一种红色疏水色素及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种红色疏水色素及其制备方法与应用 (Red hydrophobic pigment and preparation method and application thereof ) 是由 华夏 孙磊 丁叶 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本申请公开了一种红色疏水色素化合物及其制备方法与应用,该红色疏水色素化合物的分子量为512,分子式是C-(28)H-(20)N-(2)O-(8),该化合物是以全基因合成得到核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的合成酶DeBI在酿酒酵母工程菌表达后获得,该化合物具有疏水疏油的特性,显色性、匀染性和色牢度较好,可广泛应用于合成纤维、塑料、橡胶、皮革、涂料、油墨、油漆、化妆品、食品添加剂等领域,且该化合物利用的工程菌合成,产率高,不受原料来源限制,无毒无害,易于降解,不会对生态环境造成污染。(The application discloses a red hydrophobic pigment compound, a preparation method and an application thereof, wherein the molecular weight of the red hydrophobic pigment compound is 512, and the molecular formula is C 28 H 20 N 2 O 8 The compound is obtained by expressing a synthetase DeBI with a nucleotide sequence shown in SEQ ID No.1 obtained by whole gene synthesis in saccharomyces cerevisiae engineering bacteria, and the compoundThe compound has the characteristics of hydrophobicity and oleophobicity, good color rendering property, level dyeing property and color fastness, can be widely applied to the fields of synthetic fibers, plastics, rubber, leather, coatings, printing ink, paint, cosmetics, food additives and the like, is synthesized by utilizing engineering bacteria, has high yield, is not limited by raw material sources, is non-toxic and harmless, is easy to degrade, and cannot cause pollution to the ecological environment.)
技术领域
本申请涉及生物工程领域，特别是一种新型红色疏水色素及其制备方法与应用。
背景技术
近些年来，随着技术的进步和人民生活水平的提高，染料的应用越来越广泛，特别在食品、化妆品领域，对于无毒环保染料的需求越来越大，这对染料工业的发展提出了更高的要求。
按照染料的来源，可分为天然染料及合成染料两大类。天然染料应用较早，且大多无毒环保，但存在着在自然界中含量有限、提取工艺复杂、生产成本高等局限性。并且天然染料大部分含有较多羟基，水溶性较高，染色的牢固度不高。合成染料与天然染料相比具有色泽鲜艳、不受原料来源限制、生产成本低等优点，但缺点在于合成染料大多结构复杂，生物毒性高，在自然界中很难降解或降解成本很高，对生态环境破坏较大。天然染料与合成染料的上述缺点严重制约了染料工业的迅速发展及其应用领域的进一步拓展。
发明内容
针对上述问题，本发明采用生物材料合成无毒环保的新型疏水疏油的红色天然染料化合物(I)，该染料属于萘醌类化合物，其结构式如下(I)所示：
该化合物(I)的分子量为512，分子式是C28H20N2O8，质谱检测结果见附图2；特征紫外吸收波长为207nm，242nm，280nnm,423nm，紫外吸收谱见附图1。
该化合物(I)的核磁数据为：1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.99(3H,s,H-11),2.34(3H,s,H-11’),3.76(3H,s,6-OCH3),3.85(3H,s,6’-OCH3),6.20(1H,s,H-9),6.52(1H,s,H-9’),6.55(1H,s,H-5),7.37(1H,s,H-7’),12.78(1H,s,4-OH),13.44(1H,s,4’-OH),12.85(1H,s,2or2’-NH)；DEPTQ-135 13C-NMR(125MHz,DMSO-6d)δ14.4(C-11),13.2(C-11’),135.5(C-10),140.1(C-10’),106.3(C-9),108.1(C-9’),130.1(C-1),131.3(C-1’),122.9(C-2),128.4(C-2’),174.4(C-3),184.2(C-3’),107.9(C-3a),135.5(C-3b),111.1(C-3a’),136.5(C-3b’),169.3(C-4),161.7(C-4’),99.4(C-5),115.1(C-5’),166.3(C-6),57.4(6-OCH3),163.1(C-6’),57.0(6’-OCH3),111.9(C-7),104.1(C-7’),179.1(C-8),179.9(C-8’).
