一种具有高亮度、高光稳定性的深红荧光染料及其合成方法
阅读说明：本技术 一种具有高亮度、高光稳定性的深红荧光染料及其合成方法 (Deep red fluorescent dye with high brightness and high light stability and synthesis method thereof ) 是由 袁林 任天兵 蒋钢威 张晓兵 于 2021-10-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有高亮度、高光稳定性的深红荧光染料及其合成方法,其结构式为Ⅰ～Ⅲ中的一种：本发明通过亲核取代及硼氢化钠或氢化铝锂还原,我们可以得到中间体,之后将之与苯酮酸反应得到相应的罗丹明类荧光染料。本发明的染料表现出红移的发射光谱、更好的光稳定性及大的Stokes位移,并且能够在一定程度上抵御微环境的变化(如pH、粘度、蛋白及极性环境),在水溶液中的亮度明显增强。该染料可以被设计生成各种标记试剂或探针用于蛋白质标记及生物标志物的检测。并得益于其较高的量子产率及光稳定性,这些探针或标记试剂能够被用于长时间的先进的成像技术,如STED显微成像等。(The invention discloses a deep red fluorescent dye with high brightness and high light stability and a synthesis method thereof, wherein the structural formula of the deep red fluorescent dye is one of I to III: the invention can obtain an intermediate through nucleophilic substitution and reduction of sodium borohydride or lithium aluminum hydride, and then the intermediate is reacted with phenylketonic acid to obtain corresponding rhodamineA bright fluorescent dye. The dye disclosed by the invention shows a red-shifted emission spectrum, better light stability and large Stokes shift, can resist the change of a microenvironment (such as pH, viscosity, protein and polar environment) to a certain extent, and obviously enhances the brightness in an aqueous solution. The dye can be designed to produce various labeling reagents or probes for protein labeling and biomarker detection. And due to the high quantum yield and light stability of the probe or the labeling reagent, the probe or the labeling reagent can be used for long-term advanced imaging technology, such as STED microscopic imaging and the like.)
技术领域
本发明属于荧光染料领域，具体涉及到一种具有高亮度、高光稳定性的深红荧光染料及其合成方法。
背景技术
荧光成像技术在研究生命过程的许多领域发挥着重要作用，且高分辨成像技术的开发使得人们可以对细胞中纳米甚至是单分子层面的分子结构可视化，这对于了解生命过程的进行及细胞生物学至关重要。而该技术的实现依赖于灵敏且稳定的荧光信号输出。发色团荧光性质差异严重影响了成像质量，其中，荧光强度及光稳定性是决定一个发色团能否被用于先进成像技术的两个重要指标。
作为一种性质优异的发色团，小分子荧光染料已经在包括细胞染色、生物分子标记及分析及临床诊断等方面得到了广泛的应用。但相较于成像技术的日益革新，明亮且光稳定的荧光染料的开发依然严重滞后，这阻碍了高质量成像信息的获取。虽然目前已经发展了多种提升染料亮度的方法，且使用这些方法开发的染料能够被用于超分辨成像，但它们在长时间超分辨成像中的光稳定性依然有待检验。开发能够被用于长时间超分辨成像的高亮度、高光稳定性的小分子荧光染料在示踪细胞内分子结构的变化及获得细胞内细胞器的3D结构的可视化方面具有十分重要的价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高亮度、高光稳定性的深红荧光染料及其合成方法，该荧光染料在水溶液中具有较高的荧光量子产率，因而可以示踪细胞内分子结构的变化。
