具体实施方式

下面详细地解释本发明。

<本发明的生产方法>

在本说明书中，生产方法1-3分别意味着下述生产方法。

生产方法1：包括步骤1和步骤2的化合物(3)的生产方法

生产方法2：包括步骤3和步骤4的化合物(3)的生产方法

生产方法3：包括步骤5的化合物(3)的生产方法

在本说明书中，步骤1-5分别意味着下述步骤。

步骤1：将C＝C还原酶等与化合物(1)相接触以获得化合物(2)的步骤

步骤2：将C＝O还原酶等与化合物(2)相接触氧化成化合物(3)的步骤

步骤3：将C＝O还原酶等与化合物(1)相接触以获得化合物(4)的步骤

步骤4：将C＝C还原酶等与化合物(4)相接触以获得化合物(3)的步骤

步骤5：将C＝C还原酶等和C＝O还原酶等与化合物(1)相接触以获得化合物(3)的步骤

下面详细地解释本发明。

1.在本发明的生产方法中使用的酶

[C＝C还原酶]

本发明的生产方法的特征在于将碳-碳双键还原酶(C＝C还原酶)、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液和羰基还原酶(C＝O还原酶)、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液与由式(1)表示的化合物相接触，以得到由式(3)表示的化合物。在本说明书中，所述酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液有时被称为“酶等”。所述C＝C还原酶在下文解释。

在本发明的生产方法中，对所述C＝C还原酶没有特别限制。所述C＝C还原酶也可以例如通过使用已知方法从枯草芽孢杆菌纯化和分离来获得。当在本文中使用时，纯化方法包括例如溶剂萃取、蒸馏、柱层析、液相色谱、重结晶、这些方法的组合等。

所述C＝C还原酶还可以通过培养含有编码它们的核酸的转化体，并从获得的培养物分离和纯化所述C＝C还原酶来获得。所述编码C＝C还原酶的核酸可以是DNA或RNA或DNA/RNA嵌合体。优选的是DNA。所述核酸可以是双链或单链的。当它是双链时，可以使用双链DNA、双链RNA或DNA:RNA杂交体。当它是单链时，可以使用正义链(即编码链)或反义链(即非编码链)。

编码C＝C还原酶的DNA包括例如枯草芽孢杆菌来源的yqjm基因(GeneBank登记号P54550)的碱基序列(SEQ ID NO：5)。

编码C＝C还原酶的DNA还包括合成的DNA等。例如，编码枯草芽孢杆菌来源的C＝C还原酶的DNA，可以通过转变全长C＝C还原酶cDNA来获得，所述cDNA通过反转录酶-PCR，使用源自于枯草芽孢杆菌的总RNA或mRNA级分作为模板，按照本身已知的方法例如ODA-LAPCR法、缺口双链体法、Kunkel法等或与其相似的方法，并通过使用已知的试剂盒例如Mutan^TM-super Express Km(TAKARA BIO INC.)、Mutan^TM-K(TAKARA BIO INC.)等直接扩增。或者，它可以通过按照上述方法转变通过菌落或噬菌体杂交或PCR等从cDNA文库克隆的cDNA来获得，所述cDNA文库通过将上述总RNA或mRNA片段插入到适合的载体中来制备。所述用于文库的载体可以是任何载体例如噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等。

编码C＝C还原酶的核酸(DNA)可以例如使用源自于枯草芽孢杆菌的染色体DNA作为模板和适合的引物，通过PCR来克隆。例如，通过将如上所述获得的编码C＝C还原酶的DNA以允许表达的配置插入到已知表达载体中，提供了C＝C还原酶基因表达载体。通过用所述表达载体转化宿主细胞，可以获得其中引入有编码C＝C还原酶的DNA的转化体。所述转化体也可以通过使用诸如同源重组的方法将编码C＝C还原酶的DNA以可表达的方式并入到宿主的染色体DNA中来获得。

在本说明书中，“表达载体”是用于在宿主生物体中复制并表达具有所需功能的蛋白质的遗传因子，这通过将编码所述具有所需功能的蛋白质的多核苷酸并入到所述载体中并将所述载体引入到上述宿主生物体中来实现。表达载体的实例包括但不限于质粒、病毒、噬菌体、粘粒等。优选的表达载体是质粒。

在本说明书中，“转化体”意味着通过使用上述表达载体等引入靶基因而变得能够表现出与具有所需功能的蛋白质相关的所需性质的微生物或细胞。

作为产生转化体的方法，具体来说，可以作为实例叙述的是以下方法：包括将编码C＝C还原酶的DNA引入到稳定存在于宿主细胞中的质粒载体、噬菌体载体或病毒载体中并且将构建的表达载体引入到宿主细胞中的方法，和包括将所述DNA直接引入到宿主基因组中并转录或翻译其遗传信息的方法。在这种情况下，优选地将适合的启动子连接到在所述宿主中的所述DNA的5’-侧上游，并且另外更优选的是将终止子连接到3’-侧下游。对此类启动子和终止子没有特别限制，只要它们是已知在用作宿主的细胞中起作用的启动子和终止子即可，并且可以使用例如在《微生物学基础讲义8：遗传工程》(Microbiological BasicLecture 8Genetic Engineering)(BISEIBUTSUGAKU KISO-KOHZA 8IDENSHI-KOHGAKU)，KYORITSU SHUPPAN CO.,LTD中详细描述的载体、启动子和终止子。

对作为转化的靶以表达C＝C还原酶的宿主微生物没有特别限制，只要所述宿主本身不会不利地影响化合物(1)、化合物(2)、化合物(4)或化合物(3)即可，并且可以提到例如下面示出的微生物。

具有已建立的宿主载体系统，并属于埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、短杆菌属、棒状杆菌属、链球菌属、乳杆菌属等的细菌。

具有已建立的宿主载体系统并属于红球菌属、链霉菌属等的放线菌。

具有已建立的宿主载体系统并属于酵母属、克鲁维酵母属、裂殖酵母属、接合酵母属、耶氏酵母属、毛孢子菌属、红冬孢酵母属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属等的酵母。

具有已建立的宿主载体系统并属于脉孢菌属、曲霉属、头孢霉属、木霉属等的真菌。

用于产生所述转化体的程序、适合于所述宿主的重组载体的构建以及用于培养所述宿主的方法，可以按照在分子生物学、生物技术和遗传工程领域中惯常使用的技术(例如在《分子克隆》中描述的方法)来进行。

下面给出了优选的宿主微生物、在每种微生物中优选的转化方法、载体、启动子、终止子等的具体实例，但本发明不限于这些实例。

在埃希氏杆菌属、特别是大肠埃希氏杆菌中，质粒载体的实例包括pKV32、pKW32、pBR、pUC质粒等，启动子例如源自于lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操纵子)、tac、trc(lac、trp的融合体)、λ噬菌体PL、PR等的启动子。终止子的实例包括源自于trpA、噬菌体、rrnB核糖体RNA等的终止子。

在芽孢杆菌属中，载体的实例包括基于pUB110的质粒、基于pC194的质粒等，并且所述载体也可以与染色体整合。作为启动子和终止子，可以使用酶基因例如碱性蛋白酶、蛋白酶、α-淀粉酶等的启动子和终止子等。

在假单胞菌属中，载体的实例包括在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)等中建立的通用宿主载体系统，与甲苯化合物的分解相关的质粒，基于TOL质粒的广宿主范围载体(包括源自于RSF1010等的自主复制所需的基因)pKT240(Gene,26,273-82(1983))等。

在短杆菌属、特别是乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)中，载体的实例包括质粒载体例如pAJ43(Gene 39,281(1985))等。作为启动子和终止子，可以使用用于大肠埃希氏杆菌的各种不同启动子和终止子。

在棒状杆菌属、特别是谷氨酸棒状杆菌中，载体的实例包括质粒载体，例如pCS11(JP-A-57-183799))、pCB101(Mol.Gen.Genet.196,175(1984))等。

在酵母属、特别是酿酒酵母中，载体的实例包括基于YRp、基于Yep、基于YCp、基于Yip的质粒等。此外，可以使用各种不同酶基因例如醇脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶的启动子和终止子。

在裂殖酵母属中，载体的实例包括在Mol.Cell.Biol.6,80(1986)中描述的源自于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的质粒载体等。具体来说，pAUR224可以从Takara Bio Inc.商购并且可以容易地使用。

在曲霉属中，黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等属于研究最充分的真菌，与质粒和染色体整合是可用的，并且可以使用源自于胞外蛋白酶和淀粉酶的启动子(Trends in Biotechnology 7,283-287(1989))。

除此之外，已建立了对应于各种不同微生物的宿主载体系统，它们可以视情况使用。

除了微生物之外，已在植物细胞和动物细胞中建立了各种不同的宿主/载体系统。具体来说，已建立了在动物细胞例如昆虫(例如家蚕)等(Nature 315,592-594(1985))和植物细胞例如油菜籽、玉米、马铃薯等中表达大量异源蛋白质的系统以及使用无细胞蛋白质合成系统例如大肠埃希氏杆菌无细胞提取物、小麦胚芽等的系统，并且可以优选地使用。

在本发明的生产方法中，对所述“具有产生所述酶的能力的微生物或细胞”没有特别限制，只要它是具有产生“C＝C还原酶(可以立体选择性还原碳-碳双键的活性)”的能力的微生物或细胞或固有地具有所述能力的微生物或细胞或通过育种被赋予所述能力的微生物或细胞即可。作为通过育种赋予所述能力的手段，可以采用已知的方法例如基因重组处理(转化)、突变处理等。其中，用编码C＝C还原酶的DNA转化的微生物或细胞是优选的。作为转化方法，可以使用例如引入C＝C还原酶基因，在有机化合物的生物合成途径中增强C＝C还原酶基因的表达，在副产物生物合成途径中降低C＝C还原酶基因的表达等的方法。作为产生转化体的具体方法，可以转引上述关于C＝C还原酶的解释。

在本发明的生产方法中，所述“具有产生所述酶的能力的微生物或细胞”不限于活的微生物或细胞，而是还包括作为活体已死亡但具有酶活性的微生物或细胞。它还包括冷冻的微生物或细胞。

在本发明的生产方法中，“所述微生物或细胞的加工产物”意味着含有具有所需功能的蛋白质并通过下述方法获得的产物：培养所述微生物或细胞，并且1)用有机溶剂(丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、甲苯等)、表面活性剂等破坏所述微生物或细胞，2)将其冷冻干燥，3)将其固定化在载体等上，4)将其物理或酶法破坏，或5)从上述1)-4)的处理过的产物提取作为粗产物或纯化产物的酶级分，或将它们进一步固定化在载体(聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶凝胶等)等上。所述处理过的产物可以是例如通过破坏所述培养的微生物或细胞而获得的蛋白质。所述蛋白质例如使用可商购的试剂盒(例如Bugbuster主混合物(由Merck制造))获得。所述处理过的产物在后文中有时被称为“酶溶液”。