化学结构式的编号见附图3。
其次，本申请还提供了该红色疏水色素(化合物I)的制备方法，其具体步骤如下：
1)使用引物5’-CGggatcc ATGGGGTCGACTAGCCAC-3’(SEQ ID NO.3)和引物5’-CGgaattcCTACCGAAATGCCTTCTCAAG-3’(SEQ ID NO.4)通过聚合酶链式反应扩增如SEQ IDNO.1所示的DeBI基因,将扩增得到的DeBI基因通过限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI连接到pYES2质粒载体中，获得重组质粒pYES2-DeBI；然后将重组质粒pYES2-DeBI转化进入酿酒酵母工程菌INVSc1中，获得转化后的工程菌，申请人将该转化后的工程菌自命名为工程菌S；
2)从保存有工程菌S的固体培养基上挑取单个菌落于SC培养基中，于28℃，200rpm摇床中培养24小时，即得工程菌S的种子培养液；吸取工程菌S的种子培养液加入到的SC培养基之中，于28℃，200rpm摇床中发酵培养24小时；
用分光光度计与600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液600nm波长下吸光度达到0.8时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨至上述发酵液中，将发酵液置于28℃，200rpm摇床中发酵培养72小时，获得培养物；
3)培养物分离纯化：培养结束后，取培养物于离心机中850×g离心5分钟去除工程菌S的细胞；将去除细胞后的发酵液用氯仿萃取；此过程重复2次，即获得萃取液，其中包含化合物I；
4)将步骤3)获得的萃取液干燥至恒重(优选38℃真空干燥)，获得萃取物；将萃取物过硅胶柱(优选200-300目)层析，收取100％氯仿洗脱的组分，并通过旋转蒸发干燥；
5)清洗：将干燥产物用10mL甲醇振荡悬浮，21000×g离心10分钟，弃上清，取沉淀，此过程重复2次用于去除有机物杂质，获得粗提物；之后分别以乙酸乙酯和正己烷代替甲醇，采用同样的方法清洗该粗提物，将获得的产物干燥，即为纯净的红色素化合物I。
本申请获得的化合物(I)属于有机颜料，可广泛应用于合成纤维、塑料、橡胶、皮革、涂料、油墨、油漆、化妆品、食品添加剂等领域。
本发明以埃默森蓝状菌Rasamsonia emersonii CBS 393.64菌基因组DNA作为模板,通过全基因合成得到化合物(I)合成酶基因DeBI，合成得到的DeBI基因序列如SEQ IDNo.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。改造后的合成酶DeBI显著提升了化合物I的产率，为3.68g/L。
本申请首次利用改造后的合成酶DeBI基因在酿酒酵母工程菌INVSc1中表达，合成新型疏水疏油的天然红色染料I。该利用的工程菌合成红色天然染料I的方法及提取工艺染料产率高，不受原料来源限制，操作过程易控制，生产成本低。
红色天然染料I为首次合成疏水疏油的新化合物，显色性、匀染性和色牢度较好，其合成原料来自酿酒酵母菌体自身的代谢产物，无毒无害，易于降解，不会对生态环境造成污染。
附图说明
图1为红色素化合物I的紫外吸收谱。
图2为红色素化合物I的质谱检测图[M-H]+。
图3为红色素化合物I的化学结构式编号。
图4为实施例3化合物I检测结果图。
具体实施方式
实施例所涉及的试剂及培养基成分为：
SC培养基(以质量百分数计)：缺乏尿嘧啶的缺陷型氨基酸混合物(DOSupplement-Ura)0.062％，不含碳源无氨基酸酵母氮源(SC Minimal Medium)6.4％，葡萄糖2％；pH5.5。
实施例中使用的乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、正己烷、氯仿、甘油、油脂和DMSO购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
酿酒酵母工程菌INVSc1购自Invittrogen公司。
以下实施例涉及的原料、器材除非特别说明，均由市售途径购买获得。
实施例1制备化合物(I)
本实施例制备红色天然染料(化合物I)的具体步骤如下：
1)使用序列如SEQ ID NO.3所示的前引物和序列如SEQ ID NO.4所示的后引物通过聚合酶链式反应扩增如SEQ ID NO.1所示的DeBI基因,将扩增得到的DeBI基因通过限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI连接到pYES2质粒载体中，获得重组质粒pYES2-DeBI；然后将重组质粒pYES2-DeBI转化进入酿酒酵母工程菌INVSc1中，获得转化后的工程菌，申请人将该转化后的工程菌自命名为工程菌S；
2)从保存有工程菌S的固体培养基上挑取单个菌落于2ml的SC培养基中，于28℃，200rpm摇床中培养24小时，即得工程菌S的种子培养液；吸取1ml工程菌S的种子培养液加入到的SC培养基之中，于28℃，200rpm摇床中发酵培养24小时；
用分光光度计与600nm波长下检测上述发酵液的吸光度，待发酵液600nm波长下吸光度达到0.8时，添加终浓度为1％的酵母浸膏和2％的蛋白胨至上述发酵液中，将发酵液置于28℃，200rpm摇床中发酵培养72小时，获得培养物；
3)培养物分离纯化：培养结束后，取200mL培养物于离心机中850×g离心5分钟去除工程菌S的细胞；将去除细胞后的发酵液用200mL氯仿萃取；此过程重复2次，所获得的萃取液即包含化合物(I)；
4)将步骤3)获得的萃取液38℃真空干燥至恒重，获得萃取物；将萃取物过硅胶柱(200目)层析，收取100％氯仿洗脱的组分，并通过旋转蒸发干燥；然后将干燥产物用10mL甲醇振荡悬浮，21000×g离心10分钟，弃上清，重复本步骤2次用于去除有机物杂质，获得粗提物；
