苯并吲哚类化合物与制备方法及其检测半胱氨酸中的应用
阅读说明：本技术 苯并吲哚类化合物与制备方法及其检测半胱氨酸中的应用 (Benzoindole compound, preparation method and application thereof in detection of cysteine ) 是由 唐波 王慧 张晓婷 董明燕 王洪统 于 2020-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了苯并吲哚类化合物与制备方法及其检测半胱氨酸中的应用,其化学结构如下式所示：该化合物可以作为检测线粒体内半胱氨酸的荧光探针,具有线粒体靶向能力,且能够实现双光子荧光成像灵敏检测线粒体内半胱氨酸变化。(The invention discloses a benzindole compound, a preparation method and application thereof in detecting cysteine, wherein the chemical structure of the benzindole compound is shown as the following formula: the compound can be used as a fluorescent probe for detecting cysteine in mitochondria, has the mitochondria targeting capability and can realize sensitive detection of cysteine change in mitochondria by two-photon fluorescence imaging.)
技术领域
本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及苯并吲哚类化合物与制备方法及其检测半胱氨酸中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
线粒体是细胞内常见的一种细胞器，是真核生物进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪和氨基酸最终氧化释放能量的场所。线粒体负责的最终氧化的共同途径是三羧酸循环与氧化磷酸化，分别对应有氧呼吸的第二、三阶段。线粒体是细胞中对各种氧化损伤最为敏感的细胞器，当细胞受到损伤时，线粒体的大小、数量以及结构都会发生变化。
半胱氨酸能够参与多种生物过程，例如细胞生长等。线粒体中的半胱氨酸对线粒体氧化应激较为敏感，需要对线粒体中的半胱氨酸进行实时监测。
发明内容
本发明的目的是提供苯并吲哚类化合物与制备方法及其检测半胱氨酸中的应用，该化合物作为荧光探针可以检测较低剂量的半胱氨酸，具有灵敏度高、选择性好以及合成简便的优点。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种苯并吲哚类化合物，其化学结构如下式所示：
另一方面，一种上述苯并吲哚类化合物的制备方法，1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和碘乙烷进行季胺化反应生成化合物1，对羟基苯甲醛和化合物1的2位甲基进行甲基和醛基的缩合反应生成化合物2，丙烯酰氯和化合物2发生醇解反应获得。
第三方面，一种上述苯并吲哚类化合物在检测半胱氨酸中的应用。
第四方面，一种上述苯并吲哚类化合物在制备检测线粒体半胱氨酸的双光子荧光探针中的应用。
第五方面，一种半胱氨酸在线粒体中的检测方法，将细胞置于含有上述苯并吲哚类化合物的溶液中进行孵育，将孵育后的细胞进行紫外吸收检测、荧光检测或共聚焦成像检测。
本发明的有益效果为：
1.本发明提供了一种苯并吲哚类化合物，能够作为线粒体靶向检测半胱氨酸的荧光探针，具有灵敏的检测半胱氨酸的效果。
2.本发明提供的苯并吲哚类化合物的发射光位于橙光区，对组织产生的光毒性小，适用于活体成像等诸多优势。
3.本发明提供的苯并吲哚类化合物生物相容性好，对细胞和活体损伤小。
4.本发明提供的苯并吲哚类化合物的合成路线简便，且原料均为廉价易得的，能够应用于市场化的生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1制备的纳米荧光探针In-CYS与半胱氨酸反应前后的吸收和荧光光谱图，其中，横坐标为波长(nm)，左侧纵坐标为紫外吸收强度，右侧纵坐标为探针In-CYS在520nm的激发下发出的荧光强度；
图2为本发明实施例1制备的纳米荧光探针In-CYS与不同浓度半胱氨酸响应的曲线图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度，随着浓度的增加，探针的荧光强度也逐渐增加；
图3为本发明实施例1制备的纳米荧光探针In-CYS随半胱氨酸浓度增加的线性关系图，横坐标是半胱氨酸浓度，纵坐标是纳米荧光探针的荧光强度，随着半胱氨酸浓度增加，探针的荧光强度成线性增加的趋势；
