一种利那洛肽的合成方法
阅读说明：本技术 一种利那洛肽的合成方法 (Synthesis method of linaclotide ) 是由 袁慧星 陈浩明 黄欢 何英 尹传龙 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及多肽合成技术领域,尤其涉及一种利那洛肽的合成方法。本发明采用特定的裂解液利用两步裂解法合成利那洛肽,第一步裂解将全保护利那洛肽从利那洛肽全保护树脂上裂解下来,并开发一种绿色环保的沉淀析出方式,提高全保护肽的纯度,获得的全保护肽的纯度在91-95％之间；第二步裂解将氨基酸侧链的保护基脱除,得到的线性肽纯度在90-95％之间。该方法大大提高了利那洛肽线性肽的纯度和利那洛肽的纯度,同时合成过程不使用毒性较大的EDT,并减少了危险溶剂TFA的使用,投料量少,生产周期短,极大的节省了物料和时间成本、提高了生产的安全系数。(The invention relates to the technical field of polypeptide synthesis, in particular to a method for synthesizing linaclotide. According to the method, the linaclotide is synthesized by using a specific cracking solution and a two-step cracking method, the first step of cracking is to crack the fully-protected linaclotide from linaclotide fully-protected resin, and an environment-friendly precipitation separation mode is developed, so that the purity of the fully-protected peptide is improved, and the purity of the obtained fully-protected peptide is 91-95%; in the second step, the protecting group of the amino acid side chain is removed by cracking, and the purity of the obtained linear peptide is between 90 and 95 percent. The method greatly improves the purity of linaclotide linear peptide and linaclotide, does not use EDT with high toxicity in the synthesis process, reduces the use of dangerous solvent TFA, has small material dosage and short production period, greatly saves material and time cost, and improves the safety factor of production.)
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，尤其涉及一种利那洛肽的合成方法。
背景技术
利那洛肽(Linaclotide)是Ironwood开发的新产品，是一种新型的GC-C(肠上皮细胞尿苷酸环化酶C)受体激动剂，于2012年12月17日首次获批在美国上市，用于治疗成人慢性特发性便秘和便秘型肠易激综合症(IBS-C)，商品名为LINZESS。本品是鸟苷酸环化酶-C(GCC)激动剂，作用机制可能为利那洛肽与小肠上皮细胞内的GC-C受体结合，其激活GC-C，导致肠液分泌增加，并加速运转，而且还降低小肠内痛觉神经的敏感性。
利那洛肽是由14个氨基酸组成的多肽，包括3对二硫键连接的6个半胱氨酸残基，其具体肽序如下：
虽然国内外对利那洛肽的合成报道较多，但关注点在二硫键的形成上，通过采用不同的半胱氨酸保护基达到一步自然氧化或是分步定向氧化。因此，目前关于利那洛肽树脂的合成研究较少，但肽树脂的合成是后续氧化的基础，同时肽树脂的合成优化也能为后续生产节省时间、节省资源。
现有的专利如CN103626849A、CN102875655B、CN104231051B在固相偶连合成利那洛肽的过程中采用的一般是Wang Resin，氨基酸投料倍数集中在2.5-3.5倍之间，反应时间集中在120-180min之间，其中半胱氨酸是采用不同的保护基如Hqm、Trt、Acm、Mmt中的两种或三种进行保护，裂解时采用一步裂解且裂解液配比中大都含有EDT，得到的线性肽纯度范围在60-85％之间。