然后分别以乙酸乙酯和正己烷代替甲醇，采用同样的方法清洗该粗提物，干燥后得到红色是固体粉末。
经检测，该粉末结构式如所示，申请人将其命名为化合物(I)。其紫外吸收谱如图1所示，质谱检测图[M-H]+如图2所示，化学结构式编号如图3所示。
本实施例中，根据200mL培养物得到的红色化合物的量推算出1L发酵液中的总产量，计算获得工程菌S的培养物中化合物I产量达到最高，为3.68g/L，说明该化合物具有较高的酵母菌生物合成率。
实施例2化合物(I)溶解度的测试
在25℃下，分别称取100mL溶液：乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、正己烷、氯仿、甘油、油脂和DMSO放入烧杯中。分别称取20g实施例1获得的红色色素固体粉末(即化合物I)，并分别加入盛有溶液乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、正己烷、氯仿、甘油、油脂和DMSO的烧杯中。逐步加入红色色素固体粉末的溶质，不断搅拌，充分溶解。保证溶液过饱和，过滤取出未溶解的固体红色素，并在55℃烘干24小时，保证溶剂完全挥发。分别称量未溶解的固体总质量，通过公式(20g-未溶解色素质量＝已溶解色素质量)，求出100mL溶剂中已经溶解的固体质量，即为该温度下该固体的溶解度。化合物I的溶解度检测结果如表1所示：
表1溶解度表(25℃，单位：g/100mL溶剂)
表1检测结果说明化合物I除了在DMSO溶解度较好外，均不溶于其他溶剂，其疏水疏油的特性表明化合物I不容易因为洗涤、沾染油污等原因掉色，色牢固好。
实施例3酿酒酵母工程菌INVSc1中生产化合物I的分析
1.包含空白质粒pYES2的酿酒酵母工程菌INVSc1通过与实施例1制备方法相同的方法培养72小时，取培养物备用。
2.取制备方法中的工程菌S的培养物和上述培养物，进行液相检测，420nm波长，流动相为乙腈-水(0.1％甲酸)，流速为1ml/min，洗脱方法为10-90％乙腈梯度洗脱60min。
检测结果如图4所示，包含空白质粒pYES2的酿酒酵母工程菌INVSc1的培养物如(图4A)所示，表明未检测到化合物I的合成；工程菌S的培养物如(图4B)所示，表明检测到化合物I；证明DeBI是合成化合物I的关键酶。
实施例4化合物I的提取、分析和纯化
包含重组质粒pYES2-DeBI的酿酒酵母工程菌INVSc1通过与实施例1相同的方法培养24小时，结果从重组工程菌S的1L培养物中分离得到0.79g的化合物I。
实施例5化合物I的提取、分析和纯化
包含重组质粒pYES2-DeBI的酿酒酵母工程菌INVSc1通过与实施例1相同的方法培养48小时，结果从重组工程菌S的1L培养物中分离得到1.91g的化合物I。
实施例6化合物I的提取、分析和纯化
包含重组质粒pYES2-DeBI的酿酒酵母工程菌INVSc1通过与实施例1相同的方法培养72小时，结果从重组工程菌S的1L培养物中分离得到3.68g的化合物I。
实施例7化合物I的提取、分析和纯化
包含重组质粒pYES2-DeBI的酿酒酵母工程菌INVSc1通过与实施例1相同的方法培养96小时，结果从重组工程菌S的1L培养物中分离得到3.58g的化合物I。
实施例8色素理化性质测定
取实施例1获得的化合物实施例1获得的化合物(I)，以常规方法进行理化特性检测：色差参数(DE、DC、DH)检测方法依照GB/T6688-2008进行,检测色差仪型号为KONICAMINOLTAcolor reader CR-10 Plus；粒径检测方法依照GB/T 19077-2016进行,检测仪器为马尔文3000；pH的测定参照GB/T 2390-2013进行,检测仪器为梅特勒FE28；强度指标检测方法依据GB/T 6688-2008进行,检测强度仪器型号为尤尼柯UV-4800；电导率指标检测方法依据GB11007-89进行，检测设备是梅特勒FE30K；粘度指标检测方法依据GB/T10247-2008进行，主要设备是粘度计，表面张力检测方法依据GB/T22237-2008进行,主要设备是安妙AS-120N张力仪。检测结果如下表2所示：
表2
由表2可见，实施例1获得的红色粉末化合物(I)初始粒径较小，有利于下游染色工业的的应用；同时，化合物(I)色差、老化率均具有较好的检测结果，证明该生物色素显色性、匀染性和色牢度较好，可以替代现有颜料，应用于合成纤维、塑料、橡胶、皮革、涂料、油墨、油漆、化妆品、食品添加剂等领域，绿色环保。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京合谷生命生物科技有限公司
<120> 一种红色疏水色素及其制备方法与应用
<141> 2021-09-15
<150> 2020109867826
<151> 2020-09-18
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggggtcga ctagccacgt ctatctcttc ggcgatcaaa ccggagagtt tgacactggg 60
ctccgtcgct tgatacaggc gaagaacaac agcctcttga cgtccttctt cgagagatgc 120
ttccacgctt tgcgccacga aatagctcag ctgccaccgt ctgatcgcca attctttcct 180
cgctttacca gcattgttga cttgctcgcg agatatcgcg agtcggggcc gaatccagca 240
ctcgaaagcg ccctcacttg catctaccag ttggcctcgt ttatcaacta ctacggcgat 300