本发明这种具有高亮度、高光稳定性的深红荧光染料，其结构式为Ⅰ～Ⅲ中的一种：
其中：R1为H、C1-C20烷基、取代烷基中的一种；R2为H、烃基、取代烷基、芳基，取代芳基中的一种；R3为R3-1、R3-2和R3-3中的一种：
R3-1为S1～S3结构式中的一种：
R3-2为S4～S5结构式中的一种：
R3-3为S6～S9结构式中的一种：
n1＝1～10，n2＝1～10。
所述Ⅰ型深红荧光染料的制备方法，包括以下步骤：
将中间体1(8-甲氧基-5-取代基R3-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)溶于溶剂中，搅拌溶解，向其中加入化合物1(2-取代基R2酮-4-二取代基R1胺苯酚)，在设定温度下进行反应，反应结束后，反应液倒入冰水中，加入无机酸，有大量固体析出，依次进行抽滤，洗涤固体，干燥，硅胶柱分离，减压除去溶剂后，得到紫色的Ⅰ型深红荧光染料；
合成技术路线如下：
所述中间体1与化合物1的摩尔比为1:(1～1.5)；溶剂为甲基磺酸，中间体1与溶剂的质量体积比为1mmol:(5～10)mL；所述无机酸为硫酸，盐酸，高氯酸和对甲苯磺酸中的一种；设定温度为85～95℃，反应时间为1～4h；硅胶柱分离以二氯乙烷:乙醇＝100:(1～5)为洗脱剂。
所述Ⅱ型深红荧光染料的制备方法，包括以下步骤：
将中间体1(8-甲氧基-5-取代基R3-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)溶于溶剂中，搅拌溶解，向其中加入化合物1(2-取代基R2间苯二酚)，在设定温度下进行反应，反应结束后，反应液倒入冰水中，加入无机酸，有大量固体析出，依次进行抽滤，洗涤固体，干燥，硅胶柱分离，减压除去溶剂后，得到紫色的Ⅱ型深红荧光染料；
合成路线如下：
所述中间体1与化合物2的摩尔比为1:(1～1.5)；溶剂为甲基磺酸，中间体1与溶剂的质量体积比为1mmol:(5～10)mL；所述无机酸为硫酸，盐酸，高氯酸和对甲苯磺酸中的一种；设定温度为85～95℃，反应时间为1～4h；硅胶柱分离以二氯乙烷:乙醇＝100:(1～5)为洗脱剂。
所述Ⅲ型深红荧光染料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将中间体2(8-溴-5-取代基R3-3-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)、化合物3(2-溴-4-(二取代烷基R1氨基)苄醇)及BF3·OEt2溶解于二氯甲烷，室温下搅拌反应，反应结束后，向反应液中加入水猝灭反应，混合物用二氯甲烷萃取，分离有机相，干燥，浓缩，柱层析分离得到化合物4(3-溴-4-((8-溴-5-取代基R3-3-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉-7-基)甲基)-N,N-二取代烷基R1胺)；
(2)将步骤(1)中化合物4溶解在无水四氢呋喃中，冷却至-78℃，在氮气保护的前提下，向其中加入溶解有正丁基锂的四氢呋喃溶液，在该温度下搅拌反应；之后，将溶解二氯二甲基硅烷在四氢呋喃溶液中并被加入到反应液中，缓慢恢复室温，继续搅拌反应，反应结束后，加入HCl溶液猝灭反应，再接着向反应液中加入饱和碳酸氢钠以中和溶液pH，然后用二氯甲烷进行萃取；将有机相被分离，并用无水硫酸钠干燥，再旋干后，得到固态初级产品；固态初级产品溶于丙酮中，并降至0℃，搅拌，在接下来的3h，将高锰酸钾分批次加入其中；将混合物用硅藻土过滤，溶液旋干，柱层析分离后，得到化合物5(10-(二取代烷基R1氨基)-5-取代基R3-3-12,12-二烷基-1,2,3,3a,4,5-六氢苯并[5,6]硅基[3,2-g]吡咯[1,3-a]喹喔啉-7(12H)-酮)；
(3)将步骤(2)中化合物5溶解于无水四氢呋喃中，在氮气保护的前提下，将含有R2基团的格式试剂加入其中，混合物在设定温度下回流反应，反应完毕后，冷却至室温，向其中加入HCl溶液以猝灭反应，接着向混合物中加入饱和碳酸氢钠以中和溶液pH，并用二氯甲烷进行萃取，有机相被分离，用无水硫酸钠干燥，旋干，固体产物用柱层析分离得到Ⅲ型深红荧光染料(5-取代基R3-3-N,N-二烷基R1-12,12-二甲基-7-R2-1,2,3,3a,4,5,10,12-八氢苯并[5,6]硅[3,2-g]吡咯[1,2-a]喹喔啉-10-胺)。
合成路线如下：
所述步骤(1)中，中间体2、化合物3和BF3·OEt2的摩尔比为1:(0.8～1.2):(1.8～2.2)，反应时间为20～28h；
