发明内容

本发明的目的是提供一种基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒。本发明的另一目的是提供该基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的应用。

本发明以牛骨肽为基础，基于牛骨肽的特性，改变其二级结构并使其与其他营养多肽共架复合，形成新的稳定的二级结构，进而将其制备为多肽纳米颗粒。通过共架复合体系的形成，增加了各多肽的溶解性和分散性，且纳米颗粒具有较高的粒径均一性和稳定性。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒，其制备原料包括牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白。

本发明对能够与牛骨肽形成稳定的共架复合体系的多肽进行了大量的筛选，发现与其他蛋白相比，大米蛋白和酪蛋白形成的多肽能够很好地与牛骨肽进行共架复合，形成稳定的二级结构。

在多肽纳米颗粒制备时，所述原料中，牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的质量比优选为1:1:(0.2-1)。将上述三种多肽的质量控制在上述范围内，能够更好地促进三种多肽形成稳定的共架复合体系。更优选的牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的质量比为1:1:(0.5-1)。

优选地，上述制备原料中，牛骨肽的分子量为750-850Da，大米蛋白的分子量为30-40kDa，酪蛋白的分子量为30-50kDa。

将上述三种多肽分子量控制在上述范围内，能够更好地促进三种多肽形成稳定的共架复合体系。

在多肽纳米颗粒的制备过程中，需要将牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白先进行溶解和结构展开，该步骤操作需要在碱性调节下进行，本发明发现，对于上述牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白，将其置于pH≥11的碱性水溶液中，能够促进其溶解和结构展开，有利于后续新的二级结构的形成。

因此，除牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白外，所述原料还包括碱性溶液，所述碱性溶液的用量为将牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白混合后的水溶液调节至pH≥11。

对于用于调节pH的碱性溶液的种类，可在符合《食品添加剂使用卫生标准》的碱性溶液中进行选择。

用于调节体系pH的碱性溶液的浓度优选为0.1mol/L～1mol/L。

在上述pH范围内的碱性溶液中，优选氢氧化钠水溶液、氢氧化钙水溶液、氢氧化钾水溶液中的一种或多种的混合物作为碱性溶液。

本发明发现，采用上述碱性溶液能够在保证牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的溶解和结构充分展开、改变各蛋白质二级结构间的相互作用的同时，不破坏其一级结构，最大程度地保留各多肽的功能。

在多肽纳米颗粒的制备过程中，将牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白进行结构展开后，需要利用酸碱中和将体系的pH回调，以使得三种多肽相互作用，形成稳定的共架复合体系。

基于此，所述原料还包括酸性溶液，所述酸性溶液的用量为将使用碱性溶液调节pH后的原料体系调节至pH为6-8。本发明发现，将体系pH控制在6-8范围内，更有利于牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的多肽相互作用，形成稳定的共架复合体系。

对于酸性溶液，可在符合《食品添加剂使用卫生标准》的酸性溶液进行选择。

用于调节体系pH的酸性溶液的浓度优选为0.01mol/L～0.1mol/L。

在上述pH范围内的酸性溶液中，优选盐酸水溶液、柠檬酸水溶液、醋酸水溶液中的一种或多种的混合物作为酸性溶液。

本发明发现，采用上述酸性溶液能够更有利于牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的多肽相互作用，形成稳定的共架复合体系。

本发明制备的基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的平均粒径范围优选为50-200nm。优选为80-120nm。

本发明所述的基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒为利用上述原料采用包括如下步骤的方法制备得到：将牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白混合后，再与水混合，添加碱性溶液调节体系的pH≥11，水化，添加酸性溶液调节体系的pH为6-8，使蛋白质之间共架结合。

具体而言，将牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白混合，分散在水中，添加适量碱性溶液使得pH≥11，搅拌水化，加入酸性溶液进行酸碱中和，使得不同蛋白质间通过相互作用形成共架复合物。

在上述方法中，与水混合时，牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的总质量与水的质量比为1：(90-110)。

水化的作用为使得牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的结构展开，优选的水化条件为：500-990r/min搅拌速率下均匀搅拌20-60min。

在水化后加入酸性溶液回调pH后，共架结合的条件为：在500-990r/min搅拌速率下均匀搅拌60-120min。

以上所述的制备方法还包括：经共架结合后，进行透析除盐、去除不可溶性杂质和冷冻干燥的步骤。

其中，去除不可溶性杂质可采用离心、过滤等方法。

本发明还提供所述基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法，其包括如下步骤：将牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白混合后，再与水混合，添加碱性溶液调节体系的pH≥11，水化，添加酸性溶液调节体系的pH为6-8，使得蛋白质之间共架结合。

作为本发明的优选方案，所述基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：

(1)调碱溶解：将牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白以1:1:0.5-1:1:1的质量比加入到三种蛋白总质量90-110倍质量的水中，滴加适量碱性溶液，调节体系的pH≥11，充分搅拌溶解；

(2)结构展开：将步骤(1)所得到的料液在500-990r/min搅拌速率下均匀搅拌20-60min，使得牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的高级空间结构充分展开；

(3)共架结合：向步骤(2)所得到的料液中滴加适量酸性溶液，调节整体pH为6-8，在500-990r/min搅拌速率下均匀搅拌60-120min，使得呈现展开状态的不同蛋白质间相互作用形成共架复合物；

(4)透析除盐：将步骤(3)所得到的料液置于透析袋中，加入料液15-20倍体积的水透析18-36h，除去制备过程中产生的杂质盐；

(5)离心去杂：将步骤(4)所得到的料液在4000-8000g条件下高速离心15-25min，除去不可溶性杂质，保留上清液；

(6)冷冻干燥：将步骤(5)所得到的上清液进行冷冻干燥，得到粒径范围为50-200nm的纳米颗粒，即以牛骨肽为主要原料的纳米颗粒成品。

本发明提供的基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒不仅具有牛骨肽、大米蛋白和酪蛋白的营养和功能，而且具有较好的溶解性和分散性，粒径均一，溶解体系稳定，可用于多肽类食品、药品和保健品的制备。

本发明还提供基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒在食品、药品或保健品制备中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒，针对蛋白质的二级结构进行结构改性，通过多肽之间的相互作用改变蛋白质的二级结构：首先，通过碱溶液调节pH使得蛋白质在碱性环境中二级结构充分展开；然后，通过加入酸溶液进行酸碱中和使得不同蛋白质间相互作用；最后，将料液调节至可食用范围，不同蛋白质复合形成新的二级结构，达到较强的稳定性。本发明提供的基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法能够在不破坏一级结构的前提下，完整保留原料蛋白质主要亚基，使得不同蛋白质间营养特性和功能特性得到互补增强，改善牛骨肽的潜在应用价值；同时，该三元多肽纳米颗粒具有良好的溶解性，溶解度可达到90％以上，具有良好的分散性，粒径均一，纳米颗粒的水溶液和粉末均具有较高的稳定性，具有较好的应用价值。

2、本发明提供的基于牛骨肽的三元多肽纳米颗粒的制备方法，相对于传统牛骨肽的处理方法，可得到更精细的结构，有助于人体对营养成分的吸收利用；该制备方法操作便捷、耗能较低、对于操作和设备要求较低，工业化应用可能性较大；反应条件和过程温和，添加试剂安全可食用，成品无化学试剂或有毒有害成分残留风险。