gagggtcaag tctacccgtt aggctctgac agccatgtca tcggactgtg caccggactt 360
ctggctgctg ccgctgtcag ttcgtcgcgg acagttggcg agctcattcc agttgccatt 420
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cgaagcaatg gcactttcgc taactacgag cctcggattc cactgctatc gagtacgacc 780
ggaaaggtaa tggtcgctaa gagctttgaa gacctccttg agaccgctct ggaggaaatc 840
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ttgaaggaca atgacagagt gaacttgaca ggcagatccg aaaaatcaaa gatcgccatc 1080
atcggcctgt caggcagatt tcccgatgca ccaagccccg agcacttttg ggaagttctg 1140
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gagccggggc tttttgatcc gcgcttcttt aacatgtcac cccgcgaggc actccaggca 1320
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gatttgttgt ccgagaaact cgctgctgag ggaataaagg caacaaaatt gagagtacct 3240
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gtcaacttcc ttggggcact ggaagcaaca cgacatgcta agcttatggg tgaaagaacg 3480
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cagagcttgg cctctgtata tcttgcaggc attgaagttc aatggcggga ataccatcag 3660
gattttaaat cctgtcatca agtccttcac ctccctgcat acagctggga caacaagaac 3720
tactggattc cctacaagaa tgacttctgt ttgaccaaag gcgagggacc tattccccag 3780
gcggaatctc agccagcgca tcaatttttg acgacctcag tacagaagat tgtcgaggtc 3840
cacaatgaag gcggaaaagc aacagtcgtc atggaatcgg acatctctga ccctcttctc 3900
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gcagatattg cccagacact tggagattat ctcatcgaaa actttaaacc agagctgaga 4020
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gggccacaga tgttccgggc tactgctaca gcagactgga atgagaaatg tgcctctgtg 4140
cagatatatt ctgtcaattc agatggcaaa aagatggttg accatgggag ctgcttggtc 4200
aagttctcgg actgcaatgt ctggaaggaa gagtggaggc gccatgcata tctgattcga 4260
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acggtccttc cccctgccgg tggcttcaag ggtctgtcgc cggcaacgaa ggccgtccct 4800
ccgcgcccag ttgaacccat tgcgaaagta tccaatgcaa agccagcagt taagtcagct 4860
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acaatctcga gcaagttccg cgaggagctt aatattgacg tcgattcgtc cgtatttatg 5040
gaccacccaa gtgtcaagga cctgaagcaa ttcttgctac aggccagtcc gtcggacagc 5100
agcgagtcgt cagaagagtc tgcattcttt gaagattcct catcgtcaac agattcctcc 5160
acaccgggaa ctcccgggga tttctgtacc ccaggcccga aattcatgca agctggggaa 5220
agcagtacaa tgaaggtgat ccgtcagacg ctttctgaag aaatcggtgt gccgccagag 5280
gaattaacgg gaaccgcgaa cctcggtgag atggggatgg actctctcct atctctgaca 5340
gtgcttggga agctgcgaga gacgttggat ctcgacttgc catccgactt cttcatcgag 5400
