阅读说明：本技术 一种pH近红外荧光探针的制备和应用 (Preparation and application of pH near-infrared fluorescent probe ) 是由 李春艳 佘遵攀 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及了一种pH近红外荧光探针的制备和应用,该荧光探针的结构式为：<Image he="286" wi="617" file="DDA0002253979420000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明提供了以1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚、环己酮、碘乙烷等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种pH近红外荧光探针；首先,该荧光探针在酸性环境下表现出很高的灵敏度；其次,该荧光探针对pH表现出较高的选择性,不受其他无机离子的干扰；并且,该荧光探针对pH反应非常迅速；此外,该荧光探针应用于区别正常细胞与癌细胞。(The invention relates to a preparation method and application of a pH near-infrared fluorescent probe, wherein the structural formula of the fluorescent probe is as follows: the invention provides a method for preparing 1,1, 2-trimethyl-1H-benzo [ e]A preparation method for synthesizing the fluorescent probe by taking indole, cyclohexanone, ethyl iodide and the like as raw materials; the fluorescent probe is a pH near-infrared fluorescent probe; firstly, the fluorescent probe shows high sensitivity in an acidic environment; secondly, the fluorescent probe shows higher selectivity for pH and is not interfered by other inorganic ions; also, the fluorescent probe reacts very rapidly to pH; in addition, the fluorescent probe is applied to distinguish normal cells from cancer cells.)

一种pH近红外荧光探针的制备和应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及基于花菁染料的pH近红外荧光探针的制备和应用。

背景技术

细胞内pH在许多细胞事件中起关键作用，包括细胞生长和凋亡，离子运输和体内稳态，钙调节，内吞作用和细胞粘附等等(Tang B,Yu F,Li P,et al.Journal of theAmerican Chemical Society,2009,131:3016-3023)。在正常的生理条件下，细胞外氢离子浓度保持在非常狭窄的范围内，微小的变化都将引起许多疾病(Lagadic-Gossmann D,Rissel M,Galisteo M,et al.British journal of pharmacology,1999,128:1673-1682.)。先前的证据表明，肿瘤的内部环境已被酸化(Schornack P A,Gillies RJ.Neoplasia,2003,5:135-145)。随着葡萄糖代谢的增加，癌症中H⁺的产生和***通常也会增加。与正常组织(pH 7.2-7.4)相比，在生理条件下，恶性肿瘤的细胞pH(pH 6.5-6.9)较低(Stubbs M,McSheehy P M J,Griffiths J R,et al.Molecular medicine today,2000,6:15-19；Van Sluis R,Bhujwalla Z M,Raghunand N,et al.Magnetic Resonance inMedicine:An Official Journal of the International Society for MagneticResonance in Medicine,1999,41:743-750)。因此，我们可以将pH看作有效的癌症生物标志物，将它视为早期发现癌症的突破口，这就迫切需要设计有效的方法去精确检测它。

荧光检测方法以其灵敏度高，操作简单，并且可以应用于生物成像等优点，受到了广泛的关注。近年来，有许多荧光探针被设计开发用来检测pH，比如：基于香豆素的探针(Dong B,Song X,Wang C,et al.Analytical chemistry,2016,88:4085-4091)，基于半花菁的探针(Wu L,Wang Y,James T D,et al.Chemical communications,2018,54:5518-5521；)和基于芘的探针(Cao L,Zhao Z,Zhang T,et al.Chemical Communications,2015,51:17324-17327)。但是，这些探针具有较短的激发和发射波长(<550nm)，导致过度的自发荧光和较浅的穿透深度，从而降低了探针的灵敏度，并阻碍了它们在生物系统中的应用。相比之下，近红外(NIR)荧光探针光损伤小，可以深入地渗透到组织中，从而最大程度地减少了背景荧光的干扰，对生物成像更有利。因此，设计并合成具有长波长发射的近红外荧光探针是非常有意义的。

花菁染料是一种近红外荧光染料。目前，基于花菁染料而设计出来的荧光探针已被用来检测Hg²⁺、NO、H₂O₂、和臭氧等等(Guo Z,Zhu W,Zhu M,et al.Chemistry-A EuropeanJournal,2010,16:14424-14432；Sasaki E,Kojima H,Nishimatsu H,et al.Journal ofthe American Chemical Society,2005,127:3684-3685；Yu F,Li P,Song P,etal.Chemical communications,2012,48:4980-4982；Xu K,Sun S,Li J,et al.ChemicalCommunications,2012,48:684-686)。但是，基于花菁染料被用来检测pH的探针非常少。因此，设计和合成一个基于花菁染料的近红外荧光探针用来检测pH，并用于区别正常细胞与癌细胞是非常有必要的。

