一种柔毛淫羊藿无菌体系的建立及快速增殖的方法
阅读说明：本技术 一种柔毛淫羊藿无菌体系的建立及快速增殖的方法 (Method for establishing and rapidly proliferating Epimedium pubescens sterile system ) 是由 林良科 王旭东 于 2021-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明属于药用植物组织培养技术领域,尤其涉及一种柔毛淫羊藿无菌体系的建立及快速增殖的方法,包括如下步骤：1)采集淫羊藿幼嫩根状茎,去掉叶片,用洗衣粉饱和溶液浸泡30min,并用刷子轻轻刷表面,再用流水冲洗2h后,置于超净工作台上,消毒,用无菌手术剪剪掉根状茎两端各2mm,得到带完整芽点的无菌茎段,备用；2)将步骤1)获得的无菌茎段垂直接种到诱导培养基上培养,诱导出芽；3)将步骤2)获得的萌蘖芽切为单个芽点,垂直接种到增殖培养基上培养,得到淫羊藿丛生芽；本发明方法可获得淫羊藿快速增殖的方法,可为淫羊藿人工繁育提供优质种苗,解决了淫羊藿因种子采集困难、发芽率低而育苗困难的难题。(The invention belongs to the technical field of medicinal plant tissue culture, and particularly relates to a method for establishing and rapidly proliferating a epimedium dauricum sterile system, which comprises the following steps: 1) collecting young and tender rhizome of herba Epimedii, removing leaves, soaking in washing powder saturated solution for 30min, brushing the surface with a brush, washing with flowing water for 2 hr, placing on a clean bench, sterilizing, and shearing off 2mm of each end of the rhizome with sterile surgical scissors to obtain sterile stem segment with complete bud point; 2) vertically inoculating the sterile stem section obtained in the step 1) to an induction culture medium for culture, and inducing germination; 3) cutting the shoot buds obtained in the step 2) into single shoot points, vertically inoculating the shoot points to a proliferation culture medium, and culturing to obtain epimedium clustered buds; the method can obtain the method for quickly proliferating the epimedium, can provide high-quality seedlings for the artificial breeding of the epimedium, and solves the problem of difficult seedling culture of the epimedium due to difficult seed collection and low germination rate.)
技术领域
本发明属于药用植物组织培养技术领域，尤其涉及一种柔毛淫羊藿无菌体系的建立及快速增殖的方法。
背景技术
柔毛淫羊藿为《中华人民共和国药典》(2020年版)淫羊藿收载品种原植物之一，是我国传统中药材，主要有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，在我国已有2000多年的应用历史。现代科研人员在其体内发现总黄酮、多糖、生物碱等多种生理活性的化学成分,目前在传统医学及现代医学中应用广泛。当前淫羊藿的市场需求量约为5000吨/年,主要的获取方式仍然为采挖野生资源,随着采挖量增大和人们的无序采挖，野生淫羊藿资源的不断减少，非常不利于资源的再生和可持续利用。因此人工引种栽培淫羊藿就显得迫在眉睫。
自然条件下，柔毛淫羊藿种子由于自然休眠及种胚后熟作用，种子萌发率极低且发芽周期长，非常不利于淫羊藿的规模化种植。现在淫羊藿人工种植基本采用分株繁殖的方式，长期无性繁殖容易导致品种退化，药材产量、质量下降。
发明内容
本发明方法可获得淫羊藿无菌体系及快速增殖的方法，可为淫羊藿人工繁育提供优质种苗，解决了淫羊藿因种子采集困难、发芽率低而育苗困难难题。
本发明提供了一种柔毛淫羊藿无菌体系的建立及快速增殖的方法，包括如下步骤：
1)采集淫羊藿幼嫩根状茎，去掉叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗2h后，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再消毒，用无菌手术剪剪掉根状茎两端各2mm，得到带完整芽点的无菌茎段，备用；