所述步骤(2)中，化合物4、正丁基锂、二氯二甲基硅烷的摩尔比为1:(2.0～2.4):(1～3)，化合物4与高锰酸钾的摩尔比1:(3～5)；搅拌反应时间为15～25min，继续搅拌反应时间为0.5～1.5h；HCl溶液的浓度为1.5～2.5M；
所述步骤(3)中，化合物5与含有R2基团的格式试剂的摩尔比为1:(9～11)；设定温度为75～85℃，回流反应时间为1.5～2.5h，HCl溶液的浓度为1.5～2.5M。
所述中间体1或2的制备方法，包括以下步骤：
当R3为R3-1时，合成路线如下：
具体包括以下步骤：
将化合物6(8-甲氧基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)或化合物7(8-溴-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)溶解于乙腈中，向其中加入对应的R3-1的溴取代基及碳酸钾，回流反应1～4h，反应完成后，减压出去溶剂，硅胶柱分离，以石油醚:乙酸乙酯＝10:1为洗脱剂，减压除去溶剂，对应得到无色油状液体R3-1中间体1(8-甲氧基-5-取代基R3-1-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)或R3-1中间体2(8-溴-5-取代基R3-1-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)；
当R3为R3-2时，合成路线如下：
具体包括以下步骤：
将化合物6或化合物7溶解于四氢呋喃中，搅拌，逐滴加入三氟乙酸酐，在室温下反应5～10min，反应完成后，旋干；在加入四氢呋喃溶解，向其中加入硼氢化钠和三氟化硼乙醚，回流1～3h，反应完成后，冷却至室温，加入水猝灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机相干燥，减压除去溶剂，硅胶柱分离；以石油醚：乙酸乙酯＝10:1为洗脱剂，减压除去溶剂，对应得到无色油状液体R3-2中间体1(8-甲氧基-5-R3-2基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)或R3-2中间体2(8-溴-5-R3-2基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)；其中，
当R3为R3-3时，合成路线如下：
具体包括以下步骤：
将化合物6或化合物7溶解于乙腈中，搅拌，向其中加入碳酸钾及溴乙腈或2-溴-N-烷基乙酰胺或N,N-二烷基-溴乙酰胺，回流1～4h，反应完成后，减压出去溶剂，硅胶柱分离，之后将分离所得产物溶于四氢呋喃，向其中加入硼氢化钠和三氟化硼乙醚，回流1～3h，反应完成后，冷却至室温，加入水猝灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机相干燥，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以石油醚:乙酸乙酯＝1:1为洗脱剂，减压除去溶剂，对应得到无色或淡黄色油状液体R3-3中间体1(8-甲氧基-5-R3-3-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)或R3-3中间体1(8-溴-5-R3-3-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)；
当R3为R3-1时，化合物6或7与的R3-1的溴取代基摩尔比为1:(1.5～2)；化合物6或7与碳酸钾的摩尔比为1:3；化合物6或7与乙腈的质量与体积比为1g:(10-30)mL；
当R3为R3-2时，化合物6或7与三氟乙酸酐摩尔为1:(1.5-3)；后加入的硼氢化钠及三氟化硼乙醚的摩尔量为化合物6或7的3～10倍；化合物6或7与四氢呋喃的质量与体积比为1g:(10-30)mL；
当R3为R3-3时，化合物6或7与溴乙腈或2-溴-N-烷基乙酰胺或N,N-二烷基-溴乙酰胺摩尔比为1:(1.5～3)，硼氢化钠及三氟化硼乙醚的摩尔量为8-溴-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉的3～10倍；化合物6或7与乙腈或四氢呋喃的质量与体积比为1g:(10～30)mL。
所述的高亮度、高光稳定性的深红荧光染料在多种生物荧光成像领域、发光材料、荧光探针及多色成像中的应用，其中：生物荧光成像领域共为聚焦成像、超分辨成像、活体成像等。
本发明的有益效果：
1)本发明涉及的荧光染料具有合成原料廉价，方法简单且容易进行修饰及功能化等优点。
2)本发明涉及的含氟取代的荧光染料在水溶液中的吸收光谱介于在550-720nm，发射光谱介于600-830nm，属于远红-近红外光谱区。
