一类内质网靶向激活型光敏剂的制备方法及应用
阅读说明：本技术 一类内质网靶向激活型光敏剂的制备方法及应用 (Preparation method and application of endoplasmic reticulum targeted activation type photosensitizer ) 是由 李昌华 杨凤 翟文豪 于 2021-01-18 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一类激活型内质网靶向光敏剂的制备方法及其应用,该类靶向激活型光敏剂首次被合成。式(Ⅰ)所示通式的化合物为该类内质网靶向激活型光敏剂激活后的结构通式,可由半花菁母核与3,5-二溴-4-羟基苯甲醛和3,5-二碘-4-羟基苯甲醛进行Knoevenagel反应得到,式(Ⅱ)所示通式的化合物为该类内质网靶向激活型光敏剂的结构通式,本发明创造性地在靶向激活型光敏剂式(Ⅱ)上预留官能团(R),并首次合成了过氧化氢刺激响应的内质网靶向光敏剂。本发明提供的一类靶向激活型光敏剂。解决了现有光敏剂选择性差、无法可视化、生理条件下可用范围小、光动力效果有限等技术问题。(The invention relates to a preparation method and application of an activated endoplasmic reticulum targeted photosensitizer, wherein the targeted activated photosensitizer is synthesized for the first time. The compound with the general formula shown in the formula (I) is a structural general formula of the activated endoplasmic reticulum targeted activation type photosensitizer, can be obtained by carrying out Knoevenagel reaction on hemicyanine mother nucleus, 3, 5-dibromo-4-hydroxybenzaldehyde and 3, 5-diiodo-4-hydroxybenzaldehyde, is a structural general formula of the endoplasmic reticulum targeted activation type photosensitizer, creatively reserves a functional group (R) on the targeted activation type photosensitizer formula (II), and synthesizes the endoplasmic reticulum targeted photosensitizer with hydrogen peroxide stimulation response for the first time. The invention provides a targeted activation type photosensitizer. The photosensitizer solves the technical problems of poor selectivity, incapability of visualization, small available range under physiological conditions, limited photodynamic effect and the like of the existing photosensitizer.)
技术领域
本发明涉及光动力治疗技术领域，具体涉及一类内质网靶向激活型光敏剂、制备方法及其应用。
背景技术
光动力疗法是一种光活化、无损伤的新兴治疗方式，通过有效光源激发光敏剂，将细胞内的氧气转化为细胞毒性单线态氧，从而杀死肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的效果，但是在实际应用中，光动力治疗仍然有很大的局限性，因此设计一个细胞器靶向激活型光敏剂势在必行。内质网在细胞蛋白质的合成过程中起着十分重要的作用。一方面，内质网作为细胞核，细胞质和细胞膜连接的膜结构，在物质转运过程中起着十分重要的作用；另一方面，内质网也是细胞中蛋白质合成的关键场所，蛋白质的折叠结构对细胞的生理功能十分重要，而蛋白质的错误折叠往往会引起细胞的死亡，因此内质网也成为临床应用中重要的治疗靶标。然而，大多数的内质网靶向光敏剂需要连接内质网靶向基团，使得光敏剂分子的结构及合成变得复杂，因此设计一个简单的内质网靶向激活型光敏剂很有必要。
在传统的光动力治疗中，通常是将光敏剂药物递送到肿瘤部位，但这种递送方式不仅使得药物在病患处累积，也会在正常组织部位积累，从而造成正常组织的损伤，而可激活光敏剂可以克服这一缺点，利用肿瘤细胞特殊的生理条件(例如酸性微环境，过表达的酶和过氧化氢等)，将其作为特定的触发因子，只在肿瘤部位激活光敏剂的光敏性，在光照下产生单线态氧杀死肿瘤细胞。将内质网靶向和生物因子激活的光动力疗法相结合，充分发挥二者优势，在外界光源照射下产生单线态氧，造成内质网功能障碍，导致蛋白质的错误折叠从而引起肿瘤细胞的死亡，进而达到治疗目的。不仅提高了药物在肿瘤部位的疗效，也减少了对正常组织部位的损伤，是一种更加精准的治疗方式。
发明内容
本发明提供了一类内质网靶向激活型光敏剂的制备方法及其应用，解决了现有光敏剂选择性差、无法可视化、生理条件下可用范围小、光动力效果有限等技术问题。
本发明提供了一类内质网靶向激活型光敏剂，具有如式(Ⅰ)所示的结构式，见附图11。
式(Ⅰ)中X为Br或I。
式(Ⅱ)中X为Br或I，R为
本发明以式(Ⅰ)中的结构式为母核，创造性地改造母核，将Br或I连接到母核，得到内质网靶向光敏剂分子，具体结构见附图1，合成步骤见附图3。
本发明提供了所述内质网靶向激活型光敏剂的制备方法，将式(Ⅰ)进一步进行改造，得到一类内质网靶向激活型光敏剂，具体结构见附图2，具体合成步骤见附图4。
作为优选，式(Ⅰ)中的Knoevenagel反应的溶剂为乙醇，温度为85℃回流。
作为优选，式(Ⅱ)中的Knoevenagel反应的溶剂为乙腈，温度为0℃，乙酸和哌啶的体积比为1：2。
作为优选，激活型的光敏剂分子ERPS2I-HP在乙腈和PBS(v/v,1/1)的体系中，在过氧化氢刺激下，60min内可以完全转化为光敏剂分子ERPS2I，见附图5。