2)将步骤1)获得的无菌茎段垂直接种到诱导培养基上培养，诱导出芽；所述诱导培养基为MS+0.5-2.0mg/L 6-BA+0.3-1.1mg/L IBA+40-70mg/L PVP+80-140mg/L链霉素+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖；
3)将步骤2)获得的萌蘖芽切为单个芽点，垂直接种到增殖培养基上培养，在温度为25℃、光照强度为2300-2500lx、光照时长为12h/d条件下培养28d，得到淫羊藿丛生芽；所述增殖培养基为MS+1.5-2.5mg/L6-BA+0.3-0.9mg/L NAA+60mg/L PVP+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖。
进一步地，在步骤1)中，所述再消毒的方法为：用质量分数为0.1％升汞消毒4min，无菌水冲洗5次，再次用质量分数为0.1％升汞消毒2.5min，无菌水冲洗5次。
进一步地，在步骤2)中，所述培养条件为在25℃条件下暗培养7d，然后将培养基转至25℃、光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养18d。
进一步地，在步骤2)中，所述诱导培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.8mg/L IBA+60mg/L PVP+120mg/L链霉素+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖，调节pH为5.8。
进一步地，在步骤3)中，所述增殖培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+60mg/L PVP+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖，调节pH为5.8。
本发明的有益效果是：本发明采用淫羊藿的芽为外植体，通过丛生芽途径建立柔毛淫羊藿的快速增殖无菌体系；结合消毒、诱导培养与增殖培养建立柔毛淫羊藿的快速增殖无菌体系，降低污染率，提高淫羊藿的产量及质量；本发明流程简单，繁殖周期短，为淫羊藿种苗繁育及规模化繁殖提供技术指导，解决了淫羊藿种子发芽率低，发芽周期长而导致的育苗难的问题，降低了淫羊藿种苗繁育成本，为淫羊藿人工繁育提供优质种苗。
附图说明
图1为本发明升汞消毒组合对外植体消毒影响折线图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明提供一种柔毛淫羊藿无菌体系的建立及快速增殖的方法，包括如下步骤：
1)采集淫羊藿幼嫩根状茎，去掉叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗2h后，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，再消毒，用无菌手术剪剪掉根状茎两端各2mm，得到带完整芽点的无菌茎段，备用；
2)将步骤1)获得的无菌茎段垂直接种到诱导培养基上培养，诱导出芽；所述诱导培养基为MS+0.5-2.0mg/L 6-BA+0.3-1.1mg/L IBA+40-70mg/L PVP+80-140mg/L链霉素+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖；
3)将步骤2)获得的萌蘖芽切为单个芽点，垂直接种到增殖培养基上培养，在温度为25℃、光照强度为2300-2500lx、光照时长为12h/d条件下培养28d，得到淫羊藿丛生芽；所述增殖培养基为MS+1.5-2.5mg/L6-BA+0.3-0.9mg/L NAA+60mg/L PVP+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖。
用无菌手术剪剪掉根状茎两端各2mm的作用是切除受消毒剂刺激较严重的部分，保证无菌茎段后续正常培养；
其中，MS培养基是一种植物组织培养技术中常用基本培养基配方，内容组成固定不变，其配方如表1所示：
表1MS培养基成分表
此外，6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)是植物细胞分裂素的一种，可促进植物细胞分裂及伸长在茎尖或芽培养中，可以打破顶端优势，促进侧芽和丛生芽的产生于增殖；
IBA(吲哚丁酸)是植物生长素的一种，可促进植物苗芽再生与增殖；
PVP(聚乙烯吡咯烷酮K30)，对外植体褐化有抑制效果，其作用机理为PVP为酚类物质的专一吸附剂，PVP中CO-N＝基有很强的络合多酚化合物的能力，它能使多酚化合物不能成为多酚氧化酶的底物，从而抑制褐化的发生；
链霉素，72％硫酸链霉素，对细菌有抑制效果，诱导培养基中添加适量浓度的链霉素可抑制外植体内生菌污染，降低污染率，提高诱导率；
NAA(萘乙酸)是植物生长素的一种，可促进植物细胞分化，在适宜浓度下与细胞分裂素结合可促进苗芽再生与增殖；
诱导培养基中的6-BA、IBA、PVP与链霉素协同配合提高对柔毛淫羊藿外植体的诱芽率，同时降低外植体的污染率及褐化率；
增殖培养基中的6-BA、NAA与PVP协同配合提高柔毛淫羊藿丛生芽增殖倍数，同时降低丛生芽的褐化率。
进一步地，在步骤1)中，所述再消毒的方法为：用质量分数为0.1％升汞消毒4min，无菌水冲洗5次，再次用质量分数为0.1％升汞消毒2.5min，无菌水冲洗5次。
进一步地，在步骤2)中，所述培养条件为在25℃条件下暗培养7d，然后将培养基转至25℃、光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养18d。