在本发明的生产方法中，“通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液”可以是1)所述微生物或细胞的培养基(例如当它是所述细胞和液体培养基的悬液时，或者当所述细胞是表达分泌蛋白的细胞时，通过用离心等除去所述细胞而获得的上清液或其浓缩物)，2)用有机溶剂等处理的所述微生物或细胞的培养基，3)物理或酶法破坏的所述微生物或细胞的细胞膜，或此外通过对2)或3)进行粗纯化或纯化而获得的酶。

所述C＝C还原酶的实例包括含有具有SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列的蛋白质((A)的蛋白质)的酶，或含有具有与SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列具有高同一性的氨基酸序列(在后文中有时被称为“氨基酸序列的同源物”)并具有还原化合物(1)和/或化合物(4)的活性的蛋白质((B)或(C)的蛋白质)的酶(在后文中有时被称为“C＝C还原酶的同源物”)等。具体来说，C＝C还原酶包括含有下述(A)、(B)或(C)的蛋白质的酶。

(A)具有SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列的蛋白质；

(B)具有由在SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至多个氨基酸而得到的氨基酸序列，并具有催化式(I)和/或式(II)中示出的反应的活性的蛋白质：

(C)具有与SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列具有不低于80％同一性的氨基酸序列，其中引入有选自下述组(i)-(ii)的至少一个氨基酸替换，并具有催化式(I)和/或式(II)中示出的反应的活性的蛋白质：

(i)将SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列中第26位的半胱氨酸用天冬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸之外的氨基酸替换；

(ii)将SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列中第104位的丙氨酸用丙氨酸之外的氨基酸替换。

在所述(A)的蛋白质中，所述SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列是源自于枯草芽孢杆菌的碳-碳双键还原酶YqjM的氨基酸序列。

在本发明中，所述具有SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列的C＝C还原酶的同源物含有上述(B)或(C)的蛋白质。

在所述(B)中示出的蛋白质中，所述“一个至多个氨基酸”是指通常1-100个，优选地1-50个，更优选地1-20个，更优选地1-10个，更优选地1-5，更优选地1-3个，特别优选地1或2个氨基酸。在替换的情况下，所述氨基酸优选被保守替换。

在所述(C)中示出的蛋白质中，上述(i)的氨基酸替换优选为下述(i’)的氨基酸替换，上述(ii)的氨基酸替换优选为下述(ii’)的氨基酸替换，更优选为(ii”)的氨基酸替换，特别优选为(ii”’)的氨基酸替换。

(i’)将SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列中第26位的半胱氨酸用丙氨酸替换。

(ii’)将SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列中第104位的丙氨酸用组氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸替换。

(ii”)将SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列中第104位的丙氨酸用组氨酸、色氨酸或酪氨酸替换。

(ii”’)将SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列中第104位的丙氨酸用色氨酸替换。

在所述(C)中示出的蛋白质中，所述氨基酸替换可以是例如将SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列中第26位的半胱氨酸用丙氨酸替换并且将第104位的丙氨酸用苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或组氨酸替换(C26A和A104F、C26A和A104Y、C26A和A104W或C26A和A104H)。此外，可以提到的是将SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列中第26位的半胱氨酸用丙氨酸替换(C26A)。此外，可以提到的是将SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列中第104位的丙氨酸用苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或组氨酸替换(A104F、A104Y、A104W或A104H)。在这些氨基酸替换中，C26A和A104F、C26A和A104Y、C26A和A104W、C26A和A104H、C26A、A104F、A104Y、A104W或A104H是优选的，C26A和A104Y、C26A和A104W、C26A和A104H、A104Y、A104W,或A104H是更加优选的，并且C26A和A104W或A104W是特别优选的。

在所述(C)中示出的蛋白质中，通过进行上述氨基酸替换，可以相对于野生型提高相对活性、转化率和光学纯度。

在所述(C)中示出的蛋白质中，与SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列的同一性不低于80％，优选地不低于85％，更优选地不低于90％，更优选地不低于95％，更优选地不低于98％，特别优选地不低于99％。

本说明书中氨基酸序列的同一性(在适当情况下改用同源性或相似性来表述)可以例如使用同源性计算算法NCBI BLAST(美国国家生物技术信息中心基本局部比对搜索工具(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment SearchTool))，并在下述条件(期望值＝10；允许空位；矩阵＝BLOSUM62；过滤＝OFF)下计算。用于确定氨基酸序列同源性的其他算法的实例包括在Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877(1993)中描述的算法[所述算法被并入到NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中(Altschul等，Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997))]，在Needleman等，J.Mol.Biol.,48:444-453(1970)中描述的算法[所述算法被并入到GCG软件包中的GAP程序中]，在Myers和Miller，CABIOS,4:11-17(1988)中描述的算法[所述算法被并入到作为CGC序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(2.0版)中]，在Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448(1988)中描述的算法[所述算法被并入到GCG软件包中的FASTA程序中]等，并且它们也可以同样地优选使用。

在所述(B)或(C)中示出的蛋白质中，所述催化式(I)中示出的反应的活性是指催化所述反应以通过还原化合物(1)产生化合物(2)的活性。

式(I)中示出的反应中的选择性可以使用通过C＝C还原产生的化合物(2)的(3R)-形式与(3S)-形式的比率作为指标来确认。与产生的(3R)-形式的量相比产生的(3S)-形式的量越低，化合物(2)的得率提高得越多，这在工业化中是有利的。

在所述(B)或(C)中示出的蛋白质中，所述催化式(II)中示出的反应的活性是指催化所述反应以通过还原化合物(4)产生化合物(3)的活性。

式(II)中示出的反应中的选择性可以使用通过还原产生的化合物(3)的(1R,3R)-形式与(1R,3S)-形式的比率作为指标来确认。与产生的(1R,3R)-形式的量相比产生的(1R,3S)-形式的量越低，化合物(3)的得率提高得越多，这在工业化中是有利的。

所述(1R,3R)-形式与(1R,3S)-形式的生产比率可以使用产生的反式形式和顺式形式的比率作为指标来比较。所述反式形式和顺式形式意味着几何异构体，(1R,3R)-形式和(1S,3S)-形式是反式形式，(1R,3S)-形式和(1S,3R)-形式是顺式形式。在本发明中，由于从C＝C还原得到的产物含有(1R,3R)-形式作为主要组分，因此不仅可以通过使用可以定量单独的(1R,3R)-形式的评估系统而且可以通过使用可以分离反式形式和顺式形式的评估系统，对所述得到的产物进行定量。也就是说，(1R,3R)-形式的定量可以用产生的反式形式的量的定量来代替。同样地，(1R,3S)-形式的定量可以通过产生的顺式形式的量的定量来代替。产生的顺式形式的量越低，化合物(3)的得率提高得越多，这在工业化中是有利的。

它们的选择性可以通过将化合物(4)与靶C＝C还原酶等相接触以产生化合物(3)，并测量产生的化合物(3)的(1R,3R)-形式和(1R,3S)-形式的量或测量产生的反式形式和顺式形式的量来确认。

对接触方法没有特别限制。例如，将化合物(1)或化合物(4)添加到含有上述C＝C还原酶的液体中以作为靶，并在适合的温度(例如约10℃-45℃)和适合的压力(例如大气压附近)等下进行反应。

如上所述，C＝C还原酶的实例是含有具有SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列的蛋白质((A)中示出的蛋白质)的酶或含有是所述氨基酸序列的同源物并具有化合物(1)和/或化合物(4)的C＝C还原活性的蛋白质((B)或(C)中示出的蛋白质)的酶等。含有具有所述氨基酸序列的同源物的蛋白质的C＝C还原酶对化合物(1)和/或化合物(4)的C＝C还原活性的程度，可能定量等同于含有具有SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列的蛋白质的C＝C还原酶，但可能在可接受的范围内不同(例如约0.1倍至约20倍，优选地约0.3倍至约15倍，更优选地约0.5倍至约10倍)。

作为获得含有(A)、(B)或(C)中示出的蛋白质的C＝C还原酶的方法，可以转引上述对获得C＝C还原酶的方法、从含有C＝C还原酶的转化体产生的方法等的解释。

所述C＝C还原酶((B)或(C)中示出的蛋白质)与含有SEQ ID NO：1中示出的常规已知蛋白质序列的C＝C还原酶((A)中示出的蛋白质)相比，具有以更高的选择性催化上述式(I)和/或式(II)中示出的反应的活性。

在下述本发明的生产方法中，可以将上述C＝C还原酶与化合物(1)或化合物(4)直接反应。优选的是使用具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液。

[C＝O还原酶]

本发明的生产方法的特征在于将碳-碳双键还原酶(C＝C还原酶)、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液和羰基还原酶(C＝O还原酶)、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液与由式(1)表示的化合物相接触，以得到由式(3)表示的化合物。所述酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液有时被称为“酶等”。在下文中解释了所述C＝O还原酶。

在本发明的生产方法中，对所述C＝O还原酶没有特别限制。C＝O还原酶也可以按照已知方法从例如开菲尔乳杆菌、芬兰毕赤酵母或核黄素德沃斯氏菌纯化和分离来获得。在这里，所述纯化方法的实例包括溶剂萃取、蒸馏、柱层析、液相色谱、重结晶、这些方法的组合等。

此外，所述C＝O还原酶也可以通过培养含有编码它们的核酸的转化体，并从获得的培养物分离和纯化所述C＝O还原酶来生产。所述编码C＝O还原酶的核酸可以是DNA或RNA，或者可以是DNA/RNA嵌合体。优选的是DNA。此外，所述核酸可以是双链或单链的。当它是双链时，它可以是双链DNA、双链RNA或DNA:RNA杂交体。当它是单链时，它可以是正义链(即编码链)或反义链(即非编码链)。

作为编码C＝O还原酶的核酸(DNA)，可以提到的是例如源自于开菲尔乳杆菌的lkadh基因碱基序列(SEQ ID NO：6)(GeneBank登记号AY267012)、源自于芬兰毕赤酵母的pfodh1基因碱基序列(SEQ ID NO：7)(GeneBank登记号AB259114.1)、源自于核黄素德沃斯氏菌的drcr1基因碱基序列(SEQ ID NO：8)(GeneBank登记号BD450088.1)。