图4为本发明实施例1制备的纳米荧光探针In-CYS与细胞内其他相关成分的响应情况，从图中可以看出，In-CYS仅在与半胱氨酸孵育后荧光强度有明显的增加，为原来的17倍，而对其他分析物几乎没有响应，这表明In-CYS对半胱氨酸具有良好的选择性。
图5为本发明实施例1制备的纳米荧光探针In-CYS在HL-7702细胞(正常人肝细胞)中与线粒体细胞器的商业化染料共染后的细胞荧光成像图；
图6为本发明实施例1制备的纳米荧光探针In-CYS在HL-7702细胞(正常人肝细胞)中用双光子共聚焦荧光显微镜照射下的细胞荧光成像图；
图7为本发明实施例1制备的纳米荧光探针In-CYS在关节炎炎症小鼠体内的活体成像图，小鼠右腿是λ-卡拉胶注射的关节炎模型，左腿是生理盐水注射的对照组，左腿荧光强度明显高于右腿。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的目的是提供苯并吲哚类化合物与制备方法及其检测半胱氨酸中的应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种苯并吲哚类化合物，其化学结构如下式所示：
本发明的另一种实施方式，提供了一种上述苯并吲哚类化合物的制备方法，1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和碘乙烷进行季胺化反应生成化合物1，对羟基苯甲醛和化合物1的2位甲基进行甲基和醛基的缩合反应生成化合物2，丙烯酰氯和化合物2发生醇解反应获得。
1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚的化学结构式为
碘乙烷的结构式为
对羟基苯甲醛的结构式为
丙烯酰氯的结构为
其合成路线如下所示：
在一些实施例中，季胺化反应的温度为80～130℃，当温度在80～100℃的时候，效果更好。
在一些实施例中，季胺化反应的时间为18～48h，当反应时间在48h的时候，效果更好。
在一些实施例中，季胺化反应的溶剂为乙腈和甲苯。其中，乙腈的毒性更低。在该反应中，1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚与乙腈的加入比例为1～2：20，mol：L。
在一些实施例中，缩合反应中的催化剂为哌啶与乙酸的混合物。其中，哌啶与乙酸的摩尔比为1:0.9～1.1时，反应效果更好。
在一些实施例中，化合物2和丙烯酰氯在碱性条件及惰性气氛下进行醇解反应。用三乙胺提供碱性环境时，反应效果更好。
该系列实施例中，化合物2与三乙胺加入至溶剂中，然后滴加丙烯酰氯，在-35～-25℃条件下混合均匀，然后升温至室温反应。本发明中所述室温是指室内环境的温度，一般为15～30℃。
该系列实施例中，丙烯酰氯的滴加时间为10～30min。该时间内滴加完毕后反应效果更好。
本发明的第三种实施方式，提供了一种上述苯并吲哚类化合物在检测半胱氨酸中的应用。本发明优选的，该应用以非疾病的诊断与治疗为目的。
本发明的第四种实施方式，提供了一种上述苯并吲哚类化合物在制备检测线粒体半胱氨酸的双光子荧光探针中的应用。
本发明的第五种实施方式，提供了一种半胱氨酸在线粒体中的检测方法，将细胞置于含有上述苯并吲哚类化合物的溶液中进行孵育，将孵育后的细胞进行紫外吸收检测、荧光检测或共聚焦成像检测。本发明优选的，所述半胱氨酸在线粒体中的检测方法以非疾病的诊断与治疗为目的。
本发明提供的苯并吲哚类化合物遇到半胱氨酸时，该化合物中的丙烯酸酯和半胱氨酸加成环化并脱去环成为羟基。羟基破坏了探针本身的PET效应，使得反应后的探针在575nm处发射增加，由于探针本身带有正电荷，线粒体内膜带有负电，故可以靶向到线粒体。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1：
荧光探针的合成：
称取1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚(0.5g，2.39mmol)将其溶解在40mL的乙腈中，搅拌使其溶解，在氮气的保护下，向其中加入碘乙烷(250μL，3.63mmol)，在80℃的环境下搅拌回流48小时。反应完成后旋干大部分溶剂，在乙醚中析出，抽滤后烘干得到银灰色固体，为化合物1，直接用于下一步反应。
在氮气的保护下，将化合物1(0.0476g，0.2mmol)和对羟基苯甲醛(0.0293g，0.24mmol)加入到50mL的两口瓶中，再向里加入10mL的无水乙醇使其溶解，后向其中加入0.01mL的哌啶和0.01mL的乙酸，在80℃的环境下搅拌回流6小时。将其冷却后减压蒸馏除去大部分溶剂，用硅胶柱层析的方法进行提纯，展开剂的比例为二氯甲烷：甲醇＝30：1，得到玫红色的化合物2用于下一步反应。
