具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

一种手参组织培养无菌体系建立的方法，包括如下步骤：

1)采集：采集有1-2cm长健壮芽的手参，经初步清洗后将芽从手参上完整的分离下来，轻剥去掉最外层1-2层叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡 15min，并用软毛刷轻轻刷表面，再用流水冲洗2h后，置于超净工作台上；

2)消毒：用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用质量分数为0.1％氯化汞消毒5-10min，无菌水冲洗5次，每次冲洗2min以上；

3)诱导培养：将步骤2)消毒后的手参芽接种在诱导培养基上培养，所述诱导培养基为MS培养基+6-KT 0.3-0.9mg/L+6-BA 0.6-1.2mg/L+NAA 0.6-1.2mg/L+PVP 20-50mg/L+香蕉泥10-40g/L+琼脂5.8g/L+蔗糖30g/L， pH5.8-6.2。

MS培养基是一种植物组织培养技术中常用基本培养基配方，内容组成固定不变，其配方如表1所示：

表1MS培养基成分表

NAA(萘乙酸)是植物生长素的一种，可促进植物细胞分化，在适宜浓度下与细胞分裂素结合可促进苗芽再生与增殖；

6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)是植物细胞分裂素的一种，可促进植物细胞分裂及伸长在茎尖或芽培养中，可以打破顶端优势，促进侧芽和丛生芽的产生于增殖；

6-KT(6-糠氨基嘌呤)，植物细胞分裂素的一种；

PVP(聚乙烯吡咯烷酮K30)，对外植体褐化有抑制效果，其作用机理为 PVP为酚类物质的专一吸附剂，PVP中CO-N＝基有很强的络合多酚化合物的能力，它能使多酚化合物不能成为多酚氧化酶的底物，从而抑制褐化的发生；

香蕉泥：普通香蕉捣成泥后加入培养基中熬制即可；

诱导培养基中的6-BA、6-KT、PVP、NAA与香蕉泥协同配合提高对手参外植体的诱芽率，加强腋芽长势，有效地减轻褐化发生。

进一步地，在步骤2)中，所述用质量分数为0.1％氯化汞消毒时间为 8min。

进一步地，在步骤3)中，所述诱导培养基为：MS培养基+6-KT 0.3mg/L+6-BA1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+PVP 40mg/L+香蕉泥30g/L+琼脂 5.8g/L+蔗糖30g/L，pH为6.2。

进一步地，在步骤3)中，所述培养条件为，在25℃条件下，暗培养7d 后转至2000lx光照强度下培养25d。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种手参组织培养无菌体系建立的方法进行详细说明。

实施例1

1)采集有健壮芽(1-2cm长)的手参，经初步清洗后将芽从手参上完整的分离下来，轻剥去掉最外层1-2层叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡15min，并用软毛刷轻轻刷表面，再用流水冲洗2h后，置于超净工作台上；

2)用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用质量分数为0.1％氯化汞分别消毒5、6、7、8、9、10min，无菌水冲洗5次，每次冲洗2min以上；

3)将消毒后的手参芽接种在诱导培养基(MS+6-KT 0.3mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA1.0mg/L+PVP 40mg/L)上，每组接5瓶，每瓶接种1个外植体，且设置2组重复实验；每瓶在25℃条件下，暗培养7d后转至2000lx光照强度下培养25d，统计污染情况及芽成活率。

实施结果如表2所示：

表2消毒时间梯度试验结果表

由表2可知，随着消毒时间的增加，污染率逐渐降低，消毒时间为8、9、 10分钟时，污染率降为0，消毒效果良好，但成活率降低，可能是消毒剂刺激导致外植体死亡，因此，消毒8分钟时污染率最低，外植体成活率最高为 80％，为手参外植体最适消毒时间。

实施例2

1)采集有健壮芽(1-2cm长)的手参，经初步清洗后将芽从手参上完整的分离下来，轻剥去掉最外层1-2层叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡15min，并用软毛刷轻轻刷表面，再用流水冲洗2h后，置于超净工作台上；

2)用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用质量分数为0.1％氯化汞消毒8min，无菌水冲洗5次，每次冲洗2min以上；

3)分别以不同浓度6-KT、6-BA、NAA和培养基不同pH值，设计4因素4水平正交实验，将消毒后的手参芽按照表3所示接种在不同激素及不同pH 值组成的诱导培养基，每组接5瓶，每瓶接种1个外植体，且设置2组重复实验；每瓶在25℃条件下，暗培养7d后转至2000lx光照强度下培养25d，统计腋芽诱导情况及褐化情况，分别用“+、++、+++”表示腋芽长势，“+”越多代表腋芽长势越好。

实施结果如表3所示：

表3激素水平正交实验设计及结果表

由表3可知，组别3的腋芽诱导率最高为70％，同时褐化率也较低为40％，腋芽长势最好，因此最佳激素组合为0.3mg/L 6-KT+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA，培养基最适pH值为6.2。

实施例3

1)采集有健壮芽(1-2cm长)的手参，经初步清洗后将芽从手参上完整的分离下来，轻剥去掉最外层1-2层叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡15min，并用软毛刷轻轻刷表面，再用流水冲洗2h后，置于超净工作台上；

2)用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用质量分数为0.1％氯化汞消毒8min，无菌水冲洗5次，每次冲洗2min以上；

3)将消毒后的手参芽接种诱导培养基(MS+6-KT0.3mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA1.0mg/L+琼脂5.8g/L+蔗糖30g/L，pH为6.2)上，同时在培养基内添加如表4所示的不同浓度的PVP和不同浓度的香蕉泥，每组接5瓶，每瓶接种1个外植体，且设置2组重复实验，以添加0mg/LPVP、0g/L香蕉泥为空白组(CK)；每瓶在25℃条件下，暗培养7d后转至2000lx光照强度下培养25d，统计外植体褐化情况及腋芽长势变化，分别用“+、++、+++、 ++++”表示腋芽长势，“+”越多代表腋芽长势越好。

表4PVP与香蕉泥的添加浓度设计表

实施结果如表5所示：

表5PVP与香蕉泥的添加浓度试验结果表

由表5可知，当PVP浓度为40、50mg/L时，褐化率最低为10％，相比于空白组(CK)褐化率降低了30％，抑制褐化效果显著，50mg/L的添加量比 40mg/L更多；当香蕉泥浓度为30g/L时，腋芽长势最好，香蕉泥对腋芽分化效果显著；因此选择添加40mg/LPVP、30g/L香蕉泥，实现最优抑制褐化效果，对腋芽分化效果显著的同时符合经济效益。

综上可知，本发明的最优消毒方法为用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再用质量分数为0.1％氯化汞分别消毒8min，无菌水冲洗5 次，每次冲洗2min以上；最适诱导培养基为MS培养基+6-KT 0.3mg/L+6-BA 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+PVP 40mg/L+香蕉泥30g/L+琼脂5.8g/L+蔗糖30g/L， pH为6.2；本发明方法可获得手参组织培养无菌体系，有效地避免病毒感染，提高繁殖系数，利于满足大规模生产的需要，为手参组培快繁提供原材料，并且为手参规模化育苗奠定基础。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。