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ccttcacccg ctcctgtttc aataccggcc ccggtggctc tcaagacgga agctttgatc 5520
gaatcgaagg tagtacaccc tcctgccacc tctattcttc ttcaaggaaa cccaaaaacg 5580
gcgacaaaga ccctgttcct gttccctgac gggtcgggct ctgcgacgtc ttatgcgagc 5640
ttgcctaaga cttctccaga tgtctgcgtc tacggactga actgtccata catgaagaca 5700
cctgagaatc tcaactgtgg gctgagtgat ctcactgcgc catacgtggc agagatccga 5760
cggcgacaac ccaaaggacc gtacaacttg ggcggctggt ccgcaggcgg catctgcgcg 5820
tatgatgcgg cccgccagct cgtactcgaa gaaggtgaga cagttgagcg gttgatcctt 5880
ctcgattcac cgttccccat cggcctcgag aagcttccgc ctcggctgta tcagttcttc 5940
gactcgatga aaatcttcgg cgaaggcaac gcgcccccgc caagctggct gctcccgcat 6000
ttcatggcct tcatcgacgc gctcgacgca tacaaggcgg tgccgtatcc aagcgacgac 6060
ccgcagtacc gcgaccggct cccaaagaca tacctcatct gggctaagga cggcgtctgc 6120
ggcaagccgg gcgatcctcg cccggagcct gcccctgacg gcagcaagga tccccgcgag 6180
atgctgtggc tgctgaacga ccggaaggac tttggtccca acgggtggga caccctcgtg 6240
ggcaaagata aggtcgctgc catcgagacc atttcggacg cgaaccactt caccatgatg 6300
aagggagaca aagccaaaga attatctgcg tttcttgaga aggcatttcg gtag 6354
<210> 2
<211> 2137
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gly Ser Thr Ser His Val Tyr Leu Phe Gly Asp Gln Thr Gly Glu
1 5 10 15
Phe Asp Thr Gly Leu Arg Arg Leu Ile Gln Ala Lys Asn Asn Ser Leu
20 25 30
Leu Thr Ser Phe Phe Glu Arg Cys Phe His Ala Leu Arg His Glu Ile
35 40 45
Ala Gln Leu Pro Pro Ser Asp Arg Gln Phe Phe Pro Arg Phe Thr Ser
50 55 60
Ile Val Asp Leu Leu Ala Arg Tyr Arg Glu Ser Gly Pro Asn Pro Ala
65 70 75 80
Leu Glu Ser Ala Leu Thr Cys Ile Tyr Gln Leu Ala Ser Phe Ile Asn
85 90 95
Tyr Tyr Gly Asp Glu Gly Gln Val Tyr Pro Leu Gly Ser Asp Ser His
100 105 110
Val Ile Gly Leu Cys Thr Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala Val Ser Ser
115 120 125
Ser Arg Thr Val Gly Glu Leu Ile Pro Val Ala Ile Glu Val Val Val
130 135 140
Thr Ala Leu Arg Leu Gly Leu Cys Ala Leu Lys Val Arg Asp Leu Val
145 150 155 160
Gly Gln Tyr Glu Ala Gln Ser Gln Ser Trp Ser Ala Val Ile Ser Gly
165 170 175
Leu His Glu Asp Gln Ala Leu Val Ala Ile Arg Glu Phe Ser Lys Arg
180 185 190
Lys Ala Leu Ser Pro Ser Ser Gln Pro Tyr Ile Ser Ala Val Ser Ser
195 200 205
His Ser Leu Thr Ile Ser Ala Pro Pro Leu Ile Leu Glu Glu Phe Ile
210 215 220
Glu Ser Gln Leu Pro Arg Asp Val Lys Pro Phe Arg Val Pro Val His
225 230 235 240
Ala Pro Tyr His Ala Pro His Leu Tyr Gly Lys Val Asp Val Asp Trp
245 250 255
Ile Phe Lys Ser Arg Ser Asn Gly Thr Phe Ala Asn Tyr Glu Pro Arg
260 265 270
Ile Pro Leu Leu Ser Ser Thr Thr Gly Lys Val Met Val Ala Lys Ser