以上现有技术中，氨基酸投料倍数集中在2.5-3.5倍之间，且不存在差异化，在放大生产时消耗的氨基酸增加明显，直接导致了物料成本的增加；反应时间集中在120-180min之间，使得生产的时间成本增加；采用不同的保护基团保护半胱氨酸，尤其是采用Hqm、Acm、Mmt保护半胱氨酸，物料价格昂贵，其中Acm保护的半胱氨酸是5.5元/克，Mmt保护的半胱氨酸是15元/克，导致成本增加，且一般采用不同保护基团都是分步氧化，使得氧化步骤繁琐，不利于工业生产；裂解时采用一步裂解，使用的溶剂量尤其是TFA的量较多，对环境不友好，同时大部分裂解液的配比中含有EDT，其味道刺鼻，严重影响生产工人的身心健康，也恶化生产环境；最为重要的是采用现有专利中的生产工艺得到的线性肽纯度较低，在60-85％之间，偏低的线性肽纯度若不经纯化直接氧化会使得氧化产物复杂难分离，若经过纯化再氧化则时间、物料成本都会相应的增加。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种利那洛肽的合成方法。该方法大大提高了利那洛肽的纯度，同时降低了生产成本，缩短了生产周期，对环境友好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种利那洛肽的合成方法，包括：
a)获得利那洛肽全保护肽树脂；
b)将所述利那洛肽肽树脂经第一裂解得到全保护肽，将所述全保护肽沉淀析出，得到全保护肽沉淀；
将所述全保护肽沉淀进行第二步裂解，获得线性肽；
c)所述线性肽经环化，获得利那洛肽。
一些实施方案中，步骤a)为：
按照利那洛肽从C端到N端的顺序，在树脂上逐一偶联保护氨基酸，获得利那洛肽肽树脂。
本发明中，所述树脂为二氯树脂，所述二氯树脂的替代度为1.19-1.7mmol/g，优选为1.26-1.7mmol/g。
本发明中，所述树脂上逐一偶联如下保护氨基酸：Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH。
进一步的，步骤a)为：以固相二氯树脂为载体，在碱的催化下连接Fmoc-Tyr(tBu)-OH，得到Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂；然后按照利那洛肽从C端到N端的顺序，依次逐一偶联其他保护氨基酸，获得利那洛肽肽树脂。其中，所述Fmoc-Tyr(tBu)-OH用量优选为二氯树脂的2-4倍，更优选为2倍；所述碱优选为DIPEA，DIPEA的用量优选为2-5倍，更优选地为3倍；所述的偶连时间优选为1-5小时，更优选为2小时。
本发明中，所述偶联保护氨基酸的温度为18-35℃，优选为22-30℃；偶联时间为60～120min，具体可为60min或120min。除Fmoc-Asn(Trt)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH的偶联时间为120分钟外，其余保护氨基酸的偶连时间均为60分钟。所述偶联的偶联剂为DIPCDI+A或DIPEA+A+B，其中A选自HOBt或HOAt，B选自PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU、TBTU中的一种或多种；所述偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为：DIPCDI:A＝1.1～1.5:1.0～1.4，DIPEA:A:B＝1.8～2.2:1.0～1.4:0.95～1.05；更优选为DIPCDI:A＝1.3:1.2，DIPEA:A:B＝2.0:1.2:1.0。
本发明中，步骤b)中，所述第一裂解液裂解和第二裂解液裂解的温度为0-40℃，优选为20-30℃；时间为1-4h，优选为2.5-3.5h。所述第一裂解液中，TFE和DCM的体积比为1:1～1:10，优选为1:2～1:6；以mL/g计，所述第一裂解液与肽树脂的体积质量比为1:5～1:15，优选为1:7～1:14。
本发明中，步骤b)中，第一步裂解的第一裂解液包括TFE和DCM，第二步裂解的第二裂解液包括TFA、TIS、苯甲硫醚和水；
所述第二裂解液中，TFA、TIS、苯甲硫醚和水的体积比为85:5:5:5；以mL/g计，所述第二裂解液与全保护肽的体积质量比为1:6～1:15，优选为1:8～1:12。
本发明中，步骤b)具体包括：
b1)用第一裂解液裂解所述肽树脂得到全保护肽溶液，将所述全保护肽溶液旋蒸，加入不良溶剂，抽滤或离心，获得全保护肽沉淀；
b2)将所述全保护肽沉淀用第二裂解液裂解，用溶剂进行沉降，离心，获得线性肽。
其中，步骤b1)中，所述不良溶剂包括水、二甲基亚砜、乙二醇、甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯中的一种或多种；优选的，步骤b1)中，所述不良溶剂包括水、二甲基亚砜、甲醇、乙腈；更优选的，步骤b1)中，所述不良溶剂为水。