发明内容

根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种基于花菁染料的pH近红外荧光探针。

本发明的技术方案是，一种pH近红外荧光探针，其结构式如下：

一种pH近红外荧光探针的制备方法。步骤如下：

在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的花菁CyCl和2～3当量的乙酸钠溶解到5～10mLN,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护，搅拌10～14h后，停止反应，然后将反应混合物冷却至室温，用二氯甲烷萃取后，有机层用饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为100:1～20:1的CH₂Cl₂/CH₃CH₂OH洗脱剂进行柱层析，得到红色固体产物(产率52％)，即为荧光探针。

本发明的有益效果是，一种pH近红外荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究了该探针的荧光光谱性质，在中性条件下，荧光探针没有近红外(780nm)的荧光发射峰；在酸性条件下，在近红外区(780nm)出现了荧光发射峰，并且随着酸性条件的增强，探针分子的近红外荧光强度不断增加。因此该探针可以检测酸性条件下的pH。其次，研究了探针的紫外吸收光谱，在中性条件下，探针在560nm处有吸收带；随着酸性条件的增强，560nm处的吸收峰逐渐降低，在760nm附近出现新的吸收峰。接着，研究了探针的选择性，分别考察了探针与无机离子(K⁺,Ca²⁺,Na⁺,Mg²⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Cr³⁺,Hg²⁺,HCO₃ ^-,F^-,Br^-,Ac^-,SO₄ ^2-,NO₃ ^-.)在pH＝5.0和pH＝7.4环境下的荧光响应情况。结果发现，只有pH能引起荧光光谱的改变，其他无机离子对探针的荧光光谱没有明显的影响。此外，该荧光探针对pH的响应非常迅速。

一种pH近红外荧光探针的应用。在正常细胞中加入荧光探针，几乎观察不到荧光，这说明正常细胞中的pH呈中性。在癌细胞中加入荧光探针，可以观察到有较强的荧光产生，这说明癌细胞中的pH较低。这些结果说明荧光探针能区别正常细胞与癌细胞，这为早期检测癌症提供了一种可靠的手段。

附图说明

图1为荧光探针的合成路线。

图2为荧光探针在不同pH缓冲液下的紫外可见吸收光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为吸光度。荧光探针的浓度均为5μM，SDS浓度为5mM，pH分别为：5.0,5.5,5.9,6.2,6.5,6.8,7.4。

图3为荧光探针在不同pH缓冲液下的荧光光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度均为5μM，SDS浓度为5mM，pH分别为：5.0,5.5,5.9,6.2,6.5,6.8,7.4。荧光激发波长为720nm。

图4为荧光探针在不同pH缓冲液下的荧光线性响应图。

荧光探针的浓度均为5μM，SDS浓度为5mM。荧光激发波长为720nm。

图5为荧光探针的选择性图。

荧光探针的浓度均为5μM，SDS浓度为5mM，其它分析物浓度均为100μM，分别为：1.Blank,2.K⁺,3.Ca²⁺,4.Na⁺,5.Mg²⁺,6.Fe²⁺,7.Fe³⁺,8.Cr³⁺,9.Hg²⁺,10.HCO₃ ^-,11.F^-,12.Br^-,13.Ac^-,14.SO₄ ^2-,15.NO₃ ^-.