275 280 285
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290 295 300
Leu Cys Trp Asp Lys Val Leu Asp Gly Cys Ser Ser Val Leu Met Ser
305 310 315 320
Ala Gln Thr Ser Ser Cys Thr Ile Phe Pro Val Ala Thr Ala Ala Ser
325 330 335
Gln Gly Leu Met Ser Thr Leu Lys Arg Val Gly Ile Pro Asn Val Val
340 345 350
Leu Glu Asn Ser Thr Met Glu Thr Leu Lys Asp Asn Asp Arg Val Asn
355 360 365
Leu Thr Gly Arg Ser Glu Lys Ser Lys Ile Ala Ile Ile Gly Leu Ser
370 375 380
Gly Arg Phe Pro Asp Ala Pro Ser Pro Glu His Phe Trp Glu Val Leu
385 390 395 400
Tyr Lys Gly Leu Asp Val His Arg Glu Val Pro Pro Asp Arg Trp Asn
405 410 415
Val Lys Thr His Phe Asp Pro Thr Gly Lys Arg Arg Asn Thr Ser Gln
420 425 430
Val Pro Tyr Gly Cys Trp Ile Glu Glu Pro Gly Leu Phe Asp Pro Arg
435 440 445
Phe Phe Asn Met Ser Pro Arg Glu Ala Leu Gln Ala Asp Pro Ala Gln
450 455 460
Arg Leu Ala Leu Val Thr Ala Tyr Glu Ala Leu Glu Met Ala Gly Phe
465 470 475 480
Val Pro Asp Ser Thr Pro Ser Thr Gln Lys Asp Arg Val Gly Ile Phe
485 490 495
Tyr Gly Met Thr Ser Asp Asp Tyr Arg Glu Val Asn Ser Gly Gln Asp
500 505 510
Ile Asp Thr Tyr Phe Ile Pro Gly Gly Asn Arg Ala Phe Thr Pro Gly
515 520 525
Arg Ile Asn Tyr Tyr Phe Lys Phe Ser Gly Pro Ser Val Ser Val Asp
530 535 540
Thr Ala Cys Ser Ser Ser Leu Ala Ala Ile His Met Ala Cys Asn Ser
545 550 555 560
Leu Trp Arg Asn Asp Cys Asp Thr Ala Ile Ala Gly Gly Thr Asn Ile
565 570 575
Leu Thr Asn Pro Asp Asn Phe Ala Gly Leu Asp Arg Gly His Phe Leu
580 585 590
Ser Arg Lys Gly Asn Cys Asn Thr Phe Asp Asp Gly Ala Asp Gly Tyr
595 600 605
Cys Arg Ala Asp Ser Val Gly Thr Val Val Leu Lys Arg Leu Glu Asp
610 615 620
Ala Gln Ala Asp Asn Asp Pro Ile Leu Gly Val Ile Val Gly Ala Tyr
625 630 635 640
Thr Asn His Ser Ala Glu Ala Val Ser Met Thr Arg Pro His Val Gly
645 650 655
Ala Gln Ala Phe Ile Phe Asp Lys Leu Leu Asn Glu Ala Gly Val His
660 665 670
Pro His Glu Ile Ser Tyr Ile Glu Met His Gly Thr Gly Thr Gln Ala
675 680 685
Gly Asp Ala Val Glu Met Lys Ser Val Leu Asp Ile Phe Ala Pro Asp
690 695 700
His Arg Arg Lys Pro Glu Gln Ser Leu His Leu Gly Ser Ala Lys Ala
705 710 715 720
Asn Ile Gly His Ala Glu Ser Ala Ser Gly Val Ala Ser Leu Ile Lys
725 730 735
Val Leu Leu Met Met Arg Glu Asn Thr Ile Pro Pro His Cys Gly Ile
740 745 750
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755 760 765
Val His Ile Ala Phe Lys Pro Thr Pro Trp Thr Arg Pro Asp Ala Gly
770 775 780
Lys Arg Lys Val Phe Ile Asn Asn Phe Ser Ala Ala Gly Gly Asn Thr