作为编码C＝O还原酶的DNA，可以提到的是合成的DNA等。例如，在编码源自于开菲尔乳杆菌、芬兰毕赤酵母或核黄素德沃斯氏菌的C＝O还原酶的DNA的情况下，它可以通过转变全长C＝C还原酶cDNA来获得，所述cDNA通过反转录酶-PCR，通过使用源自于开菲尔乳杆菌、芬兰毕赤酵母或核黄素德沃斯氏菌的总RNA或mRNA级分作为模板，按照本身已知的方法例如ODA-LA PCR法、缺口双链体法、Kunkel法等或与其相似的方法，并通过使用已知的试剂盒例如Mutan^TM-super Express Km(TAKARA BIO INC.)、Mutan^TM-K(TAKARA BIO INC.)等直接扩增。或者，它可以通过按照上述方法转变通过菌落或噬菌体杂交或PCR等从cDNA文库克隆的cDNA来获得，所述cDNA文库通过将上述总RNA或mRNA插入到适合的载体中来制备。所述用于文库的载体可以是任何载体例如噬菌体、质粒、粘粒、噬菌粒等。

编码C＝O还原酶的核酸(DNA)可以例如使用源自于开菲尔乳杆菌、芬兰毕赤酵母或核黄素德沃斯氏菌的染色体DNA作为模板和适合的引物进行PCR来克隆。

对于产生表达载体的方法、产生转化体的方法、作为转化的靶的宿主微生物等来说，可以转引关于C＝C还原酶的解释。

在本发明的生产方法中，对所述“具有产生所述酶的能力的微生物或细胞”没有特别限制，只要它是具有产生“C＝O还原酶(可以立体选择性还原羰基的活性)”的能力的微生物或细胞或固有地具有所述能力的微生物或细胞或通过育种被赋予所述能力的微生物或细胞即可。作为通过育种赋予所述能力的手段，可以采用已知的方法例如基因重组处理(转化)、突变处理等。其中，用编码C＝O还原酶的DNA转化的微生物或细胞是优选的。作为转化方法，可以使用例如引入C＝O还原酶基因，在有机化合物的生物合成途径中增强C＝O还原酶基因的表达，在副产物生物合成途径中降低C＝O还原酶基因的表达等的方法。作为产生转化体的具体方法，可以转引在C＝C还原酶中描述的内容。

对于本发明的生产方法中的“具有产生所述酶的能力的微生物或细胞”、“所述微生物或细胞的加工产物”和“通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液”来说，可以转引关于C＝C还原酶的解释。

所述C＝O还原酶的实例包括含有具有SEQ ID NO：2、3或4中示出的氨基酸序列的蛋白质((A)的蛋白质)的酶，或含有具有与SEQ ID NO：2、3或4中示出的氨基酸序列具有高同一性的氨基酸序列(在后文中有时被称为“氨基酸序列的同源物”)并具有还原化合物(1)和/或化合物(2)的活性的蛋白质((B)或(C)的蛋白质)的酶(在后文中有时被称为“C＝O还原酶的同源物”)等。具体来说，C＝O还原酶包括含有下述(A)、(B)或(C)的蛋白质的酶。

(A)具有SEQ ID NO：2、3或4中示出的氨基酸序列的蛋白质；

(B)具有由在SEQ ID NO：2、3或4中示出的氨基酸序列中缺失、替换、插入和/或添加一个至多个氨基酸而得到的氨基酸序列，并且具有催化式(III)和/或式(IV)中示出的反应的活性的蛋白质：

(C)具有与SEQ ID NO：2、3或4中示出的氨基酸序列具有不低于80％同一性的氨基酸序列，并具有催化上述式(III)和/或式(IV)中示出的反应的活性的蛋白质。

在所述(A)中示出的蛋白质中，SEQ ID NO：2中示出的氨基酸序列是源自于开菲尔乳杆菌的羰基还原酶Lkadh的氨基酸序列，SEQ ID NO：3中示出的氨基酸序列是源自于芬兰毕赤酵母的羰基还原酶PfODH的氨基酸序列，SEQ ID NO：4中示出的氨基酸序列是源自于核黄素德沃斯氏菌的羰基还原酶DrCR的氨基酸序列。这些氨基酸序列被本发明人鉴定为化合物(1)或化合物(2)的C＝O还原酶。

在本发明中，所述具有SEQ ID NO：2、3或4中示出的氨基酸序列的C＝O还原酶的同源物含有上述(B)或(C)的蛋白质。

在所述(B)中示出的蛋白质中，所述“一个至多个氨基酸”是指通常1-100个，优选地1-50个，更优选地1-20个，更优选地1-10个，更优选地1-5，更优选地1-3个，特别优选地1或2个氨基酸。在替换的情况下，所述氨基酸优选被保守替换。

在所述(C)中示出的蛋白质中，与SEQ ID NO：2、3或4中示出的氨基酸序列的同一性不低于80％，优选地不低于85％，更优选地不低于90％，更优选地不低于95％，更优选地不低于98％，特别优选地不低于99％。

对于氨基酸序列的同一性(在适当情况下可以改写为同源性或相似性)来说，可以转引关于C＝C还原酶的解释。

在所述(B)或(C)中示出的蛋白质中，所述催化式(III)中示出的反应的活性是指催化所述反应以通过化合物(2)的C＝O还原产生化合物(3)的活性。

在本发明中，式(III)中示出的反应中的选择性可以使用通过C＝O还原产生的化合物(3)的(1R,3R)-形式与(1S,3R)-形式的比率作为指标来确认。与产生的(1R,3R)-形式的量相比产生的(1S,3R)-形式的量越低，化合物(3)的得率提高得越多，这在工业化中是有利的。

化合物(3)的(1R,3R)-形式与(1S,3R)-形式的生产比率可以使用产生的反式形式与顺式形式的比率作为指标来比较。所述反式形式和顺式形式意味着几何异构体，(1R,3R)-形式和(1S,3S)-形式是反式形式，(1R,3S)-形式和(1S,3R)-形式是顺式形式。在本发明中，由于从C＝O还原得到的产物含有(1R,3R)-形式作为主要组分，因此不仅可以通过使用可以定量单独的(1R,3R)-形式的评估系统而且可以通过使用可以分离反式形式和顺式形式的评估系统，对所述得到的产物进行定量。也就是说，(1R,3R)-形式的定量可以用产生的反式形式的量的定量来代替。同样地，(1S,3R)-形式的定量可以通过产生的顺式形式的量的定量来代替。产生的顺式形式的量越低，化合物(3)的得率提高得越多，这在工业化中是有利的。

它们的选择性可以通过将化合物(2)与靶C＝O还原酶等相接触以产生化合物(3)，并测量产生的化合物(3)的(1R,3R)-形式和(1R,3S)-形式的量或测量产生的反式形式和顺式形式的量来确认。

在所述(B)或(C)中示出的蛋白质中，所述催化式(IV)中示出的反应的活性是指催化所述反应以通过还原化合物(1)产生化合物(4)的活性。

式(IV)中示出的反应中的选择性可以使用通过还原产生的化合物(4)的(1R)-形式与(1S)-形式的比率作为指标来确认。与产生的(1R)-形式的量相比产生的(1S)-形式的量越低，化合物(4)的得率提高得越多，这在工业化中是有利的。

对接触方法没有特别限制。例如，将化合物(1)或化合物(2)添加到含有上述C＝O还原酶的液体以作为靶，并在适合的温度(例如约10℃-45℃)和适合的压力(例如大气压附近)等下进行反应。

如上所述，C＝O还原酶的实例是含有具有SEQ ID NO：2、3或4中示出的氨基酸序列的蛋白质((A)中示出的蛋白质)的酶或含有是所述氨基酸序列的同源物并具有化合物(1)和/或化合物(2)的C＝O还原活性的蛋白质((B)或(C)中示出的蛋白质)的酶等。含有具有所述氨基酸序列的同源物的蛋白质的C＝O还原酶对化合物(1)和/或化合物(2)的羰基还原活性的程度，可能定量等同于含有具有SEQ ID NO：2、3或4中示出的氨基酸序列的蛋白质的C＝O还原酶，但可能在可接受的范围内不同(例如约0.1倍至约20倍，优选地约0.3倍至约15倍，更优选地约0.5倍至约10倍)。

对于获得含有(A)、(B)或(C)中示出的蛋白质的C＝O还原酶的方法，可以转引关于C＝C还原酶的解释。

所述C＝O还原酶((B)或(C)中示出的蛋白质)与含有SEQ ID NO：2、3或4中示出的常规已知蛋白质的C＝C还原酶((A)中示出的蛋白质)相比，具有以更高的选择性催化上述式(III)或(IV)中示出的反应的活性。

在下述本发明的生产方法中，可以将上述C＝O还原酶与化合物(1)或化合物(2)直接反应。优选的是使用具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液。

2.本发明的组合物

本发明的组合物(酶)包括C＝C还原酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液，并且催化使用化合物(1)作为底物产生化合物(2)的反应和使用化合物(4)作为底物产生化合物(3)的反应。本发明的组合物是有用的，因为它可作为催化剂用于以低成本、高效率工业化生产具有高光学纯度的化合物(2)或化合物(3)。

此外，本发明的组合物(酶)包括C＝O还原酶、具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液，并且催化使用化合物(1)作为底物产生化合物(4)的反应和使用化合物(2)作为底物产生化合物(3)的反应。本发明的组合物是有用的，因为它可作为催化剂用于以低成本、高效率工业化生产具有高光学纯度的化合物(3)或化合物(4)。

除了活性成分(酶等)之外，本发明的组合物还可以含有赋形剂、缓冲剂、悬液、稳定剂、防腐剂、抗菌剂、盐水等。作为赋形剂，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露糖醇、蔗糖等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、抗坏血酸等。作为防腐剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为抗菌剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

3.本发明的生产方法

[步骤1]

使用C＝C还原酶等通过下述式(I)中示出的反应生产化合物(2)

根据本发明，提供了一种通过式(I)中示出的反应，即将C＝C还原酶等与化合物(1)反应来生产化合物(2)的方法。

当将C＝C还原酶与化合物(1)相接触时，将纯化或粗纯化的C＝C还原酶、具有产生C＝C还原酶的能力的微生物或细胞(例如具有编码蛋白质的DNA的转化体等)、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液与化合物(1)相接触，由此可以产生化合物(2)。

可以将所述C＝C还原酶直接用于所述反应，但优选地使用具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液。其中，优选地使用具有编码蛋白质的DNA的转化体。

