分析物104和捕获分子108之间以及被分析物104和检测探针110之间的最佳结合，可以进一步调节溶液的pH。如在图5中所示，在将第二电流(I₂)施加于电极100后，溶液中的BQ可以被还原。BQ的还原消耗溶液中的H⁺离子，其诱导溶液的从pH 4至pH 7的pH变化。

BQ + 2H⁺ + 2e^- →HQ (2)

此后，可以将溶液转移至测定室，在此处被分析物104可以结合至捕获分子108。捕获分子108可以经由接头112连接至测定室中的固体基质110。接头112被构造成通过吸附、亲和力、杂交或共价键合而使捕获分子108固定。

为了准确地测量测定中被分析物104的量，可以将过量的检测探针114加入在pH 7的溶液中。每个检测探针114可以具有与其连接并被构造成在pH 7产生信号的信号传递标签116。如在图5中所示，被分析物104可以在pH 7结合至检测探针114。在pH 7的结合结束后，可以进行洗涤步骤以除去溶液中任何未结合的检测探针114。所述方法然后可以测量由保留在溶液中的信号传递标签116产生的信号并基于所述信号计算测定中被分析物104的量。

图6描绘了解释用于检测测定中被分析物的量的第三方法实施方案。所述测定可以是桥连ELISA测定的示意图。所述被分析物可以是ADA。所述方法可以是用于检测免疫测定中被分析物的量的一锅式免疫测定形式。如在图6中所示，测定室中的溶液的pH是7，其中被分析物130被溶液中的其结合配偶体132结合。所述结合配偶体可以是测定中的药物。在pH 7，测定室还可以包含检测探针134，其可以已经加入溶液中。每个检测探针134可以具有与其连接并被构造成产生信号的信号传递标签136。如以上所讨论的，可以进行酸预处理步骤，以通过电化学地调节溶液的pH而使被分析物从它们的结合至被分析物的可溶性结合配偶体(例如药物)解离。所述溶液可以包含HQ和BQ二者。因此，如在图6中所示，在将第一电流(I₁)施加于与溶液接触的电极138后，电化学活性剂(未显示)，诸如HQ，可以被氧化。电化学活性剂的氧化在溶液中产生H⁺离子，其将溶液的pH从pH 7调节至pH 4。温育在pH 4的溶液可以允许被分析物130从结合配偶体132解离。

为了实现在测定中的被分析物130和捕获分子140之间以及被分析物130和检测探针134之间的最佳结合，可以进一步调节溶液的pH。如在图6中所示，将第二电流(I₂)施加于电极138可以还原溶液中的另一种电化学活性剂(未显示)，诸如BQ。还原反应消耗溶液中的H⁺离子，其诱导溶液的从pH 4至pH 7的pH变化。在pH 7，被分析物130可以结合至捕获分子140。捕获分子可以经由接头142连接至电极138。接头142被构造成通过吸附、亲和力、杂交或共价键合而使捕获分子140固定。此外，被分析物130可以在pH 7的溶液中结合至检测探针134。

在一个实施方案中，信号传递标签136可以是pH独立性的，其中当溶液的pH在4或7时，信号传递标签136可以产生相同信号。在该情况下，在pH 7的结合结束后，可以进行洗涤步骤以除去溶液中任何未结合的检测探针134。所述方法然后可以测量由保留在溶液中的信号传递标签136产生的信号并基于所述信号计算测定中被分析物130的量。

在另一个实施方案中，信号传递标签136可以是pH依赖性的，其中信号传递标签136可以在pH 4产生第一信号并可以在pH 7产生第二信号，所述第二信号不同于所述第一信号。在该实施方案中，信号传递标签136产生信号的最佳pH是7。换而言之，在pH 7产生的第二信号可以比在pH 4产生的第一信号更强。在该情况下，在pH 7的结合结束后，可以进行洗涤步骤以除去溶液中任何未结合的检测探针134。所述方法然后可以测量由保留在溶液中的信号传递标签136产生的第二信号并基于所述第二信号计算测定中被分析物130的量。

图7描绘了解释用于检测测定中被分析物的量的第四方法实施方案的示意图。所述测定可以是桥连ELISA测定。所述被分析物可以是ADA。所述方法可以是用于检测免疫测定中的被分析物的量的单步骤免疫测定形式。如在图7中所示，测定室含有pH 4的溶液，其中被分析物150未被溶液中的其结合配偶体152结合。结合配偶体152可以是在测定室中的药物。测定室还可以包含检测探针154。每个检测探针154可以具有与其连接的信号传递标签156。在该方法实施方案中，信号传递标签156可以是pH依赖性的。如在图7中所示，信号传递标签156在pH 4可以不产生信号(即信号关闭)。

如以上所讨论的，在施加于与溶液接触的电极的电流的影响下，电化学活性剂可以随后以自动方式调节溶液的pH。所述溶液可以包含HQ和BQ二者。因此，参考图7，通过将第一电流(I₁)施加于与测定室中的溶液接触的电极158，可以还原第一电化学活性剂(未显示)，由此消耗溶液中的H⁺离子。在该方法实施方案中，通过控制施加于电极158的I₁，仅在电极158的表面附近的溶液可以经历pH变化，而溶液的其它区域的pH可以不变化。具体地，如在图7中所示，第一电化学活性剂的还原反应可以在电极158的表面附近，即区域I (即在调节线164下方)诱导从pH 4至pH 7的pH变化，而溶液的其它区域，即区域II (即在调节线164上方)可以保持在pH 4。因此，在区域II中，在pH 4，信号传递标签156可以仍然不产生信号(即信号关闭)。另一方面，在区域I中，在pH 7，被分析物150可以结合至捕获分子160。捕获分子160可以经由接头162连接至电极158。接头162被构造成通过吸附、亲和力、杂交或共价键合而使捕获分子160固定。另外，在区域I中，在pH 7，被分析物150可以结合至检测探针154，且连接至检测探针154的信号传递标签156可以产生第一信号。