3)本发明涉及的含氟取代的荧光染料在水溶液中具有高的荧光量子产率(＞0.6)，具有合适的斯托克斯位移(＞60nm)，在生物成像领域应用时能够有效降低所用的激光强度，降低自淬灭的干扰，提高成像的信噪比，进而提升了成像的灵敏度。
4)本发明涉及的含氟取代的荧光染料对pH、极性、粘度及蛋白环境均表现出强的抗溶剂化效应，在不同环境中都能够保持高的荧光亮度，使得其被应用时所获得的荧光信号更加准确。
5)本发明涉及的含氟取代的荧光染料具有好的光稳定性，在成像时可以提供更加准确的荧光信号，能够被用于长时间的超分辨成像等先进的成像技术领域。
6)本发明是基于之前设计发明的DQF染料，通过在吩嗪稠合结构3号位的N原子上引入不同的吸电子基团(R3)，通过亲核取代及硼氢化钠或氢化铝锂还原，我们可以得到中间体，之后将之与苯酮酸反应得到相应的罗丹明类荧光染料。与经典荧光染料(Rhodamine，Rhodol，香豆素，Boranil)相比，本发明的染料表现出红移的发射光谱、更好的光稳定性及大的Stokes位移，并且能够在一定程度上抵御微环境的变化(如pH、粘度、蛋白及极性环境)，在水溶液中的亮度明显增强。该染料可以被设计生成各种标记试剂或探针用于蛋白质标记及生物标志物的检测。并得益于其较高的量子产率及光稳定性，这些探针或标记试剂能够被用于长时间的先进的成像技术，如STED显微成像等。
附图说明
图1实施例1制备的BDQ-3的核磁谱图氢谱。
图2实施例1制备的BDQ-3的核磁谱图碳谱。
图3实施例2制备的BDQ-6的核磁谱图氢谱。
图4实施例2制备的BDQ-6的核磁谱图碳谱。
图5实施例3制备的BDQ-8的核磁谱图氢谱。
图6实施例3制备的BDQ-8的核磁谱图碳谱。
图7实施例4制备的BDQF-3的核磁谱图氢谱。
图8实施例4制备的BDQF-3的核磁谱图碳谱。
图9实施例4制备的BDQF-6的核磁谱图氢谱。
图10实施例4制备的BDQF-6的核磁谱图碳谱。
图11实施例4制备的BDQF-8的核磁谱图氢谱。
图12实施例4制备的BDQF-8的核磁谱图碳谱。
图13实施例5制备的BDQF-10的核磁谱图氢谱。
图14实施例5制备的BDQF-10的核磁谱图碳谱。
图15实施例6制备的BDQF-12的核磁谱图氢谱。
图16实施例6制备的BDQF-12的核磁谱图碳谱。
图17实施例7测试的BDQF-6在四种溶剂中的的紫外吸收及荧光光谱及其光学性质。
图18实施例8测试的BDQF-6与RhB在PBS中归一化的紫外及荧光光谱。
图19实施例9中DQF以及不同取代基BDQF染料在PBS中的荧光性质对比。
图20实施例10测试的BDQF-6在1W 530nm激光照射下荧光强度随时间的变化。
图21实施例11测试的BDQF-6-Halo与RhB-Halo在细胞中完全标记时的成像亮度对比。
图22实施例12测试的BDQF-6-Halo与RhB-Halo在细胞中完全标记时的光稳定性对比。
具体实施方式
实施例1
R3取代基为R3-1中的N,N-二甲基乙酰氨基，其中R3-1中间体1(BDQ-3)的制备步骤如下：
8-甲氧基-5-(N,N-二甲基乙酰氨基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉(BDQ-3)的合成：将1.5mmol的8-甲氧基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉溶解于10ml的乙腈中，接着向其中加入1.8mmol的N,N-二甲基溴乙酰胺及2.2mmol的碳酸钾，回流2h，反应完成后，减压除去溶剂，硅胶柱分离。以石油醚：乙酸乙酯＝10:1为洗脱剂，减压出去溶剂，得到无色油状液体的BDQ-3(8-甲氧基-5-(N,N-二甲基乙酰氨基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)，其结构式如下：
对制备的BDQ-3进行核磁测试，其结果如图1和图2所示，具体如下：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.43(d,J＝8.2Hz,1H),6.09(s,2H),3.99(s,2H),3.77(s,3H),3.35(s,3H),3.05(d,J＝37.9Hz,8H),2.10(dd,J＝11.3,6.1Hz,2H),2.03–1.94(m,1H),1.47(d,J＝7.6Hz,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.90,154.02,137.05,127.91,111.55,99.36,98.43,56.79,55.64,53.61,47.88,36.97,35.87,30.26,23.74.MALDI-TOF/MS,m/z:calc 289.18,found 289.22.