图6为荧光探针在不同pH缓冲液下荧光强度随时间变化的关系曲线图。

图7为人结肠癌细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。

图8为人结肠粘膜细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。

图9荧光探针在正常细胞与癌细胞中的细胞成像图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。

实施例1：

荧光探针的合成

合成路线如图1。在100mL的圆底烧瓶中，将1当量的花菁CyCl和2当量的乙酸钠溶解到8ml N,N-二甲基甲酰胺中，氮气保护，搅拌12h后，停止反应，然后将反应混合物冷却至室温，用二氯甲烷萃取后，有机层用饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机层，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比为100:1～20:1的CH₂Cl₂/CH₃CH₂OH洗脱剂进行柱层析，得到红色固体产物(产率52％)，即为荧光探针。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,ppm):δ8.33(d,J＝12.8Hz,2H),8.04(d,J＝8.8Hz,2H),7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.76(d,J＝8.4Hz,2H),7.47(t,J＝7.6Hz,2H),7.25-7.28(m,2H),7.07(d,J＝8.4Hz,2H),5.51(d,J＝13.2Hz,2H),3.82-3.85(m,4H),2.63-2.66(m,4H),2.00(s,12H),1.93-1.87(m,2H),1.33(t,J＝6.8Hz,6H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,ppm):δ186.28,163.9,141.1,132.9,130.0,130.0,129.5,129.1,126.8,126.3,122.5,121.9,109.0,91.9,48.6,37.2,29.7,28.0,25.9,22.8,11.5.MS(TOF):591.4.

实施例2：

荧光探针，SDS溶液和不同pH溶液配制

探针溶液的制备：称取一定量探针溶解在二甲基亚砜中，配成4×10^-4M的探针溶液。SDS溶液的配制：称取一定量十二烷基硫酸钠溶解在纯水中，配成4×10^-1M的SDS溶液。不同pH缓冲溶液的配制：称取一定量的NaCl,KCl,Na₂HPO₄和NaH₂PO₄溶解在纯水中，通过pH计测定，来配制不同pH缓冲溶液。

实施例3：

荧光探针在不同pH缓冲液中的紫外可见吸收光谱的测定

图2为荧光探针在不同pH缓冲液中紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为5μM，SDS溶液的浓度为5mM，pH的大小依次为5.0,5.5,5.9,6.2,6.5,6.8,7.4。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。从图2中可以看出，随着pH的降低，探针在560nm处的吸收峰逐渐降低，在760nm处的吸收峰逐渐增高。

实施例4：

荧光探针在不同pH缓冲液中的荧光光谱的测定

图3为荧光探针在不同pH缓冲液中的荧光光谱，荧光探针的浓度为5μM，SDS溶液的浓度为5mM，pH的大小依次为5.0,5.5,5.9,6.2,6.5,6.8,7.4。激发波长固定为720nm，发射波长范围为750～840nm。狭缝宽度为5.0nm/5.0nm，所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图3可以看出，随着pH降低，在近红外区(780nm)逐渐出现了荧光发射峰，并且其荧光强度不断增加。这是因为拉-推π-共轭体系在这种花菁染料中形成。因此该探针可以检测酸性条件下pH。图4为探针在不同pH缓冲液下的线性响应图，可以发现荧光强度和不同的pH呈线性关系。

实施例5：

荧光探针对pH测定的选择性

图5为荧光探针对pH测定的选择性图。考察在浓度为5μM的荧光探针溶液中加入SDS(5mM)及其100μM无机离子(K⁺,Ca²⁺,Na⁺,Mg²⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Cr³⁺,Hg²⁺,HCO₃ ^-,F^-,Br^-,Ac^-,SO₄ ^2-,NO₃ ^-.)在pH＝5.0和pH＝7.4环境下的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有pH能引起荧光光谱的改变，其他无机离子对探针的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对pH有较好的选择性。

实施例6：

荧光探针与pH作用的响应时间的测定

我们研究了荧光探针对pH的响应时间，其结果如图6。从图中可以看出，该探针对pH的响应时间非常短，这能够满足在实际样品中进行实时监测的要求。从图6我们还可以看出，荧光强度达到最大值后，在之后的时间里，荧光强度不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。

实施例7：

荧光探针在活细胞中的应用

首先，我们做了细胞毒性试验，如图7和图8所示。当加入0～50μM探针，人结肠癌细胞和人结肠粘膜细胞的细胞成活率均在90％以上。这可以说明，该荧光探针毒性较小。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择人结肠癌细胞HCT116和人正常结直肠粘膜细胞FHC进行共聚焦显微成像，结果如图9所示。分别在两种细胞中加入荧光探针，可以发现，在正常细胞中几乎观察不到荧光，而在癌细胞中可以观察到有较强的荧光产生，这说明癌细胞中的pH较正常细胞中的pH低。这些结果说明荧光探针能区别正常细胞与癌细胞，这为早期检测癌症提供了一种可靠的手段。