对于待添加到所述反应混合物的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液的量而言，当添加微生物或细胞时，它被添加到所述反应混合物使得所述微生物或细胞的浓度以湿细菌的体重计通常为约0.1w/v％-50w/v％，优选为1w/v％-20w/v％。当使用加工产物或培养液时，确定所述酶的比活性，并添加在添加后提供上述细胞浓度的量。在本说明书中，w/v％显示了重量/体积％。

对所述反应的方法没有特别限制，并且将作为底物的化合物(1)添加到含有C＝C还原酶的液体，并且反应可以在适合的温度(例如约10℃-45℃)和适合的压力(例如大气压附近)下进行。通过这种方式，可以产生化合物(2)。

作为反应底物的化合物(1)通常以0.01w/v％-90w/v％、优选地0.1w/v％-30w/v％范围内的底物浓度使用。所述反应底物可以在反应开始时立即全部添加。然而，从减少酶底物抑制的影响和提高得到的产物的积累浓度的观点来看，连续或间歇地添加是理想的。

所述反应通常在水性介质或水性介质与有机溶剂的混合物中进行。作为水性介质，可以提到的是例如水或缓冲液。作为有机溶剂，可以使用具有作为反应底物的化合物(1)的高溶解性的溶剂，例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜等。作为有机溶剂，还可以使用有效移除反应副产物的乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等。

所述反应在通常为4℃-60℃、优选为10℃-45℃的反应温度和通常为pH3-11、优选为pH5-8的条件下进行。反应时间通常为约1hr-72hr。

通过本发明的生产方法生产的化合物(2)可以如下进行纯化：在反应完成后，通过本领域普通技术人员已知的分离或纯化方法例如离心、膜处理等分离反应混合物中的细菌、蛋白质等，然后以适合的组合进行使用有机溶剂例如1-丁醇、叔丁醇等的萃取，蒸馏，使用离子交换树脂、硅胶等的柱层析，在等电点处结晶，使用单盐酸盐、二盐酸盐、钙盐等的结晶等。

使用在本发明中获得的化合物(2)，可以以低成本高效地生产具有高光学纯度的化合物(3)，所述化合物(3)是用于合成各种不同药物产品的起始原料，以及可用于生产用于合成各种不同药物产品的中间体的中间体。

[步骤2]

使用C＝O还原酶等通过下述式(III)中示出的反应生产化合物(3)

根据本发明，提供了一种通过式(III)中示出的反应，即通过将C＝O还原酶等与化合物(2)反应来生产化合物(3)的方法。

当将C＝O还原酶与化合物(2)相接触时，将纯化或粗纯化的C＝O还原酶、具有产生本发明的C＝O还原酶的能力的微生物或细胞(例如例如具有编码蛋白质的DNA的转化体等)、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液与化合物(2)相接触，由此可以产生化合物(3)。

可以将所述C＝O还原酶直接用于所述反应，但优选地使用具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液。其中，优选地使用具有编码蛋白质的DNA的转化体。

对于待添加到所述反应混合物的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液的量而言，当添加微生物或细胞时，它被添加到所述反应混合物使得所述微生物或细胞的浓度以湿细菌的体重计通常为约0.1w/v％-50w/v％，优选为1w/v％-20w/v％。当使用加工产物或培养液时，确定所述酶的比活性，并添加在添加后提供上述细胞浓度的量。

对于作为C＝O还原酶的反应底物的3-(三氟甲基)环己烷-1-酮而言，通常使用(3R)-形式。

对所述反应的方法没有特别限制，并且将作为底物的化合物(2)添加到含有C＝O还原酶的液体，并且反应可以在适合的温度(例如约10℃-45℃)和适合的压力(例如大气压附近)下进行。通过这种方式，可以产生化合物(3)。

作为反应底物的化合物(2)通常以0.01w/v％-90w/v％、优选地0.1w/v％-30w/v％范围内的底物浓度使用。所述反应底物可以在反应开始时立即全部添加。然而，从减少酶底物抑制的影响和提高得到的产物的积累浓度的观点来看，连续或间歇地添加是理想的。

所述反应通常在水性介质或水性介质与有机溶剂的混合物中进行。作为水性介质，可以提到的是例如水或缓冲液。作为有机溶剂，可以使用具有作为反应底物的化合物(2)的高溶解性的溶剂，例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜等。作为有机溶剂，还可以使用有效移除反应副产物的乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等。

所述反应在通常为4℃-60℃、优选为10℃-45℃的反应温度和通常为pH3-11、优选为pH5-8的条件下进行。反应时间通常为约1hr-72hr。

通过本发明的生产方法生产的化合物(3)可以如下进行纯化：在反应完成后，通过本领域普通技术人员已知的分离或纯化方法例如离心、膜处理等分离反应混合物中的细菌、蛋白质等，然后以适合的组合进行使用有机溶剂例如1-丁醇、叔丁醇等的萃取，蒸馏，使用离子交换树脂、硅胶等的柱层析，在等电点处结晶，使用单盐酸盐、二盐酸盐、钙盐等的结晶等。

所述得到的化合物(3)包括作为其非对映异构体的由下述式(5)表示的化合物

(在后文中有时被称为化合物(5))，或由下述式(6)表示的化合物

(在后文中有时被称为化合物(6))。当化合物(3)被用作合成药物产品的起始原料或中间体时，这些化合物优选地以小的含量使用。在通过上述生产方法获得的化合物(3)中，化合物(5)和/或化合物(6)的含量优选地不超过8摩尔％，更优选地不超过6摩尔％，更优选地不超过4摩尔％，特别优选地不超过2摩尔％。

使用在本发明中获得的化合物(3)，可以以低成本高效地生产具有高光学纯度的化合物，即用于合成各种不同药物产品的起始原料，以及用于合成各种不同药物产品的中间体。在本发明中获得的化合物(3)可用于生产合成各种不同药物产品的起始原料以及用于合成各种不同药物产品的中间体而不需进行纯化等，因为它仅含有少量杂质。因此，生产成本变低，并且化合物(3)对于工业生产来说是优选的。

[步骤3]

使用C＝O还原酶等通过下述式(IV)中示出的反应生产化合物(4)

根据本发明，提供了一种通过式(IV)中示出的反应，即将C＝O还原酶等与化合物(1)反应来生产化合物(4)的方法。

当将C＝O还原酶与化合物(1)相接触时，将纯化或粗纯化的C＝O还原酶、具有产生C＝O还原酶的能力的微生物或细胞(例如具有编码蛋白质的DNA的转化体等)、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液与化合物(1)相接触，由此可以产生化合物(4)。

可以将所述C＝O还原酶直接用于所述反应，但优选地使用具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液。其中，优选地使用具有编码蛋白质的DNA的转化体。

对于待添加到所述反应混合物的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液的量而言，当添加微生物或细胞时，它被添加到所述反应混合物使得所述微生物或细胞的浓度以湿细菌的体重计通常为约0.1w/v％-50w/v％，优选为1w/v％-20w/v％。当使用加工产物或培养液时，确定所述酶的比活性，并添加在添加后提供上述细胞浓度的量。

对于作为C＝O还原酶的反应底物的化合物(1)而言，通常使用可商购的产品。

对所述反应的方法没有特别限制，并且将作为底物的化合物(1)添加到含有C＝O还原酶的液体，并且反应可以在适合的温度(例如约10℃-45℃)在适合的压力(例如大气压附近)下进行。通过这种方式，可以产生化合物(4)。

作为反应底物的化合物(1)通常以0.01w/v％-90w/v％、优选地0.1w/v％-30w/v％范围内的底物浓度使用。所述反应底物可以在反应开始时立即全部添加。然而，从减少酶底物抑制的影响和提高得到的产物的积累浓度的观点来看，连续或间歇地添加是理想的。

所述反应通常在水性介质或水性介质与有机溶剂的混合物中进行。作为水性介质，可以提到的是例如水或缓冲液。作为有机溶剂，可以使用具有作为反应底物的化合物(1)的高溶解性的溶剂，例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜等。作为有机溶剂，还可以使用有效移除反应副产物的乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等。

所述反应在通常为4℃-60℃、优选为10℃-45℃的反应温度和通常为pH3-11、优选为pH5-8的条件下进行。反应时间通常为约1hr-72hr。

通过本发明的生产方法生产的化合物(4)可以如下进行纯化：在反应完成后，通过本领域普通技术人员已知的分离或纯化方法例如离心、膜处理等分离反应混合物中的细菌、蛋白质等，然后以适合的组合进行使用有机溶剂例如1-丁醇、叔丁醇等的萃取，蒸馏，使用离子交换树脂、硅胶等的柱层析，在等电点处结晶，使用单盐酸盐、二盐酸盐、钙盐等的结晶等。

使用在本发明中获得的化合物(4)，可以以低成本高效地生产具有高光学纯度的化合物(3)，所述化合物(3)是用于合成各种不同药物产品的起始原料，以及可用于生产合成中间体的中间体。

[步骤4]

使用C＝C还原酶等通过下述式(II)中示出的反应生产化合物(3)

根据本发明，提供了一种通过式(II)中示出的反应，即将C＝C还原酶等与化合物(4)反应来生产化合物(3)的方法。

当将C＝C还原酶与化合物(4)相接触时，将纯化或粗纯化的C＝C还原酶、本发明的具有产生C＝C还原酶的能力的微生物或细胞(例如具有编码蛋白质的DNA的转化体等)、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液与化合物(4)相接触，由此可以产生化合物(3)。

可以将所述C＝C还原酶直接用于所述反应，但优选地使用具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液。其中，优选地使用具有编码蛋白质的DNA的转化体。

对于待添加到所述反应混合物的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液的量而言，当添加微生物或细胞时，它被添加到所述反应混合物使得所述微生物或细胞的浓度以湿细菌的体重计通常为约0.1w/v％-50w/v％，优选为1w/v％-20w/v％。当使用加工产物或培养液时，确定所述酶的比活性，并添加在添加后提供上述细胞浓度的量。

对于作为C＝C还原酶的反应底物的3-三氟甲基-2-环己烯-1-醇而言，通常使用(1R)-形式。

对所述反应的方法没有特别限制，并且将作为底物的化合物(4)添加到含有C＝C还原酶的液体，并且反应可以在适合的温度(例如约10℃-45℃)在适合的压力(例如大气压附近)下进行。通过这种方式，可以产生化合物(3)。

作为反应底物的化合物(4)通常以0.01w/v％-90w/v％、优选地0.1w/v％-30w/v％范围内的底物浓度使用。所述反应底物可以在反应开始时立即全部添加。然而，从减少酶底物抑制的影响和提高得到的产物的积累浓度的观点来看，连续或间歇地添加是理想的。