从核磁谱图可以看出，其结果与BDQ-3结构式是完全一致的。
实施例2
R3取代基为R3-2中的三氟乙基，其中R3-2中间体1(BDQ-6)的制备步骤如下：
8-甲氧基-5-三氟乙基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉(BDQ-6)的合成：将1.5mmol的8-甲氧基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉溶解于10ml四氢呋喃中，搅拌，逐滴加入1.8mmol的三氟乙酸酐，在室温下反应10min，反应完成后，旋干；再加入15ml的四氢呋喃溶解，向其中加入7.5mmol的硼氢化钠和7.5mmol的三氟化硼乙醚，回流1.5h，反应完成后，冷却至室温，加入水猝灭反应，用乙酸乙酯萃取，有机相干燥，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以石油醚:乙酸乙酯＝10:1为洗脱剂，减压出去溶剂，得到无色油状液体的BDQ-6(8-甲氧基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉)，其结构式如下：
对制备的BDQ-6进行核磁测试，其结果如图3和图4所示，具体如下：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.66(d,J＝8.6Hz,1H),6.20(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H),6.13–6.07(m,1H),3.76(d,J＝7.5Hz,4H),3.64(dd,J＝16.1,8.9Hz,1H),3.49–3.36(m,2H),3.30(t,J＝8.0Hz,2H),2.86(t,J＝10.2Hz,1H),2.09(dt,J＝10.9,6.3Hz,2H),1.97(q,J＝8.2,7.8Hz,1H),1.49–1.38(m,1H).13C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ154.38,136.74,126.93,124.23,114.10,100.08,98.57,55.51,54.56,54.02,47.29,29.81,23.19.ESI/MS,m/z:calc 286.13,found 286.13.
从核磁谱图可以看出，其结果与BDQ-6结构式是完全一致的。
实施例3
R3取代基为R3-3中的2-氨基乙基，其中R3-3中间体1(BDQ-8)的制备步骤如下：
1.5mmol的8-甲氧基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉溶解于10ml乙腈中，搅拌，向其中加入4.5mmol碳酸钾及1.7mmol溴乙腈，回流4h，反应完成后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，将分离所得产物溶于四氢呋喃，向其中加入硼氢化钠及三氟化硼乙醚，回流3h。之后冷却反应体系至室温，加10mL水猝灭反应，调节溶液至强碱性，用乙酸乙酯萃取三次，有机相干燥，旋干，硅胶柱分离。以石油醚:乙酸乙酯＝1:1为洗脱剂，减压除去溶剂，得到无色或淡黄色油状的BDQ-8(2-(8-甲氧基-2，3，3a，4-四氢吡咯[1,2-a]喹喔啉-5(1H)-基)乙基-1-胺)。
对制备的BDQ-8进行核磁测试，其结果如图5和图6所示，具体如下：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.54(d,J＝8.6Hz,1H),6.14(dd,J＝8.5,
2.3Hz,1H),6.06(s,1H),4.00(s,2H),3.75(s,3H),3.58(dt,J＝13.4,6.9Hz,1H),3.35(dt,J＝20.3,10.2Hz,3H),3.27–3.15(m,2H),3.05(s,1H),2.85(dd,J＝12.7,6.6Hz,1H),2.53(t,J＝10.4Hz,1H),2.07(dt,J＝16.8,8.3Hz,2H),2.00–1.91(m,1H),1.43–1.36(m,1H).13C NMR(100MHz,Chloroform-d)δ153.71,137.21,128.65,112.60,99.60,98.48,77.23,56.22,56.15,55.73,53.29,47.77,39.42,30.25,23.65.
从核磁谱图可以看出，其结果与BDQ-6结构式是完全一致的。
实施例4
Ⅰ型吩嗪稠合结构的荧光染料的合成：将0.35mmol的8-甲氧基-5-(N,N-二甲基乙酰氨基)-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉(BDQ-3实施例1制备)或8-甲氧基-5-三氟乙基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉(BDQ-6实施例2制备)或2-(8-甲氧基-2，3，3a，4-四氢吡咯[1,2-a]喹喔啉-5(1H)-基)乙基-1-胺(BDQ-8实施例3制备)溶于2ml的甲基磺酸中，搅拌溶解，向其中加入0.38mmol的4-二乙氨基酮酸，在90℃反应2h。之后将反应液倒入冰水中，加入0.5ml的高氯酸，有大量固体析出，抽滤，洗涤固体，干燥，硅胶柱分离；以二氯乙烷:乙醇＝100:(1～5)为洗脱剂，减压除去溶剂，对应得到BDQF-3或BDQF-6或BDQF-8，其结构式如下所示：
对制备的BDQF-(3，6，8)进行核磁测试，其结果如图7-12所示，具体如下：
BDQF-3：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.47(t,J＝7.3Hz,1H),7.98–7.87(m,2H),7.43(t,J＝7.1Hz,1H),7.25(t,J＝9.0Hz,1H),7.02(d,J＝9.2Hz,1H),6.98(s,1H),6.81(s,1H),5.70(d,J＝7.6Hz,1H),4.26(t,J＝9.9Hz,1H),4.05–3.99(m,1H),3.97–3.87(m,2H),3.72(d,J＝7.2Hz,6H),3.53–3.46(m,1H),2.98–2.87(m,6H),2.47–2.35(m,2H),2.35–2.20(m,1H),1.79–1.70(m,1H),1.42(t,J＝6.9Hz,6H).13C NMR(100MHz,Methanol-d4)δ169.23,167.80,167.23,157.28,156.19,155.62,154.43,147.48,135.50,134.89,133.66,133.20,132.11,131.68,131.23,130.65,115.95,114.29,104.10,96.68,95.72,58.97,53.27,52.81,46.26,36.74,36.04,30.57,23.67,12.90.HRMS(ESI):m/z calc.forC33H37N4O4[M]553.2809；found 553.2814.