作为优选，引入卤素(Br、I)原子，一方面可有效降低光敏剂酚羟基的pKa，使激活后的光敏剂在更广泛的pH范围内使用(见附图6)，另一方面有利于激发态电子进行隙间穿越，提高光动力效果。
作为优选，ERPS2I有较强的光动力，可以有效地进行光动力治疗，见附图7。
作为优选，ERPS2I-HP在可见光激发下基本没有荧光，而激活后的ERPT2I在可见光激发下有红色荧光，可以进行可视化地光动力治疗，见附图8。
作为优选，带正电荷的氮原子和卤素原子的引入是内质网靶向的关键部分，我们使用商业的内质网探针进行对比，结果二者荧光高度重合，皮尔森系数高达95％，说明激活后的ERPS2I对内质网的靶向性非常好，结果如附图9。
为了更进一步探究光敏剂对病患细胞的杀伤作用，利用MTT法研究了ERPS2I在光照条件下对HeLa细胞的毒性，结果如附图10所示，在光照条件下，ERPS2I在细胞内质网产生单线态氧，从而杀伤病患细胞。
以上所述仅为本发明的优选实施例，凡依照本发明做出的等同于替代或变换(例如，将R换成其它刺激响应性基团)，均在本发明的保护范围内。
附图说明
图1所述内质网靶向光敏剂的结构式。
图2所述内质网靶向激活型光敏剂的结构式。
图3所述内质网靶向光敏剂的合成路线。
图4所述内质网靶向激活型光敏剂的合成路线。
图5以I代光敏剂ERPS2I-HP为例，在过氧化氢激活下的紫外吸收。
图6所述ERPS2I在不同pH环境下在585nm处的紫外吸收。
图7所述ERPS2I以QDPBF为指示剂的光动力。
图8所述ERPS2I-HP在过氧化氢激活前后的荧光强度。
图9所述ERPS2I在病患细胞中的特异性定位(与商业内质网探针相比较)。
图10所述ERPS2I对病患细胞的杀伤(MTT)。
图11所述内质网靶向光敏剂及内质网靶向激活型光敏剂结构通式。
具体实施方式
下面结合附图(以X＝I为例)和具体实施例对本发明做出进一步的解释和说明，基于本发明中的实施例，本领域的技术人员，在没有做出创造性的劳动成果下所获得的其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例一：合成ERPS2I，合成路线见附图3
1)将化合物1(0.5g,2.1mmol)和3，5-二碘-4-羟基苯甲醛(0.6g,2.52mmol)溶解在10mL的乙醇中，然后加入2.4mL哌啶，将反应液在氩气保护下加热回流12小时，冷却至室温后，旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂进行柱层析提纯得纯品紫色化合物ERPS2I(0.83g,66.6％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm)8.76(s,1H),8.40(s,1H),8.26(d,J＝8.6Hz,1H),8.15–8.02(m,3H),7.78(dd,J＝8.9,1.2Hz,1H),7.68(dd,J＝8.5,6.9Hz,1H),7.54(t,J＝7.5Hz,1H),6.82(d,J＝14.8Hz,1H),4.47(q,J＝7.1Hz,2H),1.94(d,J＝1.2Hz,6H),1.43–1.30(m,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm)176.09,171.52,148.84,138.87,134.11,131.56,130.35,129.89,127.75,127.37,125.03,122.51,122.21,111.60,98.14,51.15,40.20,26.57,12.87.MS 593.9787.
实施例二：合成ERPS2I-HP，合成路线见附图4
1)将3，5-二碘-4-羟基苯甲醛(3.78g,10.1mmol,1.5eq)溶于30mL乙腈中，加入碳酸钾(1.85g,13.4mmol,2eq)室温搅拌30min，然后加入(2g,6.7mmol,1eq)，将该反应液在85℃搅拌回流12小时，冷却至室温后，旋蒸除去溶剂，以石油醚和二氯甲烷为洗脱剂进行柱层析，得白色固体产物(3g,75.8％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)9.83(d,J＝2.7Hz,1H),8.30(d,J＝2.7Hz,2H),7.88(dd,J＝8.0,2.5Hz,2H),7.63(dd,J＝7.9,2.5Hz,2H),5.10(d,J＝2.5Hz,2H),1.36(d,J＝2.7Hz,12H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm)188.14,162.249,141.36,138.56,135.568,135.06,127.63,91.95,83.97,74.65,24.99.
2)将化合物1(0.2g,0.84mmol,1eq)和化合物(0.74g,1.26mmol,1.5eq)溶于30mL乙腈中，然后滴加乙酸100uL,再加入哌啶200uL，在氩气保护下0℃搅拌6h,低温旋蒸除去溶剂，以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂进行柱层析，得黄色固体ERPS2I-HP(0.27g,39.7％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.85(s,2H),8.48–8.40(m,2H),8.23(d,J＝8.2Hz,1H),8.17(d,J＝9.0Hz,1H),7.85–7.80(m,1H),7.79–7.72(m,4H),7.64(d,J＝7.7Hz,2H),5.04(s,2H),4.93(q,J＝7.1Hz,2H),2.02(s,6H),1.54(t,J＝7.1Hz,3H),1.29(s,12H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ(ppm)182.003,159.955,148.81,141.19,139.19,139.10,137.97,134.63,134.52,133.37,131.21,130.06,128.52,127.49,127.45,127.447,123.30,113.34,113.26,93.32,83.74,73.87,54.10,42.86,25.19,24.68,14.23.
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于使用本技术领域的研究人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，对这些实施例进行的多种修改，这些修改应该视为本发明的保护范围。
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