步骤b2)中，所述溶剂为无水乙醚或无水甲叔醚；
本发明中，步骤c)具体包括：
将所述线性肽溶于乙腈水溶液后缓慢加入至缓冲盐体系中，再加入DMSO，然后用氨水调节pH进行环化，获得粗肽，粗肽经纯化，获得利那洛肽。
其中，步骤c)中，所述乙腈水溶液中乙腈的体积百分比含量为20-90％，优选为40-80％；以g/mL计，所述乙腈水溶液的与线性肽的体积质量比优选为1:3～1:15，优选为1:6～1:12；所述缓冲盐体系为醋酸铵水溶液，缓冲体系的pH为7.5-11.0，优选为7.5-9.5；所述DMSO的添加量为至0.1-20％，优选为5-10％；所述环化的时间为8-48小时，优选为12-18小时。
本发明采用两步裂解法合成利那洛肽，通过第一步裂解，将利那洛肽全保护肽从利那洛肽全保护树脂上裂解下来，除去了树脂的重量，从而减少了第二次裂解中裂解液的用量，同时在第一步裂解之后利用不良溶剂对全保护肽进行沉淀析出，减少了全保护肽中的杂质含量，获得的全保护肽纯度在91-95％之间；通过第二步裂解将氨基酸侧链的保护基脱除，得到的线性肽在90-95％之间，由于第一步裂解已经去除了树脂的重量，该步骤所用的裂解液大幅度减少，显著增加生产过程中的环保性与经济性。
以裂解液为TFA为例，假设一批利那洛肽的合成规模需要4mol，使用的氨基酸树脂替代度为0.60-0.85mmol/g，取替代度为0.63mmol/g进行计算，得到的肽树脂的重量约为18kg，若只采用一步裂解，10倍当量85％的TFA裂解液配比，需要的TFA为15.3L，但若采用二步裂解的方法，第一步裂解得到的全保护肽约为13kg，那么10倍当量85％的TFA裂解液配比，需要的TFA为11.0L，可以减少28％的TFA使用量。
本发明至少具有如下有益效果之一：
(1)大大提高了利那洛肽线性肽的纯度和利那洛肽的纯度.
(2)本发明固相合成中氨基酸偶联除Asn和Cys偶连2小时外，其余氨基酸均偶连1小时，大大缩短了生产工艺的时间；
(3)本发明偶联过程中除Asn采用3倍投料量外其余氨基酸均采用2倍投料量且所有的Cys均采用Trt保护，明显降低了生产成本；
(4)该方法获得的全保护肽易于储存且性质稳定，能显著降低第二步裂解中脱保护试剂TFA的使用，且第二步裂解对EDT进行了替代，显著的增加了生产过程的安全性和环保性；
(5)利用全保护肽水溶性差的特点，不良溶剂采用水，使全保护肽析出，水无污染也不会带来新的杂质，不仅可以对全保护肽进行提纯，同时还增加了生产过程中的环保性和安全性。
附图说明
图1示本发明利那洛肽合成路线图。
具体实施方式
本发明提供了一种利那洛肽的合成方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明一种利那洛肽的合成方法，包括：
a)获得利那洛肽肽树脂；
b)将所述利那洛肽肽树脂依次经第一裂解液、第二裂解液裂解，获得线性肽；
c)所述线性肽经环化，获得利那洛肽；
所述第一裂解液包括TFE和DCM；
所述第二裂解液包括TFA、TIS、苯甲硫醚和水。
一些实施方案中，所述利那洛肽的合成方法，具体包括以下步骤：
1)氨基酸树脂的制备：以固相二氯树脂为载体，在碱的催化下连接Fmoc-Tyr(tBu)-OH，得到Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂；
2)肽树脂的制备：以Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂为载体，通过连接受保护的氨基酸，脱除氨基酸保护基，再连接受保护的氨基酸的方法依次连接氨基和侧链经过保护的半胱氨酸(Cys)、甘氨酸(Gly)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、天冬酰胺(Asn)、半胱氨酸(Cys)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)、半胱氨酸(Cys)得到利那洛肽肽树脂；
3)全保护肽的制备：在TFE和DCM混合溶剂下裂解肽树脂，旋蒸除去DCM，加入不良溶剂，得到白色浑浊溶液，抽滤或离心得到全保护肽；
4)线性肽的制备：将得到的全保护肽在裂解液的存在进行脱保护，再用溶剂进行沉降，离心得到利那洛肽线性肽；
5)利那洛肽的制备：将线性肽用乙腈水溶液溶解，再将其缓慢倒至缓冲盐体系中，加入DMSO，最后用氨水调节pH到合适值进行环化，经纯化得到利那洛肽。
进一步地，步骤5)中环化停止后，还包括纯化精制步骤。本发明对纯化精制的具体方法没有特殊限定，本领域常用的熟知的方法即可。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：替代度为0.58mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂的制备