BDQF-6：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.43–8.36(m,1H),7.85(dt,J＝21.6,7.5Hz,2H),7.38(t,J＝8.4Hz,1H),7.21(t,J＝9.4Hz,1H),7.02–6.91(m,2H),6.80(s,1H),6.27(d,J＝7.5Hz,1H),3.97–3.86(m,2H),3.85–3.77(m,3H),3.68(q,J＝6.8Hz,5H),3.17(t,J＝10.8Hz,1H),2.37(dd,J＝11.9,6.2Hz,2H),2.29–2.14(m,1H),1.69(p,J＝11.7Hz,1H),1.37(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(100MHz,Methanol-d4)δ167.00,156.73,156.59,154.47,154.03,146.26,134.12,132.72,132.50,131.27,130.98,130.12,130.03,129.96,114.59,113.64,113.41,104.95,95.75,95.29,57.45,57.42,53.39,51.81,45.40,29.55,22.66,11.94.MALDI-TOF/MS,m/z:calc 550.23,found 550.17.
BDQF-8:1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.11(t,J＝8.7Hz,1H),7.68(dq,J＝13.5,6.8Hz,2H),7.44(dd,J＝19.3,9.5Hz,1H),7.29(dd,J＝20.3,7.2Hz,1H),7.03(t,J＝8.5Hz,1H),6.92(s,1H),6.75(s,1H),6.41(d,J＝13.6Hz,1H),3.82(t,J＝10.3Hz,1H),3.74–3.65(m,7H),3.28(p,J＝7.1,6.4Hz,1H),3.13–2.98(m,2H),2.37(dd,J＝9.9,5.6Hz,2H),2.25(dd,J＝22.3,8.1Hz,1H),2.01(s,2H),1.68(d,J＝8.4Hz,1H),1.50(d,J＝23.1Hz,2H),1.39(d,J＝6.5Hz,6H).13C NMR(100MHz,Methanol-d4)δ157.46,156.61,156.36,155.91,154.79,147.98,134.56,134.46,133.55,132.18,132.00,131.25,131.05,130.96,115.55,114.46,104.99,96.71,96.09,58.93,52.24,49.15,47.77,46.29,30.38,23.64,14.45,12.90,9.28.