所述反应通常在水性介质或水性介质与有机溶剂的混合物中进行。作为水性介质，可以提到的是例如水或缓冲液。作为有机溶剂，可以使用具有作为反应底物的化合物(4)的高溶解性的溶剂，例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜等。作为有机溶剂，还可以使用有效移除反应副产物的乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等。

所述反应在通常为4℃-60℃、优选为10℃-45℃的反应温度和通常为pH3-11、优选为pH5-8的条件下进行。反应时间通常为约1hr-72hr。

通过本发明的生产方法生产的化合物(3)可以如下进行纯化：在反应完成后，通过本领域普通技术人员已知的分离或纯化方法例如离心、膜处理等分离反应混合物中的细菌、蛋白质等，然后以适合的组合进行使用有机溶剂例如1-丁醇、叔丁醇等的萃取，蒸馏，使用离子交换树脂、硅胶等的柱层析，在等电点处结晶，使用单盐酸盐、二盐酸盐、钙盐等的结晶等。

所述得到的化合物(3)包括作为其非对映异构体的化合物(5)或化合物(6)。当化合物(3)被用作合成药物产品的起始原料或中间体时，这些化合物优选地以小的含量使用。在通过上述生产方法获得的化合物(3)中，化合物(5)和/或化合物(6)的含量优选地不超过8摩尔％，更优选地不超过6摩尔％，更优选地不超过4摩尔％，特别优选地不超过2摩尔％。

使用在本发明中获得的化合物(3)，可以以低成本高效地生产具有高光学纯度的化合物，即用于合成各种不同药物产品的起始原料，以及用于合成各种不同药物产品的中间体。在本发明中获得的化合物(3)可用于生产合成各种不同药物产品的起始原料以及用于合成各种不同药物产品的中间体而不需进行纯化等，因为它仅含有少量杂质。因此，生产成本变低，并且化合物(3)对于工业生产来说是优选的。

[步骤5]

使用C＝C还原酶等通过下述式(V)中示出的反应生产化合物(3)

根据本发明，提供了一种通过式(V)中示出的反应，即将C＝C还原酶等与化合物(1)反应来生产化合物(3)的方法。

当将C＝C还原酶和C＝O还原酶与化合物(1)相接触时，将本发明的纯化或粗纯化的C＝C还原酶、具有产生C＝C还原酶的能力的微生物或细胞(例如具有编码蛋白质的DNA的转化体等)、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液和C＝O还原酶、具有产生C＝O还原酶的能力的微生物或细胞(例如具有编码蛋白质的DNA的转化体等)、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液与化合物(1)相接触，由此可以产生化合物(3)。

可以将所述C＝C还原酶和C＝O还原酶直接用于所述反应，但优选地使用具有产生所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液。其中，优选地使用具有编码蛋白质的DNA的转化体。

对于待添加到所述反应混合物的微生物或细胞、所述微生物或细胞的加工产物和/或通过培养所述微生物或细胞获得的含有所述酶的培养液的量而言，当添加微生物或细胞时，它被添加到所述反应混合物使得所述微生物或细胞的浓度以湿细菌的体重计通常为约0.1w/v％-50w/v％，优选为1w/v％-20w/v％。当使用加工产物或培养液时，确定所述酶的比活性，并添加在添加后提供上述细胞浓度的量。

对所述反应的方法没有特别限制，并且将作为底物的化合物(1)添加到含有C＝C还原酶和C＝O还原酶的液体，并且反应可以在适合的温度(例如约10℃-45℃)在适合的压力(例如大气压附近)下进行。通过这种方式，可以产生化合物(3)。

作为反应底物的化合物(1)通常以0.01w/v％-90w/v％、优选地0.1w/v％-30w/v％范围内的底物浓度使用。所述反应底物可以在反应开始时立即全部添加。然而，从减少酶底物抑制的影响和提高得到的产物的积累浓度的观点来看，连续或间歇地添加是理想的。

所述反应通常在水性介质或水性介质与有机溶剂的混合物中进行。作为水性介质，可以提到的是例如水或缓冲液。作为有机溶剂，可以使用具有作为反应底物的化合物(1)的高溶解性的溶剂，例如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚砜等。作为有机溶剂，还可以使用有效移除反应副产物的乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等。

所述反应在通常为4℃-60℃、优选为10℃-45℃的反应温度和通常为pH3-11、优选为pH5-8的条件下进行。反应时间通常为约1hr-72hr。

通过本发明的生产方法生产的化合物(3)可以如下进行纯化：在反应完成后，通过本领域普通技术人员已知的分离或纯化方法例如离心、膜处理等分离反应混合物中的细菌、蛋白质等，然后以适合的组合进行使用有机溶剂例如1-丁醇、叔丁醇等的萃取，蒸馏，使用离子交换树脂、硅胶等的柱层析，在等电点处结晶，使用单盐酸盐、二盐酸盐、钙盐等的结晶等。

所述得到的化合物(3)包括作为其非对映异构体的化合物(5)或化合物(6)。当化合物(3)被用作合成药物产品的起始原料或中间体时，这些化合物优选地以小的含量使用。在通过上述生产方法获得的化合物(3)中，化合物(5)和/或化合物(6)的含量优选地不超过8摩尔％，更优选地不超过6摩尔％，更优选地不超过4摩尔％，特别优选地不超过2摩尔％。

使用在本发明中获得的化合物(3)，可以以低成本高效地生产具有高光学纯度的化合物，即用于合成各种不同药物产品的起始原料，以及用于合成各种不同药物产品的中间体。在本发明中获得的化合物(3)可用于生产合成各种不同药物产品的起始原料以及用于合成各种不同药物产品的中间体而不需进行纯化等，因为它仅含有少量杂质。因此，生产成本变低，并且化合物(3)对于工业生产来说是优选的。

本发明的生产方法1-3可以在辅酶存在下进行。作为辅酶，可以使用还原型烟酰胺腺嘌呤核苷酸(NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、氧化型烟酰胺腺嘌呤核苷酸(NAD⁺)或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)，并且可以优选地使用NADPH或NADP⁺。

对使用的辅酶的量没有特别限制，只要它起到辅酶的作用即可。优选地将它添加到反应系统至浓度通常为0.001mmol/L-100mmol/L，优选为0.01mmol/L-10mmol/L。

当添加辅酶时，优选地将从NAD(P)H产生的NAD(P)⁺再生成NAD(P)H，以提高生产效率。再生方法的实例包括：<1>使用宿主微生物自身的NAD(P)⁺还原能力的方法，<2>在反应系统中添加具有从NAD(P)⁺产生NAD(P)H的能力的微生物或其加工产物或可用于NAD(P)H再生的酶(再生酶)例如葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)的方法，<3>在产生转化体时，在引入本发明的DNA的同时引入上述再生酶(其是可用于NAD(P)H再生的酶)的基因的方法，等等。

[实施例]

本发明参考下述实施例进行更具体描述；然而，本发明不受这些实施例限制，只要它不脱离其主旨即可。

在下面示出的表中，A是丙氨酸，C是半胱氨酸，D是天冬氨酸，F是苯丙氨酸，H是组氨酸，W是色氨酸，并且Y是酪氨酸。此外，例如，A104W示出了其中氨基酸序列中第104位的丙氨酸被色氨酸替换的突变。

在实施例中，每种缩略语示出了下述化合物。

(R)-TFCH：(3R)-3-(三氟甲基)环己烷-1-酮

(S)-TFCH：(3S)-3-(三氟甲基)环己烷-1-酮

TFCL：3-(三氟甲基)环己烷-1-醇

(1R,3R)-TFCL：(1R,3R)-3-(三氟甲基)环己烷-1-醇

(1S,3S)-TFCL：(1S,3S)-3-(三氟甲基)环己烷-1-醇

目标产物的产生量、纯度等通过气相色谱法，在下文示出的GC分析条件1和GC分析条件2下测量。从作为下面提到的实施例1和后文描述的参比例8的反应中间体获得的峰分别指派(R)-TFCH和(S)-TFCH的洗脱时间。(1R,3R)-TFCL和(1S,3S)-TFCL的洗脱时间分别是实施例1的(1R,3R)-TFCL和后文描述的参比例8的(1S,3S)-TFCL的洗脱时间。在对TFCL的4种异构体(TFC异构体1-4)的混合物进行分析时检测到的4个峰中，TFCL异构体1是(1R,3R)-TFCL(化合物(3))，TFCL异构体2是(1S,3S)-TFCL，并且它们的非对映异构体TFCL异构体3或TFCL异构体4是由化合物(5)和化合物(6)示出的两种不同的非对映异构体。

TFCL-RPPA酯意味着TFCL的(R)-(-)-2-苯基丙酸酯。

[表1]

[GC分析条件1]

[表2]

[GC分析条件2]

参比例1(表达载体的制备)

[碳-碳双键还原酶(在后文中被称为“YqjM”)表达质粒的制备]

(1)基因克隆

按照常规方法进行PCR，以获得编码源自于枯草芽孢杆菌的YqjM(GeneBank登记号P54550)的yqjm基因的约1kbp的DNA片段。使用该DNA片段作为模板按照常规方法进行PCR，以获得其中限制性酶EcoRI的限制性酶切割位点被添加到5’端并且限制性酶XbaI的限制性酶切割位点被添加到3’端的DNA片段。

(2)表达质粒的制备

使用T4 DNA连接酶(由TAKARA BIO INC.制造)，将在上述(1)中获得的yqjm的DNA片段引入到通过用限制性酶EcoRI和XbaI消化而获得的质粒pKV32(描述在日本专利号4270918中)的trc启动子的下游中，以得到pKV32-YqjM。

参比例2(表达质粒的制备)

[羰基还原酶(在后文中被称为“Lkadh”)表达质粒的制备]

(1)基因克隆

按照常规方法进行PCR，以获得编码源自于开菲尔乳杆菌的lkadh基因(GeneBank登记号AY267012)的约0.75kbp的DNA片段。使用该DNA片段，按照常规方法进行PCR，以获得其中限制性酶EcoRI的限制性酶切割位点被添加到5’端并且限制性酶XbaI的限制性酶切割位点被添加到3’端的DNA片段。

(2)表达质粒的制备

以与参比例1(2)中相同的方式，将在上述(1)中获得的lkadh的DNA片段引入到质粒pKV32的trc启动子的下游中，以得到pKV32-Lkadh。

参比例3(表达质粒的制备)

[葡萄糖脱氢酶(在后文中被称为“BsGDH”)表达质粒的制备]