称取替代度为1.26mmol/g的2CTC Resin 50g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀30min，抽干溶剂；称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(57.89g，126mmol)用DMF溶解，加入固相反应柱，再加入DIPEA(16.28g，126mmol)，鼓氮气反应30min后，补加DIPEA(8.14g，63mmol)，反应1.5小时后，加入甲醇封闭1小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂，检测替代度为0.58mmol/g。
实施例2：替代度为0.64mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂的制备
称取替代度为1.40mmol/g的2CTC Resin 50g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀30min，抽干溶剂；称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(64.33g，140mmol)用DMF溶解，加入固相反应柱，再加入DIPEA(18.09g，140mmol)，鼓氮气反应30min后，补加DIPEA(9.04g，70mmol)，反应1.5小时后，加入甲醇()封闭1小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂，检测替代度为0.64mmol/g。
实施例3：替代度为0.83mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂的制备
称取替代度为1.70mmol/g的2CTC Resin 50g于固相反应柱中，加入DMF，氮气鼓泡溶胀30min，抽干溶剂；称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(78.12g，170mmol)用DMF溶解，加入固相反应柱，再加入DIPEA(21.97g，170mmol)，鼓氮气反应30min后，补加DIPEA(10.98g，85mmol)，反应1.5小时后，加入甲醇()封闭1小时，DCM洗涤三次，甲醇收缩后抽干树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂，检测替代度为0.83mmol/g。
实施例4：利那洛肽肽树脂的制备
称取实施例1中得到的Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂(Sub＝0.58mmol/g，17.24g，10mmol)于固相反应柱中，用DMF洗两次，再用DMF溶胀30min后，DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤5次。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(11.71g，20mmol)和HOBt(3.242g，24mmol)用DMF溶解，加入DIPCDI(4.06，26mmol)活化3min后，将混合液加入到固相反应柱中，22-30℃下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂5次，茚三酮检测树脂有颜色。按以上同样方法依次偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH。反应结束后，用甲醇收缩，得到肽树脂47.56g。
实施例5：利那洛肽肽树脂的制备
称取实施例2中得到的Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂(Sub＝0.64mmol/g，15.63g，10mmol)于固相反应柱中，用DMF洗两次，再用DMF溶胀30min后，DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤5次。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(11.71g，20mmol)和HOBt(3.242g，24mmol)用DMF溶解，加入DIPCDI(4.06，26mmol)活化3min后，将混合液加入到固相反应柱中，22-30℃下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂5次，茚三酮检测树脂有颜色。按以上同样方法依次偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH。反应结束后，用甲醇收缩，得到肽树脂45.92g。
实施例6：利那洛肽肽树脂的制备