从核磁谱图可以看出，其结果与BDQF-(3，6，8)结构式是完全一致的。
实施例5
Ⅱ型吩嗪稠合结构的荧光染料的合成：将0.35mmol的8-甲氧基-5-三氟乙基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉(BDQ-6实施例2制备)溶于2ml的甲基磺酸中，搅拌溶解，向其中加入0.38mmol的间苯二酚，在90℃反应2h。之后将反应液倒入冰水中，加入0.5ml的高氯酸，有大量固体析出，抽滤，洗涤固体，干燥，硅胶柱分离；以二氯乙烷：乙醇＝100:(1-5)为洗脱剂，减压除去溶剂，得到BDQF-10，其结构式如下所示：
对制备的BDQF-10进行核磁测试，其结果如图13和图14所示，具体如下：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.32(s,1H),7.77(dt,J＝14.6,7.1Hz,2H),7.32(t,J＝7.4Hz,1H),7.16(t,J＝8.6Hz,1H),7.07(s,1H),6.92(d,J＝8.4Hz,1H),6.80(s,1H),6.21(d,J＝7.0Hz,1H),3.83(dt,J＝39.2,16.2Hz,5H),3.66(s,1H),3.21–3.06(m,1H),2.26(s,2H),2.11(s,1H),1.72–1.51(m,1H).13C NMR(100MHz,Methanol-d4)δ166.96,165.26,156.67,156.05,155.26,148.38,134.15,134.03,133.93,132.58,132.47,131.26,130.12,129.99,129.91,129.84,116.88,115.36,103.93,101.91,95.41,58.00,51.73,51.51,48.97,29.38,22.46.MALDI-TOF/MS,m/z:calc 494.15,found 495.10.[M+H]–
从核磁谱图可以看出，其结果与BDQF-10结构式是完全一致的。
实施例6
将实施例2中的原料由8-甲氧基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉换成8-溴-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉制备得到中间体2(BDQ-6’)。
Ⅲ型吩嗪稠合结构的荧光染料的合成：
(1)将0.9mmol的8-溴-5-三氟乙基-1,2,3,3a,4,5-六氢吡咯[1,2-a]喹喔啉(BDQ-6’)、1.0mmol的2-溴-4-(N,N二甲氨基)苄醇及1.5mmol的BF3·OEt2溶解于10ml的二氯甲烷，室温搅拌24h。向其中加入水猝灭反应，混合物用二氯甲烷萃取，分离有机相，干燥，浓缩，柱层析分离得到中间产物1。
(2)1mmol的中间产物1溶解在5ml的无水四氢呋喃中，冷却至-78℃。在氮气保护的前提下，向其中加入溶解有1M的正丁基锂(3mmol)的四氢呋喃溶液，在该温度下搅拌20min。之后，3mmol的二氯二甲基硅烷溶解在无水四氢呋喃中并被加入到上述溶液中，缓慢恢复室温，搅拌1h。5ml的2M HCl溶液被加入到上述溶液中以猝灭反应。向混合物中加入饱和碳酸氢钠以中和溶液pH，用二氯甲烷萃取。有机相被分离，用无水硫酸钠干燥，旋干。残渣被溶于丙酮中，并降至0℃，搅拌，在接下来的3h，将3mmol的高锰酸钾分批次加入其中。将混合物用硅藻土过滤，溶液旋干，柱层析分离得到中间产物2。
(3)将0.5mmol的中间产物2溶解于5ml的无水四氢呋喃中，在氮气保护的前提下，将1.5mmol的邻甲苯基氯化镁加入其中，混合物在80℃下回流2h。冷却至室温，2mmol的2M的HCl溶液被加入到上述溶液中以猝灭反应。向混合物中加入饱和碳酸氢钠以中和溶液pH，用二氯甲烷萃取。有机相被分离，用无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析分离得到BDQF-12，其结构式如下所示：
对制备的BDQF-12行核磁测试，其结果如图15和图16所示，具体如下：
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.49–7.33(m,3H),7.28(s,1H),7.15–7.05(m,3H),6.70(d,J＝9.0Hz,1H),6.32(d,J＝3.9Hz,1H),3.97(t,J＝10.9Hz,1H),3.82(dd,J＝23.5,13.8Hz,2H),3.72(d,J＝11.8Hz,1H),3.58(dd,J＝24.0,7.9Hz,2H),3.06(t,J＝10.6Hz,1H),2.34–2.22(m,2H),2.04(d,J＝11.4Hz,3H),1.68–1.58(m,1H),1.49–1.22(m,6H),0.98(t,J＝7.4Hz,1H),0.60(dd,J＝16.1,6.1Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ169.39,154.81,148.20,145.05,144.68,141.34,140.46,136.95,136.78,134.29,134.07,132.33,131.23,130.05,129.86,129.13,126.69,121.55,118.54,114.69,66.69,59.60,53.19,52.80,40.93,30.42,23.94,19.65,14.18.MALDI-TOF/MS,m/z:calc 534.25,found 534.13。