在该方法实施方案中，被分析物150结合至捕获分子160和结合至检测探针154的最佳pH可以是7。但是，信号传递标签156产生信号的最佳pH可以是例如8。因此，如在图7中所示，为了得到由信号传递标签156产生的更强检测信号，该方法可以通过将第二电流(I₂)施加于电极158而进一步从7至8轻微调节溶液的pH。类似地，通过控制施加于电极158的I₂，仅在电极158的表面附近，即区域I的溶液可以经历pH变化，而溶液的其它区域，即区域II可以保持在pH 4。因此，在区域II中，在pH 4，信号传递标签156可以仍然不产生信号(即信号关闭)。另一方面，在区域I中，在pH 8，被分析物150可以仍然结合至捕获分子160和结合至检测探针154。另外，在区域I中，在pH 8，连接至检测探针154的信号传递标签156可以产生第二信号。由于信号传递标签156是pH依赖性的，且信号传递标签156产生信号的最佳pH是8，因此，第二信号可以比在pH 7产生的第一信号更强。这样，基于所述第二信号可以准确地计算测定室中被分析物150的量。

图8描绘了解释用于检测测定中被分析物的量的第五方法实施方案的示意图。所述测定可以是桥连ELISA测定。所述被分析物可以是ADA。所述方法可以是用于检测免疫测定中的被分析物的量的单步骤免疫测定形式。如在图8中所示，测定室中溶液的pH是7，其中被分析物170被溶液中的其结合配偶体172结合。结合配偶体172可以是在测定室中的药物。在pH 7，测定室还可以包含检测探针174。每个检测探针174可以具有与其连接的信号传递标签176。在该方法实施方案中，信号传递标签176可以是pH依赖性的。如在图8中所示，信号传递标签176在pH 7可以不产生信号(即信号关闭)。

类似于图7，在图8中，将第一电流(I₁)施加于与测定室中的溶液接触的电极178可以氧化溶液中的第一电化学活性剂(未显示)，且第一电化学活性剂的氧化反应可以诱导溶液的pH变化。另外，通过控制施加于电极178的I₁，仅在电极178的表面附近，即区域III (即在调节线184下方)的溶液可以经历从pH 7至pH 4的pH变化，而溶液中的其它区域，即区域IV (即在调节线184上方)的pH可以不变(即保持在pH 7)。因此，在区域IV中，在pH 7，被分析物170可以仍然被其结合配偶体172结合，且信号传递标签176可以仍然不产生信号。另一方面，在区域III中，被分析物170可以从其结合配偶体172解离，且信号传递标签176可以产生信号(即信号开启)。

此后，将第二电流(I₂)施加于电极178可以触发溶液中的第二电化学活性剂(未显示)经历还原反应，由此使在区域III的溶液的pH变回pH 7。在该阶段，溶液的两个区域，即区域III和区域IV都在pH 7，且被分析物170可以结合至测定室中的捕获分子180。捕获分子180可以经由接头182连接至电极178。接头182被构造成通过吸附、亲和力、杂交或共价键合而使捕获分子160固定。但是，如在图8中所示，在pH 7，信号传递标签176可以不产生信号(即信号关闭)，即使检测探针174可以结合至被分析物170。

为了确保溶液中尽可能多的被分析物170从其结合配偶体172解离，可以然后将第三电流(I₃)施加于电极178以引发溶液中的第三电化学活性剂(未显示)的氧化反应。氧化反应可以将溶液的pH降低回pH 4，特别是在电极178的表面附近的区域III中的溶液。温育在pH 4的溶液可以使更多的被分析物170从结合配偶体172解离。此后，施加第四电流(I₄)可以再次使溶液的pH变回pH 7。电化学活性剂的这样的氧化和还原反应过程可以重复几次，以使溶液中未被结合配偶体172结合的被分析物170的数目最大化，以使得被分析物170可供检测探针174检测。

参考图8，信号传递标签176是pH依赖性的，且信号传递标签176产生信号的最佳pH可以是例如5。因此，如在图8中所示，将另一个电流(I_n)施加于电极178可以进一步触发溶液中的另一种电化学活性剂经历另一种氧化反应，以使得溶液，特别是区域III的pH可以进一步从7调节至5。在pH 5，被分析物170可以仍然结合至捕获分子180和结合至检测探针174。另外，信号传递标签176可以在pH 5产生信号。这样，基于在pH 5产生的信号可以准确地计算测定室中被分析物170的量。

尽管上面描述了示例性实施方案，但是这些实施方案不意图描述权利要求涵盖的所有可能形式。在说明书中使用的词语是描述性而不是限制性的词语，且应当理解，可以在不背离本公开内容的精神和范围的情况下做出各种变化。如前面描述的，各个实施方案的特征可以组合以形成可能没有明确地描述或解释的本公开内容的其它实施方案。尽管各个实施方案已经被描述为提供优点或在一个或多个期望特性方面比其它实施方案或现有技术实施方式优选，但是本领域普通技术人员认识到，可以将一个或多个特征或特性折衷以实现期望的总系统属性，这取决于具体应用和实施方式。这些属性可以包括，但不限于成本、强度、耐久性、生命周期成本、可销售性、外观、包装、大小、适用性、重量、可制造性、组装容易性等。这样，在任何实施方案被描述为在一个或多个特性方面不如其它实施方案或现有技术实施方式合乎需要的范围内，这些实施方案不是在本公开内容的范围外，且可以对于特定应用而言是合乎需要的。