785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Ile Ser Leu Arg Asn Asn Ile Lys Ser Leu Val Asp Tyr Ile Asn Lys
835 840 845
Asn Ile Gly Asn Cys Ala Asp Lys Glu Phe Leu Ala Lys Leu Ser Tyr
850 855 860
Thr Thr Thr Ala Arg Arg Ile His His Pro Phe Arg Val Met Val Ser
865 870 875 880
Gly Ser Ser Leu Val Glu Val Arg Asp Ala Leu Glu Ala Ser Val Arg
885 890 895
Lys Glu Ser Ile Ser Pro Val Pro Ala Ser Thr Pro Asn Val Gly Phe
900 905 910
Ile Phe Thr Gly Gln Gly Ala Gln Tyr Ala Ala Met Gly Lys Gln Leu
915 920 925
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930 935 940
Ile Gly Gln Ser Leu Gly Phe Pro Ser Phe Leu Pro Leu Ile Asp Gly
945 950 955 960
Ser Val Pro Ile Glu Asp Leu Ser Pro Leu Val Thr Gln Leu Gly Thr
965 970 975
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980 985 990
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995 1000 1005
Asn Ile Ser Gly Ala Leu Thr Ala Phe Asp Thr Ile Tyr Leu Cys Gly
1010 1015 1020
Arg Arg Ala Gln Leu Leu Glu Glu His Cys Lys Val Gly Thr His Ala
1025 1030 1035 1040
Met Leu Ala Leu Lys Ala Ser Leu Gly Gln Val Thr Pro Phe Leu Asn
1045 1050 1055
Gly Lys Val His Glu Ile Ala Cys Ile Asn Ala Pro Gly Glu Thr Val
1060 1065 1070
Ile Ser Gly Thr Cys Asp Asn Ile Asp Leu Leu Ser Glu Lys Leu Ala
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1090 1095 1100
Ser Ala Gln Val Glu Pro Ile Leu Glu Gln Leu Leu Glu Cys Ala Lys
1105 1110 1115 1120
Gly Val Lys Phe His Lys Pro Ser Ile Pro Phe Val Ser Ala Leu Leu
1125 1130 1135
Gly Glu Val Ile Thr Glu Ala Asn Tyr Asp Val Leu Ser Pro Ser Tyr
1140 1145 1150
Leu Ser Arg His Cys Arg Glu Thr Val Asn Phe Leu Gly Ala Leu Glu
1155 1160 1165
Ala Thr Arg His Ala Lys Leu Met Gly Glu Arg Thr Val Trp Ile Glu
1170 1175 1180
Ile Gly Ser His Thr Val Cys Ser Gly Met Ile Lys Ala Thr Ile Gly
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Pro Gln Ala Asn Thr Ile Ala Ser Leu Arg Arg Asn Glu Asp Ser Trp
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Lys Val Leu Ser Gln Ser Leu Ala Ser Val Tyr Leu Ala Gly Ile Glu
1220 1225 1230
Val Gln Trp Arg Glu Tyr His Gln Asp Phe Lys Ser Cys His Gln Val
1235 1240 1245
Leu His Leu Pro Ala Tyr Ser Trp Asp Asn Lys Asn Tyr Trp Ile Pro
1250 1255 1260
Tyr Lys Asn Asp Phe Cys Leu Thr Lys Gly Glu Gly Pro Ile Pro Gln
1265 1270 1275 1280
Ala Glu Ser Gln Pro Ala His Gln Phe Leu Thr Thr Ser Val Gln Lys
1285 1290 1295
Ile Val Glu Val His Asn Glu Gly Gly Lys Ala Thr Val Val Met Glu
1300 1305 1310
Ser Asp Ile Ser Asp Pro Leu Leu Asn Pro Val Ile Gln Gly His Lys
