具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。

需要说明的是，在本文中，所用到的试剂，如醋酸钠、乙酸铵等试剂均为分析纯，乙醇为医用乙醇。

还需要说明的是，在本文中UniSil 10-120 C18层析树脂购自苏州纳薇科技股份有限公司。

一种达托霉素的提纯方法，包括将浓度为3.5～4maU/mL的达托霉素与盐溶液预反应以增强达托霉素极性的步骤；

以及利用低浓度乙醇溶液对达托霉素在反向层析柱中梯度洗脱的步骤；

所述低浓度乙醇溶液包括依次施用的14vol％乙醇溶液和20vol％乙醇溶液。

具体而言，达托霉素与盐溶液预反应以增大达托霉素极性，即在保证达托霉素生物活性的前提下，在其侧链上引入易于水解或分解且含有N元素或O元素的基团，如醋酸基等，以增大达托霉素的极性，从而降低反相层析柱对达托霉素的吸附能力，以实现达托霉素与杂质快速分离、提高达托霉素纯度和收率的目的。

将达托霉素的上样浓度设置为3.5～4maU/mL，即在高上样浓度的条件下，达托霉素在反向层析柱内易于被吸附在同一层析层面上，以允许通过低浓度的乙醇溶液以梯度洗脱的方式将达托霉素从反向层析柱内洗脱下来，从而降低在提纯过程中乙醇的使用量。

优选的，所述达托霉素的提纯方法包括如下步骤：

S1、将达托霉素粗粉用去离子水溶解，获得达托霉素溶液；

S2、将所述达托霉素溶液进行纳滤，至纳滤膜出水端电导率＜100，获得赶电导液；

S3、将所述赶电导液进行纳滤浓缩，至赶电导液中达托霉素浓度为3.5～4maU/mL，获得浓缩液；

S4、在所述浓缩液中加入醋酸钠溶液和乙醇溶液，调节pH＝6.5～7.0，获得上柱液；

S5、将所述上柱液上C18层析树脂填充的层析柱中，用乙醇溶液预洗层析柱，并用低浓度的乙醇溶液梯度洗脱，以已知杂质＜0.3％，未知杂质＜0.2％为标准收集，获得收集液；

S6、将所述收集液进行纳滤赶醇并浓缩，浓缩至达托霉素浓度为5～6maU/mL，获得达托霉素产品液。

具体而言，在S2、S3和S5中，所述纳滤均为利用截留分子量为300的纳滤膜，边加水边赶醇，保持加水量与纳滤流量一致，至纳滤膜出水端电导率＜100，即溶液中乙醇度为0时，结束纳滤操作；不同之处在于，S2和S5中均包括将溶液浓缩至体积一半后再进行边加水边赶醇操作。

需要说明的是，在S5中，以已知杂质＜0.3％，未知杂质＜0.2％为标准进行收集，具体为以每倍树脂体积量单独收集取样并进行UPLC检测，以检测收集液中杂质情况，并以收集液纯度已知杂质＜0.3％，未知杂质＜0.2％为标准进行收集。其中，所述已知杂质和未知杂质的判断标准为：已知杂质由参比制剂所定义的，优选的所述参比制剂为注射用达托霉素克必信，具体为所述未知杂质的保留时间约为19.093min；未知杂质由EMA的抗生素指南所定义的，具体为Guideline on setting specifications for related impuritiesin antibiotics。

其中，所述醋酸钠为用于增大达托霉素极性的盐溶液，其中的醋酸根离子可通过氢键与达托霉素侧链上的羟基、酰胺基或氨基相结合，以增大达托霉素的极性，并由于醋酸根离子水解性较强，可在提纯过程中被除去，从而避免在达托霉素成品中混入醋酸盐杂质。

优选的，所述上柱液中，所述醋酸钠含量为2vol％。

优选的，所述上柱液中，所述乙醇的含量为8vol％。

进一步的，所述梯度洗脱为先以3BV/h流速用14vol％乙醇溶液洗脱5BV，再以20vol％乙醇溶液洗脱10BV。

实施例1

S1、取达托霉素粗粉20g用去离子水溶解至1L，待其溶解之后，用小膜机(型号JMD1812-1，大连屹东膜工程设备有限公司，220V，50HZ)进行浓缩，待溶液体积为原始体积的二分之一后，对溶液进行加水赶醇，并保持加水速度(5L/h)与透析液速度一致，待纳滤膜(截留分子量300)的出水端电导率＜100时，压缩溶液体积至0.55L，即达托霉素含量为3.6maU/mL的浓缩液；