进一步地，在步骤2)中，所述诱导培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.8mg/L IBA+60mg/L PVP+120mg/L链霉素+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖，调节pH为5.8。
进一步地，在步骤3)中，所述增殖培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+60mg/L PVP+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖，调节pH为5.8。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种柔毛淫羊藿无菌体系的建立及快速增殖的方法进行详细说明。
实施例1
1)采集淫羊藿幼嫩根状茎，去掉叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗2h后，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次后，用质量分数为0.1％的升汞按照表2所示的消毒组合进行消毒，无菌水冲洗5次，每次90s以上，再用无菌手术剪剪掉根状茎两端各2mm，得到带完整芽点的无菌茎段，备用；
表2升汞消毒组合试验设计表
2)将步骤1)获得的无菌茎段垂直接种到诱导培养基(MS+1.5mg/L6-BA+0.8mg/LIBA+60mg/L PVP+120mg/L链霉素+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8)上培养，每组接种10瓶，每瓶接种1个外植体；将接种后的诱导培养基在25℃条件下暗培养7d，然后将培养基转至25℃、光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养；
3)培养1-10d内观察统计污染外植体数量和被升汞消毒时间过长而损伤死亡的外植体数量，培养10d之后出现的污染即不视为外植体消毒不彻底导致的污染。
实施结果如表3所示：
表3升汞消毒组合试验结果表
将外植体污染率与外植体消毒死亡率绘制成图，结果如图1所示。
图1为升汞消毒组合对外植体消毒影响折线图，由图1与表3可知，仅采用一次消毒(组合1-4)，随着消毒时间的增加，外植体污染率不断降低，外植体消毒死亡率却不断增加；采用分段二次消毒(组合5-10)，随着第二次消毒时间的增加，外植体污染率由高变低，外植体消毒死亡率逐渐增加；消毒组合7和组合9的外植体损失率最低，为30％，消毒组合7消毒时间较短，故采用组合7为最适消毒时间，即用质量分数为0.1％升汞消毒4min，无菌水冲洗5次，再次用质量分数为0.1％升汞消毒2.5min，无菌水冲洗5次，外植体污染率低且消毒死亡率低，消毒时间较短，利于实现经济效益。
实施例2
1)采集淫羊藿幼嫩根状茎，去掉叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗2h后，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，用质量分数为0.1％升汞消毒4min，无菌水冲洗5次，再次用质量分数为0.1％升汞消毒2.5min，无菌水冲洗5次，用无菌手术剪剪掉根状茎两端各2mm，得到带完整芽点的无菌茎段，备用；
2)将步骤1)获得的无菌茎段垂直接种到如表4所示的单一激素的培养基上，每组接种10瓶，每瓶接种1个外植体，并设置2组重复实验；25℃条件下暗培养7d，然后将培养基转至25℃、光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养；
表4单一激素培养基设计表
3)统计外植体出芽率及芽子长势。芽子长势分别用+、++、+++表示芽子长势从差到好。
实施结果如表5所示：
表5单一激素培养基试验结果表
由表5可知，单独用细胞分裂素时，6-BA的效果好于6-KT，并且6-BA浓度在1.5mg/L时芽子长势较好；在单独用生长素时，IBA的效果好于NAA，并且IBA浓度在0.9mg/L时芽子长势较好，故柔毛淫羊藿外植体对激素6-BA、IBA较敏感，诱芽效果较好。
实施例3
1)采集淫羊藿幼嫩根状茎，去掉叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗2h后，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，用质量分数为0.1％升汞消毒4min，无菌水冲洗5次，再次用质量分数为0.1％升汞消毒2.5min，无菌水冲洗5次，用无菌手术剪剪掉根状茎两端各2mm，得到带完整芽点的无菌茎段，备用；
2)将步骤1)获得的无菌茎段垂直接种到如表6所示的不同浓度激素组合的诱导培养基上培养，每组接种10瓶，每瓶接种1个外植体，并设置2组重复实验；25℃条件下暗培养7d，然后将培养基转至25℃、光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养18d；
表6不同浓度激素组合的诱导培养基设计表
序号
6-BA(mg/L)
IBA(mg/L)
1
1.3
0.7
2
1.5
0.8
3
1.7
0.9
4
--
1.0
5
--
1.1
3)统计外植体出芽率及芽子长势。芽子长势分别用+、++、+++表示芽子长势从差到好。
实施结果表7所示：
表7不同浓度激素组合的诱导培养基试验结果表
组合
6-BA(mg/L)
IBA(mg/L)
诱导率
芽子长势
1
13
07
45％
+
2
13
08
50％
++
3
13