在氮气的保护下，将化合物2(0.0926g，0.27mmol)、三乙胺(0.0546g，0.54mmol)和5mL四氢呋喃加到25mL的两口瓶中，将丙烯酰氯(40.6μL，0.5mmol)滴加到反应瓶中，在-30℃的环境下搅拌3小时，后将其移到室温中再搅拌3小时。反应完成后，用减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析的方法进行提纯，展开剂的比例为二氯甲烷：甲醇＝30：1，得到金黄色固体，记为In-CYS。(1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝8.35(t,3H),8.22(d,J＝8.57,1H),8.14(d,J＝8.94,1H),8.07(d,J＝7.56,1H),7.89(d,J＝15.50,1H),7.82-7.84(m,2H),7.68(t,1H),7.35(d,J＝7.56,2H),6.63(d,J＝17.51,1H),6.32(q,1H),6.07(d,J＝10.84,1H),5.18(q,2H),2.12(s,6H),1.68(q,1H).13C NMR(101MHz,CdCl3)δ＝182.18,163.79,154.88,152.50,133.54,131.97,130.41,127.74,127.35,122.80,112.45,112.32,77.37,77.05,76.73,54.20,44.91,29.71,26.82,14.96.HRMS(ESI)m/z:[M]+calculated for C27H26NO2+,396.1964found 396.1904)。
In-CYS的效果实验：
通常，可以将染料分子溶解在生理盐水、PBS缓冲液或Hepes缓冲液等水溶性有机溶剂中，然后加入适当缓冲液行测试。该实例分别探究了在不同浓度的半胱氨酸的PBS缓冲溶液(1％DMSO，pH 7.4)中，探针In-CYS随半胱氨酸浓度变化的吸收和荧光光谱响应，并将其用于活细胞及炎症小鼠成像实验。活细胞的染色方法是将培养好的细胞放于含有探针分子的培养液中孵育，孵育一定的时间后除去孵育液，进行共聚焦成像实验。小鼠的染色方法是将探针原位注射到小鼠的正常部位和炎症部位，一段时间后，对小鼠注射探针的部位进行活体荧光成像。
探针In-CYS在不同浓度半胱氨酸的PBS溶液中紫外吸收、荧光发射及选可逆性实验：
探究探针In-CYS在不同浓度半胱氨酸的PBS溶液(20μM)中的紫外吸收和荧光响应性质。随着半胱氨酸的浓度增大(2～100μM)，探针In-CYS(20μM)的吸收光谱呈现出高灵敏度的改变。如图1所示，随着半胱氨酸浓度的增大，探针的最大吸收红移至520nm左右。图2探针In-CYS(20μM)在不同浓度半胱氨酸下的荧光光谱响应。在520nm的光激发下，随着半胱氨酸浓度的不断增加，探针于575nm处荧光强度逐渐增强，说明探针对半胱氨酸具有高灵敏度的荧光相应。
图3为不同浓度的半胱氨酸0～10μM加入20μM的In-CYS探针，在37℃下孵育10分钟后，在520nm激发下收集575nm处的荧光相应线型图。结果表明，半胱氨酸浓度在0～10μM中，In-CYS始终展现出灵敏的荧光响应，其R2值为0.9945。
图4为In-CYS对细胞内其他相关成分的响应情况，检测In-CYS(20μM)对25种不同分析物的荧光响应，分析物包括：甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、天门冬氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸、过氧化氢、ClO-、Cu2+、Fe2+、Ca2+、Na+、K+、Zn2+、同型半胱氨酸、谷胱甘肽和半胱氨酸。
In-CYS的检测限实验：
探针In-CYS的检测限计算公式为：LOD＝3S0/K。其中，LOD为检测限，S0为探针In-CYS多次(大于13次)测得荧光强度的标准偏差，K为探针In-CYS的荧光强度与半胱氨酸浓度的线性关系的斜率。计算得S0为3.65，K为121.75，经计算，探针CCYS的检测限为0.09μM。
In-CYS的线粒体靶向性实验：
人正常肝细胞HL-7702是由含有双抗和胎牛血清蛋白的DMEM培养液培养。之后用50μM的探针分别和定位不同亚细胞器的商业化染料(线粒体、溶酶体)共孵育细胞15min后，使用激光共聚焦显微镜进行共定位成像实验。共定位细胞成像实验如图5示，图5探针In-CYS只与线粒体商业化定位染料的荧光有较好的重叠。
In-CYS的双光子荧光成像实验：
人正常肝细胞HL-7702是由含有双抗和胎牛血清蛋白的DMEM培养液培养。之后用50μM的探针和细胞共孵育细胞15min后，使用双光子共聚焦荧光显微镜进行定位成像实验。定位细胞成像实验如图6，图6针In-CYS在800nm的激发下，能够很好的显示与线粒体的定位效果。
探针对在炎症小鼠模型中正常部位和炎症部位的原位活体成像实验：
在小鼠的左侧腿部关节部位注射生理盐水作为控制组，右侧相同位置注射λ-卡拉胶(5mg/mL，100μL)去诱导关节炎炎症的产生。48小时之后，将小鼠用水合氯醛进行麻醉后进行实验。在注射λ-卡拉胶(右侧)及生理盐水(左侧)的部位注射探针In-CYS(50μM，50μL)，在520nm的激光下进行活体荧光成像检测，如图7所示。结果发现，520nm激光下，在570nm窗口中，小鼠λ-卡拉胶刺激一侧的荧光强度略高于注射生理盐水的一侧，表明探针In-CYS可以用于检测关节炎处半胱氨酸的含量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。