从核磁谱图可以看出，其结果与BDQF-12结构式是完全一致的。
性能测试:
将该类染料分别溶解在DMSO溶液中配置成不同染料的1mM母液，根据需要配置成不同浓度的测试溶液，以检测其荧光光谱及被用于细胞内的荧光成像。
实施例7
BDQF-6在四种溶剂(二氯甲烷、乙腈、乙醇和20mM PBS缓冲液(pH＝7.4))中的紫外吸收及荧光发射光谱测试。取5μL BDQF-6母液，分别加入1mL的上述四种溶剂，使用混匀仪混匀，即得到5μM的荧光染料测试液，之后进行紫外吸收及荧光光谱测试。之后通过相应公式计算BDQF-6的包括摩尔消光系数及荧光量子产率在内的光谱性质。荧光量子产率的测定。使用甲酚紫在乙醇溶液中的量子产率作为参比(Φf＝0.58)。荧光量子产率可根据以下公式进行计算：
Absref及Abssam为参比及待测液在参比激发波长处的吸收强度；Fref及Fsam为对应激发处的荧光强度的积分值；ηsam及ηref为样品及参比所用溶液的折射率。待测液及参比溶液的吸收不高于0.05。
如图17所示，其在四种溶剂中的最大吸收波长为575-585nm，最大发射波长在620-640nm。且其在四种溶剂中的吸收及发射强度比较接近，说明了它受溶剂极性的影响较小，能够在复杂的生理环境中提供较为准确的荧光信号。
实施例8
BDQF-6与RhB在PBS中的紫外吸收及荧光光谱测试。取5μL BDQF-6与RhB母液，分别加入1mL的20mM的PBS中，使用混匀仪混匀，即得到5μM的荧光染料测试液，之后进行紫外吸收及荧光光谱测试并对结果进行归一化。
如图18所示，相较于RhB，BDQF-6的激发和发射光谱具有更小的重叠，具有更大的Stokes位移，能够有效的规避生物样品的背景散射带来的自淬灭，增加染料的成像信噪比。
实施例9
不同取代基的BDQF染料在20mM PBS缓冲液(pH＝7.4)中的光物理性质测试。取5μLBDQF-6母液，分别加入1mL的上述四种溶剂，使用混匀仪混匀，即得到5μM的荧光染料测试液，之后进行紫外吸收及荧光光谱测试。之后通过相应公式计算BDQF-6的包括摩尔消光系数及荧光量子产率在内的光谱性质。荧光量子产率的测定。使用甲酚紫在乙醇溶液中的量子产率作为参比(Φf＝0.58)。具体的计算方法参照实施例6。
其结果可见图19，相较于之前的DQF染料相比，BDQF染料在PBS中的荧光量子产率得到了大幅度的提升。其中，三氟乙基取代的BDQF-6染料的量子产率是DQF-584的12倍，是传统的对称染料RhB的2倍，且BDQF-6依然保持了两倍于RhB的Stokes位移(56nm)，进而说明了这类染料在先进的成像技术中获取高质量图像的潜力。
实施例10
BDQF-6在1W 530nm激光照射下荧光强度随时间变化测试。取5μL BDQF-6母液及5μL 1mM RhB母液，向其中分别加入1mL含有0.1％三氟乙酸的乙醇溶液，混匀。之后加入螺纹比色皿中，使用激光连续照射，分别采用0,20,40,60,80min为时间节点进行荧光光谱测试，并选取染料荧光发射峰值对时间进行作图，并作归一化处理。
如图20所示，在80min的连续照射下，BDQF-6的荧光降低了约17％，与此同时，RhB的荧光降低了约60％，说明了BDQF-6具有更好的光稳定性，具备被用于长时间成像的潜力。
实施例11
细胞中BDQF-6的亮度测试。使用1μL BDQF-22-Halo的母液溶于1mL的细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育转染了H2B-Halo蛋白的HeLa细胞4h，之后直接进行共聚焦成像。
如图21所示，在细胞内的Halo蛋白被完全标记且在完全一致的成像条件下，BDQF-6-Halo的荧光强度约是RhB-Halo的1.5倍，说明了BDQF-6-Halo在蛋白质标记中具有更高的成像亮度，进而印证了BDQF-6具有更高的亮度，能够被用于低功率的成像，有利于降低对细胞或组织造成的损伤。
实施例12
受激发射损耗显微成像(STED)中BDQF-6的光稳定性测试。基于BDQF-6构架一个Halo蛋白的探针(BDQF-22-Halo)，将BDQF-22-Halo溶于DMSO中形成200μM母液。取1μL母液溶于1mL的细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育波形蛋白被转染了Halo蛋白的U2OS细胞4h，之后进行细胞固定，并使用STED进行成像。
如图22所示，分别使用BDQF-6-Halo、CPY-Halo及JF608-Halo作为标记试剂对U2OS细胞中被转染的Halo-vimentin蛋白进行完全标记。在同样的成像条件下，BDQF-6能够获得15帧波形蛋白的图像，且依然保持相对清晰的成像效果。但CPY-Halo或JF608仅能够成像5帧，且所获图像已经丢失了很多细节，成像效果欠佳。这说明了BDQF-6有潜力被用于需要长时间获取的超分辨成像，如超分辨3D成像等。
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