称取实施例3中得到的Fmoc-Tyr(tBu)-2CTC树脂(Sub＝0.83mmol/g，12.05g，10mmol)于固相反应柱中，用DMF洗两次，再用DMF溶胀30min后，DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤5次。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(11.71g，20mmol)和HOBt(3.242g，24mmol)用DMF溶解，加入DIPCDI(4.06，26mmol)活化3min后，将混合液加入到固相反应柱中，22-30℃下反应2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应0.5小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂5次，茚三酮检测树脂有颜色。按以上同样方法依次偶联Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH。反应结束后，用甲醇收缩，得到肽树脂42.50g。
实施例7：利那洛肽全保护肽的制备
称取实施例5中的肽树脂5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第一裂解液50mL(TFE:DCM＝1:2)，将裂解液加入到单口烧瓶中，20℃下反应3小时，滤掉树脂，树脂用DCM洗涤，合并滤液，减压浓缩除去DCM，再加入与DCM等量的水，继续减压浓缩除去TFE，得到白色浑浊溶液，过滤得白色固体，将白色固体真空干燥，得利那洛肽全保护肽3.38g，纯度为92.98％。
实施例8：利那洛肽全保护肽的制备
称取实施例5中的肽树脂5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第一裂解液50mL(TFE:DCM＝1:4)，将裂解液加入到单口烧瓶中，25℃下反应3小时，滤掉树脂，树脂用DCM洗涤，合并滤液，减压浓缩除去DCM，再加入与DCM等量的水，继续减压浓缩除去TFE，得到白色浑浊溶液，过滤得白色固体，将白色固体真空干燥，得利那洛肽全保护肽3.36g，纯度为93.22％。
实施例9：利那洛肽全保护肽的制备
称取实施例5中的肽树脂5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第一裂解液50mL(TFE:DCM＝1:6)，将裂解液加入到单口烧瓶中，30℃下反应3小时，滤掉树脂，树脂用DCM洗涤，合并滤液，减压浓缩除去DCM，再加入与DCM等量的水，继续减压浓缩除去TFE，得到白色浑浊溶液，过滤得白色固体，将白色固体真空干燥，得利那洛肽全保护肽3.32g，纯度为93.02％。
实施例10：利那洛肽全保护肽的制备
称取实施例5中的肽树脂5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第一裂解液35mL(TFE:DCM＝1:3)，将裂解液加入到单口烧瓶中，25℃下反应3小时，滤掉树脂，树脂用DCM洗涤，合并滤液，减压浓缩除去DCM，再加入与DCM等量的水，继续减压浓缩除去TFE，得到白色浑浊溶液，过滤得白色固体，将白色固体真空干燥，得利那洛肽全保护肽3.21g，纯度为92.42％。
实施例11：利那洛肽全保护肽的制备
称取实施例5中的肽树脂5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第一裂解液70mL(TFE:DCM＝1:3)，将裂解液加入到单口烧瓶中，25℃下反应3小时，滤掉树脂，树脂用DCM洗涤，合并滤液，减压浓缩除去DCM，再加入与DCM等量的水，继续减压浓缩除去TFE，得到白色浑浊溶液，过滤得白色固体，将白色固体真空干燥，得利那洛肽全保护肽3.26g，纯度为92.86％。
实施例12：利那洛肽全保护肽的制备
称取实施例5中的肽树脂5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第一裂解液50mL(TFE:DCM＝1:4)，将裂解液加入到单口烧瓶中，25℃下反应3小时，滤掉树脂，树脂用DCM洗涤，合并滤液，减压浓缩除去DCM，再加入与DCM等量的甲醇，继续减压浓缩除去TFE，得到白色浑浊溶液，过滤得白色固体，将白色固体真空干燥，得利那洛肽全保护肽3.32g，纯度为92.12％。
实施例13：利那洛肽全保护肽的制备
称取实施例5中的肽树脂5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第一裂解液50mL(TFE:DCM＝1:4)，将裂解液加入到单口烧瓶中，25℃下反应3小时，滤掉树脂，树脂用DCM洗涤，合并滤液，减压浓缩除去DCM，再加入与DCM等量的DMSO，继续减压浓缩除去TFE，得到白色浑浊溶液，过滤得白色固体，将白色固体真空干燥，得利那洛肽全保护肽3.24g，纯度为91.98％。