(1)基因克隆

按照JP-B-6476110中描述的方法，获得编码源自于枯草芽孢杆菌的BsGDH(GenBank登记号NP_388275)蛋白的bsgdh基因的基因序列的约0.8kbp的DNA片段，在所述蛋白中第96位的氨基酸被丙氨酸替换，并且第252位的氨基酸被亮氨酸替换。使用该DNA片段，按照常规方法进行PCR，以获得其中限制性酶EcoRI的限制性酶切割位点被添加到5’端并且限制性酶XbaI的限制性酶切割位点被添加到3’端的DNA片段。

(2)表达质粒的制备

使用T4 DNA连接酶(由TAKARA BIO INC.制造)，将在上述(1)中获得的bsgdh的DNA片段引入到用限制性酶EcoRI和XbaI消化的质粒pKW32(描述在JP-B-5613660中)的trc启动子的下游中，以得到pKW32-BsGDH。

参比例4(表达质粒的制备)

使用在参比例1中获得的质粒pKV32-YqjM作为模板，产生具有SEQ ID NO：1中示出的氨基酸序列的引入有突变的质粒，其中第26位的氨基酸C被A、D、F、W、Y中的任一者代替，并且第104位的氨基酸A被F、H、W、Y中的任一者代替。产生的引入有突变的质粒示出在表3中。

[表3]

参比例5(表达质粒的制备)

[碳-碳双键还原酶(在后文中被称为“NEMA”)表达质粒的制备]

(1)基因克隆

按照常规方法进行PCR，以获得编码源自于大肠埃希氏杆菌的NEMA的nemA基因(描述在Biol.Pharm.Bull.20:110-112(1997)中)的约1kbp的DNA片段。使用该DNA片段作为模板，按照常规方法进行PCR，以获得其中限制性酶EcoRI的限制性酶切割位点被添加到5’端并且限制性酶XbaI的限制性酶切割位点被添加到3’端的DNA片段。

(2)表达质粒的制备

以与参比例1(2)中相同的方式，将在上述(1)中获得的nemA的DNA片段引入到质粒pKV32的trc启动子的下游中，以得到pKV32-NEMA。

参比例6(表达质粒的制备)

[羰基还原酶(在后文中被称为“IsADH”)表达质粒的制备]

(1)基因克隆

按照常规方法进行PCR，以获得编码源自于Issatchankia scutulatavar.scutulata JCM1828菌株的isadh基因(描述在JP-B-4205496中)的约1kbp的DNA片段。使用该DNA片段，按照常规方法进行PCR，以获得其中限制性酶EcoRI的限制性酶切割位点被添加到5’端并且限制性酶XbaI的限制性酶切割位点被添加到3’端的DNA片段。

(2)表达质粒的制备

以与参比例1(2)中相同的方式，将在上述(1)中获得的isadh的DNA片段引入到质粒pKV32的trc启动子的下游中，以得到pKV32-IsADH。

参比例7(细菌细胞的制备)

[表达各种不同酶的大肠埃希氏杆菌JM109的制备]

(1)表达菌株的制备

使用在参比例1-6中获得的质粒，按照常规方法转化大肠埃希氏杆菌JM109感受态细胞(由TAKARA BIO INC.制造)，以获得其中引入有所述质粒的重组大肠埃希氏杆菌。

(2)酶溶液的制备

将在上述(1)中获得的重组大肠埃希氏杆菌在含有卡那霉素(25μg/mL)、0.2mmol/L异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培养基中在30℃生长18hr。在通过离心收集2mL得到的细菌细胞培养液后，按照常规方法并使用添加有全能核酸酶和重组溶菌酶的Bugbuster主混合物(由Merck制造)获得酶溶液。

实施例1：TFCL(TFCL异构体1)(化合物(3))的制备

(1)TFCL异构体1的制备

将7mL 1mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)、5.6mL 50mmol/L NADP⁺、10.5mL 1mol/L葡萄糖溶液、718mg化合物(1)、在参比例4和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKV32-YqjM(A104W(YqjM变体13))的酶溶液、在参比例2和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKV32-Lkadh的酶溶液和在参比例3和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKW32-BsGDH(E96A，Q252L)的酶溶液在200mL发酵罐中混合，并添加纯水以制备70mL反应混合物。将所述反应混合物在28℃-30℃的反应温度下在足够的搅拌速度下反应过夜，反应期间pH7.0。

在反应完成后，向反应混合物添加甲基叔丁基醚(在后文中被称为MTBE)，将所述混合物在室温搅拌并获得MTBE层。使用旋转蒸发器从萃取物中蒸发掉MTBE，以得到TFCL异构体1。

(2)通过改良的Moscher方法制备TFCL异构体1-RPPA酯

在30mL试管中装入(R)-(-)-2-苯基丙酸(RPPA)(15mg，0.1mmol)、N,N-二甲基氨基吡啶(1.2mg，0.01mmol)和在上述(1)中获得的TFCL异构体1(20.2mg，0.12mmol)，添加二氯甲烷溶剂(200μL)，并将所述混合物在室温搅拌反应。通过GC分析条件1分析反应混合物并确认目标物质的产生。将得到的反应混合物冷却到0℃，添加N,N’-二环己基碳二亚胺(24.7mg，0.12mmol)，并将所述混合物在室温反应3hr。在反应后，添加水(200μL)用于分配，并回收有机层。将所述有机层过滤，将得到的滤液在旋转蒸发仪中减压浓缩。将浓缩的残留物通过硅胶柱进行纯化，以得到作为油状物质的所需TFCL异构体1-RPPA酯。

TFCL异构体1-RPPA酯

GC-MS(CI:CH₄气体)：m/z＝301(M+H)，理论结构式C₁₆H₁₉F₃O₂，计算值为300.1337。

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)：

[表4]

eq：赤道；ax：轴

参比例8：TFCL(TFCL异构体2)的制备

(1)TFCL异构体2的制备

反应以与实施例1中相同的方式进行，区别在于将大肠埃希氏杆菌JM109/pKV32-YqjM的酶溶液更换成在参比例5和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKV32-NEMA的酶溶液，并将大肠埃希氏杆菌JM109/pKV32-Lkadh的酶溶液更换成在参比例6和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKV32-IsADH的酶溶液。

在反应完成后，向反应混合物添加MTBE，将所述混合物在室温搅拌并获得MTBE层(萃取物)。使用旋转蒸发仪从所述萃取物中蒸发掉MTBE，以得到TFCL异构体2。

(2)通过改良的Moscher方法制备TFCL异构体2-RPPA酯

在30mL试管中装入(R)-(-)-2-苯基丙酸(RPPA)(15mg，0.1mmol)、N,N-二甲基氨基吡啶(1.2mg，0.01mmol)和在上述(1)中获得的TFCL异构体2(20.2mg，0.12mmol)，添加二氯甲烷溶剂(200μL)，并将所述混合物在室温搅拌反应。通过GC分析条件1分析反应混合物并确认目标物质的产生。将得到的反应混合物冷却到0℃，添加N,N’-二环己基碳二亚胺(24.7mg，0.12mmol)，并将所述混合物在室温反应3hr。在反应后，添加水(200μL)用于分配，并回收有机层。将所述有机层过滤，将得到的滤液在旋转蒸发仪中减压浓缩。将浓缩的残留物通过硅胶柱进行纯化，以得到作为油状物质的所需TFCL异构体2-RPPA酯。

TFCL异构体2-RPPA酯

GC-MS(CI:CH₄气体)：m/z＝301(M+H)，理论结构式C₁₆H₁₉F₃O₂，计算值为300.1337。

¹H-NMR(CDCl₃,400MHz)：

[表5]

eq：赤道；ax：轴

从实施例1(2)中获得的TFCL异构体1-RPPA酯和参比例8(2)中获得的TFCL异构体2-RPPA酯的¹H-NMR和GC-MS的分析数据，支持了下述结构。

[表6]

从实施例1(2)中获得的TFCL异构体1-RPPA酯和参比例8(2)中获得的TFCL异构体2-RPPA酯的¹H-NMR，确定了1-位氢在赤道位置中，因为1-位质子的J值为2.7Hz或宽峰，并且所述值小。

总的来说，所述改良的Mocsher方法可以通过确认靠近苯环的质子向高磁场迁移这一现象来确定空间构型。

比较3-位质子的化学位移，确认了TFCL异构体1-RPPA酯与TFCL异构体2-RPPA酯相比从0.4ppm到0.5ppm向更高磁场迁移，并且TFCL异构体1-RPPA酯的苯环更靠近3-位质子(TFCL异构体1-RPPA酯：1.8ppm，TFCL异构体2-RPPA酯：2.2ppm-2.3ppm)。

从上述结果确定了在实施例1(1)中获得的TFCL异构体1是(1R,3R)-形式，并且在参比例8(1)中获得的TFCL异构体2是(1S,3S)-形式。

实施例2-11和比较例1-8：YqjM变体的初始活性的测量

YqjM变体的初始活性的测量活性，通过在340nm波长处测量在添加化合物(1)时NADPH的减少量来确认。将10μL酶溶液(实施例2：使用在参比例1和7中获得的酶溶液，实施例3-11和比较例1-8：使用在参比例4和7中获得的酶溶液)、25μL 1mol/L磷酸钾缓冲液(pH7)、10μL 8mmol/L NADPH、200μL水和5μL化合物(1)的DMSO溶液(0.1mol/L)混合。将所述混合物置于96孔板(由Corning制造)中，并使用加温至30℃的微孔板读板器(由MolecularBio制造)对340nm处吸光度的变化进行2min测量。计算每单位时间吸光度变化的平均值(mOD/min)，并通过下述公式从吸光度变化的斜率计算每单位时间/单位蛋白质的活性值。NADPH的摩尔吸光系数被计算为6.3mL/μmol·cm。

活性值(μmol/min/mg蛋白质)＝(-1)×吸光度变化的斜率×250μL/10μL/6300/0.55/蛋白质浓度

每种变体相对于野生型的相对活性示出在表7中。相对活性低于15％的情况用“―”示出。

[表7]

正如从表2清楚地看到的，发现将第26位的C用A替换(实施例7：YqjM变体10)或将第104位的A用F、Y、W或H替换(实施例8-11：YqjM变体11-14)显示出与野生型相比相对活性的显著提高。此外，发现将第26位的C用A替换并且将第104位的A用F、Y、W或H替换(实施例3-6：YqjM变体6-9)也显示出与野生型相比相对活性的显著提高。

另一方面，发现将第26位的C用W、D、F或Y替换(比较例1-5：YqjM变体1-5，比较例6-8：YqjM变体15-17)显示出与野生型相比相对活性的显著降低。具体来说，发现在C26W/A104F(比较例1：YqjM变体1)、C26W/A104Y(比较例2：YqjM变体2)和C26D/A104W(比较例6：YqjM变体15)中，对非专利文献2中描述的化合物的反应性和对本发明的化合物(1)的反应性差异极大。