S2、取浓缩液61mL，即含有2.2g的达托霉素，加入2vol％醋酸钠即0.04g，调节pH＝6.71，加入一定量乙醇，配成含有8vol％乙醇的上柱液；

S3、将上柱液上柱200mLUniSil 10-120 C18层析树脂，8vol％乙醇溶液预洗后，先以3BV/h流速先用14％乙醇溶液洗脱5BV，再用20％乙醇溶液洗脱10BV，并收集被洗脱下的达托霉素，以每倍树脂体积量单独收集取样并用UPLC检测纯度，当洗脱液中已知杂质＜0.3％，未知杂质＜0.2％时对洗脱液进行收集，获得收集液；

S4、所述收集液共1.1L，用纳滤膜(截留分子量300)进行浓缩赶醇至乙醇度为零(浓缩赶醇步骤如S1)，并浓缩收集液至40mL，获得达托霉素产品。

经检测，所述达托霉素中产品的纯度为96.72％，收率为74.18％。

实施例2

S1、取达托霉素粗粉20g用去离子水溶解至1L，待其溶解之后，用小膜机(型号JMD1812-1，大连屹东膜工程设备有限公司，220V，50HZ)进行浓缩，待溶液体积为原始体积的二分之一后，对溶液进行加水赶醇，并保持加水速度(5L/h)与透析液速度一致，待纳滤膜(截留分子量300)的出水端电导率＜100时，压缩溶液体积至0.61L，即达托霉素含量为4maU/mL的浓缩液；

S2、取浓缩液61mL，即含有2.2g的达托霉素，加入2vol％醋酸钠即0.04g，用盐酸(2mol/L)调节pH＝7，加入一定量乙醇，配成含有8vol％乙醇的上柱液；

S3、将上柱液上柱200mLUniSil 10-120 C18层析树脂，8vol％乙醇溶液预洗后，先以3BV/h流速先用14％乙醇溶液洗脱5BV，再用20％乙醇溶液洗脱10BV，并收集被洗脱下的达托霉素，以每倍树脂体积量单独收集取样并用UPLC检测纯度，当洗脱液中已知杂质＜0.3％，未知杂质＜0.2％时对洗脱液进行收集，获得收集液；

S4、所述收集液共1.1L，用纳滤膜(截留分子量300)进行浓缩赶醇至乙醇度为零(浓缩赶醇步骤如S1)，并浓缩收集液至40mL，获得达托霉素产品。

经检测，所述达托霉素中产品的纯度为96.21％。收率为77.54％。

检测例1

改进前工艺和改进后工艺对已知杂质和未知杂质的去除效率和收率的比较，以及乙醇用量的比较。

实验方法：

改进后工艺：如实施例1。

改进前工艺：与实施例1的区别在于醋酸钠被替换为乙酸铵。具体为上柱液调节pH至5.5～6。0，用2vol％乙酸铵-15vol％乙醇预洗UniSil 10-120 C18层析树脂2BV，再用2vol％乙酸铵-40vol％乙醇进行洗脱。

取达托霉素粗粉进行色谱分析，获得已知杂质(＜0.3％)和未知杂质(＜0.2％)的杂质峰面积；分别将改进后工艺和改进前工艺所获得的达托霉素成品进行色谱分析，获得已知杂质(＜0.3％)和未知杂质(＜0.2％)的杂质峰面积，经计算获得两种工艺分别对已知杂质(＜0.3％)和未知杂质(＜0.2％)的去除率和各自的收率，结果如表1所示；以及统计两种工艺的乙醇使用量(以1L柱层析为标准)，统计结果如表2所示。

表1

表2

从表1可以看出，改进后的工艺对已知杂质(＜0.3％)和未知杂质(＜0.2％)的去除率分别为48.48％和40.6％，其收率为75.86％，而改进前的工艺对已知杂质(＜0.3％)和未知杂质(＜0.2％)的去除率仅为24.12％和21.4％，收率仅为65.32％，基于此表明相较于改进前工艺，改进后工艺，即本申请所提供的达托霉素的提纯方法可有效提高对已知杂质(＜0.3％)和未知杂质(＜0.2％)的去除率以及提高达托霉素成品的收率。

从表2可以看出，改进前工艺的乙醇总使用量为7968mL，远高于改进后工艺的2911mL，即表明本申请所提供的达托霉素的提纯方法，相较于改进前工艺其乙醇使用量显著减少。

综上所述，本发明所提供的达托霉素提纯方法，通过利用盐溶液与达托霉素进行预反应，以增大达托霉素的极性，并且由于达托霉素浓度为3.5～4maU/mL，其在上样过程中会被集中吸附在同一层析层面上，因此在洗脱过程中利用低浓度的乙醇溶液便可将达托霉素洗脱下来，从而提高达托霉素与杂质的分离率和收率的同时，有效降低乙醇的使用量。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。