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Val Asn Gly Ala Ala Leu Cys Pro Ser Ser Leu Tyr Ala Asp Ile Ala
1330 1335 1340
Gln Thr Leu Gly Asp Tyr Leu Ile Glu Asn Phe Lys Pro Glu Leu Arg
1345 1350 1355 1360
Gly Ser Gly Leu Glu Val Cys Asn Met Thr Val Pro Lys Pro Leu Ile
1365 1370 1375
Ala Lys Asn Asp Gly Pro Gln Met Phe Arg Ala Thr Ala Thr Ala Asp
1380 1385 1390
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1395 1400 1405
Gly Lys Lys Met Val Asp His Gly Ser Cys Leu Val Lys Phe Ser Asp
1410 1415 1420
Cys Asn Val Trp Lys Glu Glu Trp Arg Arg His Ala Tyr Leu Ile Arg
1425 1430 1435 1440
Arg Ser Ile Asp Arg Leu Phe Gln Arg Ala Ala Asp Gly Glu Ser His
1445 1450 1455
Lys Leu Gly Arg Gly Met Val Tyr Lys Leu Phe Ser Ala Leu Val Glu
1460 1465 1470
Tyr Asp Ser Asn Tyr Lys Ser Met Glu Glu Val Ile Leu Asp Ser Glu
1475 1480 1485
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1490 1495 1500
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1505 1510 1515 1520
Phe Val Met Asn Ala Asn Asp Ala Thr Asp Ser Lys Thr Leu Val Phe
1525 1530 1535
Val Asn His Gly Trp Asp Ser Met Arg Cys Leu Lys Lys Phe Ser Ala
1540 1545 1550
Asp Thr Thr Tyr Arg Thr Tyr Val Lys Met Gln Pro Trp Gln Asn Asn
1555 1560 1565
Ile Tyr Ala Gly Asp Val Tyr Val Phe Glu Gly Asp Asp Ile Ile Ala
1570 1575 1580
Val Tyr Gly Gly Val Lys Phe Gln Gly Val Pro Arg Gln Val Leu Asn
1585 1590 1595 1600
Thr Val Leu Pro Pro Ala Gly Gly Phe Lys Gly Leu Ser Pro Ala Thr
1605 1610 1615
Lys Ala Val Pro Pro Arg Pro Val Glu Pro Ile Ala Lys Val Ser Asn
1620 1625 1630
Ala Lys Pro Ala Val Lys Ser Ala Thr Pro Ser Val Leu Val Gln Ala
1635 1640 1645
Leu Lys Ile Leu Ala Ser Glu Ile Gly Val Pro Glu Ser Glu Leu Ser
1650 1655 1660
Asp Asp Leu Gln Phe Ala Asp Tyr Gly Val Asp Ser Leu Leu Ser Leu
1665 1670 1675 1680
Thr Ile Ser Ser Lys Phe Arg Glu Glu Leu Asn Ile Asp Val Asp Ser
1685 1690 1695
Ser Val Phe Met Asp His Pro Ser Val Lys Asp Leu Lys Gln Phe Leu
1700 1705 1710
Leu Gln Ala Ser Pro Ser Asp Ser Ser Glu Ser Ser Glu Glu Ser Ala
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Phe Phe Glu Asp Ser Ser Ser Ser Thr Asp Ser Ser Thr Pro Gly Thr
1730 1735 1740
Pro Gly Asp Phe Cys Thr Pro Gly Pro Lys Phe Met Gln Ala Gly Glu
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Ser Ser Thr Met Lys Val Ile Arg Gln Thr Leu Ser Glu Glu Ile Gly
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2130 2135
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggaattcct accgaaatgc cttctcaag 29
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