实施例12-21：(R)-TFCH(化合物(2))的生产

将通过参比例1和7的方法制备的引入有pKV32-YqjM的重组大肠埃希氏杆菌的酶溶液或通过参比例4和7的方法制备的引入有pKV32-YqjM的重组大肠埃希氏杆菌的酶溶液(100μL)、50g/L KRED混合物N(由Codexis制造)(400μL)和化合物(1)(4.1mg)添加到2mL微量管，并通过在30℃搅拌1hr将所述混合物反应。向得到的反应混合物添加庚烷(1mL)，并将所述混合物在室温搅拌。将在静置后得到的上层在GC分析条件2下进行分析。化合物(1)向TFCH的转化率和得到的(R)-TFCH(化合物(2))的光学纯度示出在表8中。所述转化率和光学纯度通过下述公式计算。

[公式1]

C1：化合物(1)浓度[mmol/L]

C2(R)：(R)-TFCH浓度[mmol/L]

C2(S)：(S)-TFCH浓度[mmol/L]

[表8]

正如从表8清楚地看到的，发现将第26位的C用A替换的YqjM变体6–10(实施例13-17)与野生型相比显示出显著提高的转化率和光学纯度。此外，发现将第104位的A用F、Y、W或H替换的YqjM变体6-9(实施例13-16)显示出进一步提高的转化率和光学纯度。

实施例22：(1R,3R)-TFCL(化合物(3))的生产

将7mL 1mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)、0.7mL 50mmol/L NADP⁺、10.5mL 4mol/L葡萄糖溶液、33mL纯水、2873mg化合物(1)、8.4mL在参比例4和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKV32-YqjM(A104W(YqjM变体13))的酶溶液(等同于0.84g湿细菌)、4.2mL在参比例2和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKV32-Lkadh的酶溶液(等同于0.42g湿细菌)和6.1mL在参比例3和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKW32-BsGDH(E96A，Q252L)的酶溶液(等同于0.61g湿细菌)在200mL发酵罐中混合，并将所述混合物在28℃-30℃的反应温度下在足够的搅拌速度下反应17hr，并反应期间使用25重量％NaOH水溶液保持pH 7.0。

在反应完成后，向反应混合物添加35mL甲基叔丁基醚(在后文中被称为MTBE)，将所述混合物在室温搅拌，并获得含有(1R,3R)-TFCL的MTBE层。向得到的水性层再次添加MTBE(35mL)，将混合物在室温搅拌，并获得含有(1R,3R)-TFCL的MTBE层。作为得到的MTBE层在GC分析条件2下的纯度分析和光学纯度分析的结果，(1R,3R)-TFCL的纯含量为2348mg，得率为81.8％。光学纯度为99.8％e.e。非对映异构体为1.6％。光学纯度和非对映异构体的存在比率通过下述公式计算。

[公式2]

C3(RR)：(1R,3R)-TFCL浓度[mmol/L]

C3(SS)：(1S,3S)-TFCL浓度[mmol/L]

C3(RS)：(1R,3S)-TFCL浓度[mmol/L]

C3(SR)：(1S,3R)-TFCL浓度[mmol/L]

实施例23：(1R,3R)-TFCL(化合物(3))的生产

(1)(R)-TFCH(化合物(2))的生产

将50μL 1mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)、20μL 50mmol/L NAD⁺、20μL 50mmol/LNADP⁺、75μL 1mol/L葡萄糖溶液、8.2mg化合物(1)、在参比例1和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKV32-YqjM的酶溶液和在参比例3和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKW32-BsGDH(E96A，Q252L)的酶溶液在2mL微量管中混合，添加纯水以制备500μL反应混合物A。以与反应混合物A中相同的方式制备用于分析的反应混合物B，并将反应混合物A和B在30℃的反应温度和足够的搅拌速度下反应16hr。

在所述反应后，向反应混合物B添加庚烷(1mL)，并将混合物在室温搅拌1min。将在静置后获得的上层在GC分析条件2下进行分析。化合物(1)向化合物(2)的转化率为43.1％，并且得到的化合物(2)的光学纯度为67.8％ee。转化率和光学纯度通过下述公式计算。

[公式3]

C1：化合物(1)浓度[mmol/L]

C2(R)：(R)-TFCH浓度[mmol/L]

C2(S)：(S)-TFCH浓度[mmol/L]

(2)(1R,3R)-TFCL(化合物(3))的生产

将在上述(1)中获得的反应混合物A在30℃的反应温度和足够的搅拌速度下进一步反应8hr。向反应混合物A添加20μL 50mmol/L NAD⁺、20μL 50mmol/L NADP⁺、75μL 1mol/L葡萄糖溶液和100μL在参比例2和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKV32-Lkadh的酶溶液，并将所述混合物进一步反应16hr。向得到的反应混合物添加庚烷(1mL)，并将所述混合物在室温搅拌1min。将在静置后得到的上层在GC分析条件2下进行分析。得到的(1R,3R)-TFCL(化合物(3))的光学纯度为75.8％ee。非对映异构体存在比率为23.8％。光学纯度和非对映异构体存在比率通过下述公式计算。

[公式4]

C3(RR)：(1R,3R)-TFCL浓度[mmol/L]

C3(SS)：(1S,3S)-TFCL浓度[mmol/L]

C3(RS)：(1R,3S)-TFCL浓度[mmol/L]

C3(SR)：(1S,3R)-TFCL浓度[mmol/L]

实施例24：(1R)-3-三氟甲基-2-环己烯-1-醇(化合物(4))的生产

将50μL 1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、20μL 50mmol/L NAD⁺、20μL 50mmol/LNADP⁺、75μL 1mol/L葡萄糖溶液、8.2mg化合物(1)、在参比例2和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKV32-Lkadh的酶溶液和在参比例3和7中获得的大肠埃希氏杆菌JM109/pKW32-BsGDH(E96A，Q252L)的酶溶液在2mL微量管中混合，并添加纯水以制备500μL反应混合物。将所述混合物在30℃的反应温度和足够的搅拌速度下反应23hr。向得到的反应混合物添加庚烷(1mL)，并将所述混合物在室温搅拌1min。对在静置后得到的上层进行GC-MS分析并确认(1R)-3-三氟甲基-2-环己烯-1-醇(化合物(4))的产生。从实施例1、22和23(2)的结果推测得到的产物是(1R)-形式。化合物(1)向化合物(4)的转化率为43.6％。所述转化率从下述公式计算。

[公式5]

C1：化合物(1)浓度[mmol/L]

C4(R)：化合物(4)浓度[mmol/L]

C4(S)：化合物(4)(1S)-形式浓度[mmol/L]

[工业实用性]

根据本发明，可以提供一种以低成本、高光学纯度、高选择性和高效率工业化生产可用作合成各种不同药物产品的起始原料和中间体的(1R)-3-三氟甲基-2-环己烯-1-醇或(3R)-3-(三氟甲基)环己烷-1-酮的新方法。此外，使用由此获得的(1R)-3-三氟甲基-2-环己烯-1-醇或(3R)-3-(三氟甲基)环己烷-1-酮，可以以低成本高效地生产具有高光学纯度的(1R,3R)-3-(三氟甲基)环己烷-1-醇。

序列表

<110> 株式会社API

<120> (1R,3R)-3-(三氟甲基)环己烷-1-醇及其中间体的生产方法

<130> 092995

<150> US 62/836324

<151> 2019-04-19

<160> 10

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 338

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 1

Met Ala Arg Lys Leu Phe Thr Pro Ile Thr Ile Lys Asp Met Thr Leu

1 5 10 15

Lys Asn Arg Ile Val Met Ser Pro Met Cys Met Tyr Ser Ser His Glu

20 25 30

Lys Asp Gly Lys Leu Thr Pro Phe His Met Ala His Tyr Ile Ser Arg

35 40 45

Ala Ile Gly Gln Val Gly Leu Ile Ile Val Glu Ala Ser Ala Val Asn

50 55 60

Pro Gln Gly Arg Ile Thr Asp Gln Asp Leu Gly Ile Trp Ser Asp Glu

65 70 75 80

His Ile Glu Gly Phe Ala Lys Leu Thr Glu Gln Val Lys Glu Gln Gly

85 90 95

Ser Lys Ile Gly Ile Gln Leu Ala His Ala Gly Arg Lys Ala Glu Leu

100 105 110

Glu Gly Asp Ile Phe Ala Pro Ser Ala Ile Ala Phe Asp Glu Gln Ser

115 120 125

Ala Thr Pro Val Glu Met Ser Ala Glu Lys Val Lys Glu Thr Val Gln

130 135 140

Glu Phe Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala Lys Glu Ala Gly Phe Asp Val

145 150 155 160

Ile Glu Ile His Ala Ala His Gly Tyr Leu Ile His Glu Phe Leu Ser

165 170 175

Pro Leu Ser Asn His Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Pro Glu Asn

180 185 190

Arg Tyr Arg Phe Leu Arg Glu Ile Ile Asp Glu Val Lys Gln Val Trp

195 200 205

Asp Gly Pro Leu Phe Val Arg Val Ser Ala Ser Asp Tyr Thr Asp Lys

210 215 220

Gly Leu Asp Ile Ala Asp His Ile Gly Phe Ala Lys Trp Met Lys Glu

225 230 235 240

Gln Gly Val Asp Leu Ile Asp Cys Ser Ser Gly Ala Leu Val His Ala

245 250 255

Asp Ile Asn Val Phe Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Ala Glu Lys Ile

260 265 270

Arg Glu Gln Ala Asp Met Ala Thr Gly Ala Val Gly Met Ile Thr Asp

275 280 285

Gly Ser Met Ala Glu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Arg Ala Asp Leu Ile