09
55％
++
4
13
10
50％
++
5
13
11
4％
+
6
15
07
50％
++
7
15
08
70％
+++
8
15
09
65％
+++
9
15
10
50％
+++
10
1.5
1.1
45％
++
11
1.7
0.7
35％
+
12
1.7
0.8
50％
++
13
17
09
50％
++
14
17
10
45％
+
15
17
11
40％
+
由表7可知，在组合7即6-BA为1.5mg/L、IBA为0.8mg/L时，外植体诱导率最高为70％，同时芽子长势也最好。说明激素组合7对于柔毛淫羊藿外植体诱导效果最佳。
实施例4
1)采集淫羊藿幼嫩根状茎，去掉叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗2h后，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，用质量分数为0.1％升汞消毒4min，无菌水冲洗5次，再次用质量分数为0.1％升汞消毒2.5min，无菌水冲洗5次，用无菌手术剪剪掉根状茎两端各2mm，得到带完整芽点的无菌茎段，备用；
2)将步骤1)获得的无菌茎段垂直接种到如表8所示的分别添加了不同浓度PVP和不同浓度链霉素的诱导培养基(MS+1.5mg/L 6-BA+0.8mg/L IBA+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8)上培养，每组接种10瓶，每瓶接种1个外植体，并设置2组重复实验；25℃条件下暗培养7d，然后将培养基转至25℃、光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养18d；
表8 PVP与链霉素的浓度设计表
序号
PVP(mg/L)
链霉素(mg/L)
1
40
80
2
50
100
3
60
120
4
70
140
3)观察统计外植体褐化数量及褐化率、外植体内生菌污染数量及污染率。
实施结果如表9所示：
表9 PVP与链霉素不同浓度试验结果表
由表9可知，PVP浓度为60mg/L，外植体褐化率最低，虽PVP浓度为70mg/L时，褐化率也为10％，但芽子长势明显不如PVP浓度为60mg/L时的长势，可能是PVP浓度过高对芽点生长有抑制效果；链霉素浓度为140、160mg/L时污染率最低，但芽点生长均受到抑制，故链霉素为120mg/L时对柔毛淫羊藿外植体生长最有利。
实施例5
1)采集淫羊藿幼嫩根状茎，去掉叶片，用洗衣粉饱和溶液浸泡30min，并用刷子轻轻刷表面，再用流水冲洗2h后，置于超净工作台上，用体积分数为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，用质量分数为0.1％升汞消毒4min，无菌水冲洗5次，再次用质量分数为0.1％升汞消毒2.5min，无菌水冲洗5次，用无菌手术剪剪掉根状茎两端各2mm，得到带完整芽点的无菌茎段，备用；
2)将步骤1)获得的无菌茎段垂直接种到诱导培养基上(MS+1.5mg/L6-BA+0.8mg/LIBA+60mg/L PVP+120mg/L链霉素+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8)培养，25℃条件下暗培养7d，然后将培养基转至25℃、光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养18d，诱导出芽；
(3)将步骤2)获得的萌蘖芽切为单个芽点，垂直接种到如表10所示的不同激素组合的增殖培养基上培养，每组接种10瓶，每瓶接种1个外植体，并设置2组重复实验，在25℃，光照强度2300-2500lx，光照时长12h/d条件下培养28d，观察统计淫羊藿丛生芽增殖倍数及长势，丛生芽长势以株高和芽子粗壮程度为指标，分别用+、++、+++表示芽子长势从差到好。
表10不同激素组合增殖培养基设计表
实施结果如表11所示：
表11不同激素组合增殖培养基试验结果表
由表11可知，当NAA浓度在0.5mg/L时，柔毛淫羊藿丛生芽增殖倍数普遍较高，丛生芽长势也较好；当6-BA浓度从1.5mg/L提高到2.0mg/L时，增殖倍数逐渐增高，丛生芽长势也逐渐趋好，随着6-BA的浓度继续升高，增殖倍数开始下降，可能是6-BA浓度偏高，抑制了丛生芽的分化，故最适增殖的激素组合为6-BA的浓度为2.0mg/L，NAA的浓度为0.5mg/L，此时增殖倍数最大为3.9，丛生芽长势也最好。
综上可知，本发明的最优再消毒方法为用质量分数为0.1％升汞消毒4min，无菌水冲洗5次，再次用质量分数为0.1％升汞消毒2.5min，无菌水冲洗5次；最适诱导培养基为MS+1.5mg/L6-BA+0.8mg/L IBA+60mg/L PVP+120mg/L链霉素+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8；最适增殖培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+60mg/L PVP+5.8g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH为5.8；本发明流程简单，繁殖周期短，增殖倍率达到3.9，为淫羊藿种苗繁育及规模化繁殖提供技术指导，解决了淫羊藿种子发芽率低，发芽周期长而导致的育苗难的问题，降低了淫羊藿种苗繁育成本，为淫羊藿人工繁育提供优质种苗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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