实施例14：利那洛肽全保护肽的制备
称取实施例6中的肽树脂40g加入到单口烧瓶中，预先配制好第一裂解液400mL(TFE:DCM＝1:4)，将裂解液加入到单口烧瓶中，25℃下反应3小时，滤掉树脂，树脂用DCM洗涤，合并滤液，减压浓缩除去DCM，再加入与DCM等量的乙腈，继续减压浓缩除去TFE，得到白色浑浊溶液，过滤得白色固体，将白色固体真空干燥，得利那洛肽全保护肽33.5g，纯度为92.84％。
实施例15：利那洛肽全保护肽的制备
称取实施例4中的肽树脂40g加入到单口烧瓶中，预先配制好裂解液400mL(TFE:DCM＝1:4)，将裂解液加入到单口烧瓶中，30℃下反应3小时，滤掉树脂，树脂用DCM洗涤，合并滤液，减压浓缩除去DCM，再加入与DCM等量的甲醇，继续减压浓缩除去TFE，得到白色浑浊溶液，过滤得白色固体，将白色固体真空干燥，得利那洛肽全保护肽33.2g，纯度为92.65％。
实施例16：利那洛肽线性肽的制备
称取实施例14中利那洛肽全保护肽5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第二裂解液40mL(TFA：TIS：苯甲硫醚：水＝85:5:5:5)，0-5℃下反应2小时后，将反应液倒入预冷的400mL无水乙醚中沉淀、离心，无水乙醚洗涤2次，减压干燥得粗肽2.795g，纯度为93.05％。
实施例17：利那洛肽线性肽的制备
称取实施例14中利那洛肽全保护肽5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第二裂解液50mL(TFA：TIS：苯甲硫醚：水＝85:5:5:5)，0-5℃下反应2小时后，将反应液倒入预冷的500mL无水乙醚中沉淀、离心，无水乙醚洗涤2次，减压干燥得粗肽2.804g，纯度为93.56％。
实施例18：利那洛肽线性肽的制备
称取实施例14中利那洛肽全保护肽5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第二裂解液60mL(TFA：TIS：苯甲硫醚：水＝85:5:5:5)，0-5℃下反应2小时后，将反应液倒入预冷的600mL无水乙醚中沉淀、离心，无水乙醚洗涤2次，减压干燥得粗肽2.792g，纯度为92.98％。
实施例19：利那洛肽线性肽的制备
称取实施例14中利那洛肽全保护肽5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第二裂解液50mL(TFA：TIS：苯甲硫醚：水＝85:5:5:5)，10-15℃下反应2小时后，将反应液倒入预冷的500mL无水乙醚中沉淀、离心，无水乙醚洗涤2次，减压干燥得粗肽2.824g，纯度为92.46％。
实施例20：利那洛肽线性肽的制备
称取实施例14中利那洛肽全保护肽5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第二裂解液50mL(TFA：TIS：苯甲硫醚：水＝85:5:5:5)，15-20℃下反应2小时后，将反应液倒入预冷的500mL无水乙醚中沉淀、离心，无水乙醚洗涤2次，减压干燥得粗肽2.806g，纯度为92.12％。
实施例21：利那洛肽线性肽的制备
称取实施例14中利那洛肽全保护肽5g加入到单口烧瓶中，预先配制好第二裂解液50mL(TFA：TIS：苯甲硫醚：水＝85:5:5:5)，0-10℃下反应2小时后，将反应液倒入预冷的500mL甲叔醚中沉淀、离心，甲叔醚洗涤2次，减压干燥得粗肽2.789g，纯度为91.25％。
实施例22：利那洛肽线性肽的制备
称取实施例15中利那洛肽全保护肽30g加入到单口烧瓶中，预先配制好第二裂解液300mL(TFA：TIS：苯甲硫醚：水＝85:5:5:5)，0-10℃下反应2小时后，将反应液倒入预冷的3000mL甲叔醚中沉淀、离心，甲叔醚洗涤2次，减压干燥得粗肽27.89g，纯度为92.06％。
实施例23：利那洛肽的制备
称取实施例22中利那洛肽线性肽20g加入到烧杯中，用2L 80％的乙腈水溶液溶解，预先配制醋酸铵缓冲液18L(称取77.08g醋酸铵溶于18L纯化水中)，将溶解好的利那洛肽线性肽乙腈水溶液在搅拌的状态下加入缓冲液中，再加入5％DMSO(1L)，最后用氨水调节氧化液的pH至8-9之间，室温下搅拌反应12-18小时。停止反应后，经纯化精制得到利那洛肽，纯度99.98％。
对比例1
称取实施例4的利那洛肽肽树脂23.78g(5mmol)加入到单口烧瓶中，预先配制好第二裂解液240mL(TFA：TIS：苯甲硫醚：水＝85:5:5:5)，0-10℃下反应2小时后，将反应液倒入预冷的3000mL甲叔醚中沉淀、离心，甲叔醚洗涤2次，减压干燥得粗肽8.9g，纯度为54.67％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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