290 295 300

Phe Ile Gly Arg Glu Leu Leu Arg Asp Pro Phe Phe Ala Arg Thr Ala

305 310 315 320

Ala Lys Gln Leu Asn Thr Glu Ile Pro Ala Pro Val Gln Tyr Glu Arg

325 330 335

Gly Trp

<210> 2

<211> 252

<212> PRT

<213> 开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefir）

<400> 2

Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr

1 5 10 15

Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala

35 40 45

Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala

50 55 60

Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala

65 70 75 80

Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser

85 90 95

Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser

100 105 110

Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg

115 120 125

Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile

130 135 140

Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys

145 150 155 160

Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu

165 170 175

Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys

180 185 190

Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln

195 200 205

Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala

210 215 220

Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly

225 230 235 240

Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 3

<211> 234

<212> PRT

<213> 芬兰毕赤酵母（Pichia finlandica）

<400> 3

Leu Ser Val Ala Lys Lys Phe Leu Gln Leu Gly Ala Lys Val Thr Ile

1 5 10 15

Ser Asp Val Ser Gly Glu Lys Lys Tyr His Glu Thr Val Val Ala Leu

20 25 30

Lys Ala Gln Asn Leu Asn Thr Asp Asn Leu His Tyr Val Gln Ala Asp

35 40 45

Ser Ser Lys Glu Glu Asp Asn Lys Lys Leu Ile Ser Glu Thr Leu Ala

50 55 60

Thr Phe Gly Gly Leu Asp Ile Val Cys Ala Asn Ala Gly Ile Gly Lys

65 70 75 80

Phe Ala Pro Thr His Glu Thr Pro Phe Asp Val Trp Lys Lys Val Ile

85 90 95

Ala Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Leu Leu Asp Lys Leu Ala Ile Asn

100 105 110

Tyr Trp Leu Glu Lys Ser Lys Pro Gly Val Ile Val Asn Met Gly Ser

115 120 125

Val His Ser Phe Val Ala Ala Pro Gly Leu Ala His Tyr Gly Ala Ala

130 135 140

Lys Gly Gly Val Lys Leu Leu Thr Gln Thr Leu Ala Leu Glu Tyr Ala

145 150 155 160

Ser His Gly Ile Arg Val Asn Ser Val Asn Pro Gly Tyr Ile Ser Thr

165 170 175

Pro Leu Ile Asp Glu Val Pro Lys Glu Arg Leu Asp Lys Leu Val Ser

180 185 190

Leu His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Arg Pro Glu Glu Val Ala Asp Ala

195 200 205

Val Ala Phe Leu Cys Ser Gln Glu Ala Thr Phe Ile Asn Gly Val Ser

210 215 220

Leu Pro Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

225 230

<210> 4

<211> 210

<212> PRT

<213> 核黄素德沃斯氏菌（Devosia riboflavina）

<400> 4

Leu Glu Gly Ala Gln Ala Val Ala Asp Ala Val Lys Ala Ala Gly Gly

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Val Ala Val Asp Val Ala Lys Ala Asp Gln Val Glu

20 25 30

Lys Ala Val Gln Phe Ala Val Asp Thr Phe Gly Ala Leu His Leu Ala

35 40 45

Val Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly Ala Ser Ala Pro Leu Gly Asp Tyr

50 55 60

Ser Phe Asp Asp Trp His Arg Val Ile Asp Val Asn Leu Asn Ser Val

65 70 75 80

Phe Tyr Ser Met Lys Tyr Glu Ile Val Ala Met Leu Arg Ala Gly Gly

85 90 95

Gly Ala Ile Val Asn Met Ala Ser Ile Leu Gly Ser Val Thr Phe Pro

100 105 110

Asn Ala Pro Ala Tyr Val Thr Ala Lys His Gly Val Val Gly Met Thr

115 120 125

Lys Ser Ala Ala Val Asp Tyr Ala Lys Lys Gly Ile Arg Val Thr Ala

130 135 140

Val Gly Pro Gly Phe Ile Asp Thr Pro Leu Leu Ser Ala Leu Pro Lys

145 150 155 160

Glu Thr Leu Asp Tyr Leu Lys Ser Val His Pro Ile Gly Arg Leu Gly

165 170 175

Thr Ser Asp Glu Val Ala Ala Leu Thr Ala Phe Leu Leu Ser Asp Ala

180 185 190

Ala Ser Asn Ile Thr Gly Ser Tyr His Leu Val Asp Gly Gly Tyr Val

195 200 205

Ala Gln

210

<210> 5

<211> 1017

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 5

atggccagaa aattatttac acctattaca attaaagata tgacgttaaa aaaccgcatt 60

gtcatgtcgc caatgtgcat gtattcttct catgaaaagg acggaaaatt aacaccgttc 120

cacatggcac attacatatc gcgcgcaatc ggccaggtcg gactgattat tgtagaggcg 180

tcagcggtta accctcaagg acgaatcact gaccaagact taggcatttg gagcgacgag 240

catattgaag gctttgcaaa actgactgag caggtcaaag aacaaggttc aaaaatcggc 300

attcagcttg cccatgccgg acgtaaagct gagcttgaag gagatatctt cgctccatcg 360

gcgattgcgt ttgacgaaca atcagcaaca cctgtagaaa tgtcagcaga aaaagtaaaa 420

gaaacggtcc aggagttcaa gcaagcggct gcccgcgcaa aagaagccgg ctttgatgtg 480

attgaaattc atgcggcgca cggatattta attcatgaat ttttgtctcc gctttccaac 540

catcgaacag atgaatatgg cggctcacct gaaaaccgct atcgtttctt gagagagatc 600

attgatgaag tcaaacaagt atgggacggt cctttatttg tccgtgtatc tgcttctgac 660

tacactgata aaggcttaga cattgccgat cacatcggtt ttgcaaaatg gatgaaggag 720

cagggtgttg acttaattga ctgcagctca ggcgcccttg ttcacgcaga cattaacgta 780

ttccctggct atcaggtcag cttcgctgag aaaatccgtg aacaggcgga catggctact 840

ggtgccgtcg gcatgattac agacggttca atggctgaag aaattctgca aaacggacgt 900

gccgacctca tctttatcgg cagagagctt ttgcgggatc cattttttgc aagaactgct 960

gcgaaacagc tcaatacaga gattccggcc cctgttcaat acgaaagagg ctggtaa 1017

<210> 6

<211> 759

<212> DNA

<213> 开菲尔乳杆菌（Lactobacillus kefir）

<400> 6

atgactgatc gtttaaaagg caaagtagca attgtaactg gcggtacctt gggaattggc 60

ttggcaatcg ctgataagtt tgttgaagaa ggcgcaaagg ttgttattac cggccgtcac 120

gctgatgtag gtgaaaaagc tgccaaatca atcggcggca cagacgttat ccgttttgtc 180

caacacgatg cttctgatga agccggctgg actaagttgt ttgatacgac tgaagaagca 240

tttggcccag ttaccacggt tgtcaacaat gccggaattg cggtcagcaa gagtgttgaa 300

gataccacaa ctgaagaatg gcgcaagctg ctctcagtta acttggatgg tgtcttcttc 360

ggtacccgtc ttggaatcca acgtatgaag aataaaggac tcggagcatc aatcatcaat 420

atgtcatcta tcgaaggttt tgttggtgat ccaactctgg gtgcatacaa cgcttcaaaa 480

ggtgctgtca gaattatgtc taaatcagct gccttggatt gcgctttgaa ggactacgat 540

gttcgggtta acactgttca tccaggttat atcaagacac cattggttga cgatcttgaa 600

ggggcagaag aaatgatgtc acagcggacc aagacaccaa tgggtcatat cggtgaacct 660

aacgatatcg cttggatctg tgtttacctg gcatctgacg aatctaaatt tgccactggt 720

gcagaattcg ttgtcgatgg tggatacact gctcaataa 759

<210> 7

<211> 765

<212> DNA

<213> 芬兰毕赤酵母（Pichia finlandica）

<400> 7

atgtcttata acttccataa caaggttgca gttgttactg gagctctatc aggaatcggc 60

ttaagcgtcg caaaaaagtt ccttcagctc ggcgccaaag taacgatctc tgatgtcagt 120

ggagagaaaa aatatcacga gactgttgtt gctctgaaag cccaaaatct caacactgac 180

aacctccatt atgtacaggc agattccagc aaagaagaag ataacaagaa attgatttcg 240

gaaactctgg caacctttgg gggcctggat attgtttgtg ctaatgcagg aattggaaag 300

ttcgctccca cccatgaaac acccttcgac gtatggaaga aggtgattgc tgtgaatttg 360

aatggagtat tcttactgga taagctagcc atcaattact ggctagagaa aagcaaaccc 420

ggcgtaattg tcaacatggg atcagtccac tcttttgtag cagctcctgg ccttgcgcat 480

tatggagctg caaaaggcgg tgtcaaactg ttaacacaaa cattggctct agagtacgca 540

tctcatggta ttagagtaaa ttctgtcaat ccggggtaca tttcgactcc tttgatagat 600

gaggttccga aagagcggtt ggataaactt gtaagcttgc accctattgg gagactaggt 660

cgtccagagg aagttgctga tgcagtcgca tttctgtgtt cccaggaggc cactttcatc 720

aacggcgttt ctttgccggt tgacgggggg tacacagccc agtaa 765

<210> 8

<211> 753

<212> DNA

<213> 核黄素德沃斯氏菌（Devosia riboflavina）

<400> 8

atgtcccagg atttttcagg caaggtcgca ttcgtaacgg gtggtgcctc gggcatcggt 60

gaggcggtcg tcaagcagct tgccgcgcgc ggcgccaagg ttgtggttgc cgatctcaag 120

ctcgaaggcg cgcaggcggt tgccgatgcg gtcaaggccg ccggcggcga agcggccgcg 180

gtagctgtcg atgtcgccaa ggccgatcag gtggagaagg ctgtccagtt cgccgtcgac 240

acctttggcg ccctgcatct ggcggtcaat aatgccggca ttggcggcgc ttccgctccc 300

ctcggcgatt attccttcga cgactggcat agggttatcg acgtcaatct caattccgtc 360

ttctattcga tgaagtacga gatcgtcgcc atgctcaggg caggcggtgg cgccatcgtc 420

aacatggcct ccatcctcgg ctcggtgacc tttcccaatg caccggccta tgtcaccgcc 480

aagcacggcg tggtcggcat gaccaagtcg gccgcggtgg actatgccaa aaagggcatt 540

cgcgtcacgg ccgtcgggcc cggtttcatc gacacgccgc tcctatccgc cttgcccaag 600

gaaaccctgg actacctcaa atccgtccat ccgatcggac ggctgggtac ctcggatgaa 660

gtcgcagcgc tgaccgcgtt cctgctctcc gatgcagcgt cgaacatcac cggctcctat 720

cacctggtcg atggcggcta cgtcgcccaa tag 753

<210> 9

<211> 261

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 9

Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala

1 5 10 15

Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val

35 40 45

Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly

50 55 60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Ala

85 90 95

Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val

100 105 110

Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 10

<211> 786

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）

<400> 10

atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60

aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120

aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180

gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240

aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgcaaa tcctgtgcca 300

tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360

tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420

attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca 480

agtaaaggcg ggataaagct gatgacagaa acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540

attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc tgaaaaattc 600

gctgacccta aacagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660

ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720

ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acactgtatc cttcattcca ggcaggccgc 780

ggttaa 786