具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中的附图：图中不同种类的剖面线不是按照国标进行标注的，也不对元件的材料进行要求，是对图中元件的剖视图进行区分。

请参阅图1-8，高产果胶酶酶活菌株的诱变方法及其固态发酵条件的优化，采用甲基磺酸乙酯(EMS)化学诱变法来突变菌株，其特征在于：该诱变方法包括以下步骤：

步骤一、将一定量的孢子悬液与EMS混合振荡反应一段时间后，NaS₂O₃终止反应，取一定量处理液稀释涂布到平板中进行培养；

步骤二、共挑选出23株致死率在70-90％的菌株进行复筛培养，得到1株高产果胶酶酶活菌株Penicilliumsp.Y-21。

步骤一中所述的EMS浓度为1-5％，反应时间为0-60min，终止反应所添加的NaS2O3体积量与EMS的添加量相同。

步骤二中需要对致死率在70-90％的菌株进行复筛。

高产果胶酶酶活菌株的固态发酵条件的优化，通过单因素试验和正交试验优化，获得最优产酶体系，优化过程使用固体发酵培养基，所述固体发酵培养基以20g豆粕和15g麸皮为固体基质，初始含水量50％，葡萄糖含量2％，CaCl₂0.04％，FeCl₃0.04％，接种量4％，培养温度38℃，培养时间5天。

需要说明的是，本发明中测定果胶酶酶活能力的方法采用的是指示剂滴定法，具体方法见中华人民共和国国家标准法发布的GB/T23535-2009。

实施例1

青霉菌(Penicillium sp.)Y-21的诱变

(1)青霉菌(Penicillium sp.)Y-21的初筛

将从常州大学菌种保藏室中取出的青霉菌(Penicillium sp.)放入种子培养基中培养2天后，取10mL种子液加入到离心管中，3,000rpm离心5min，弃上清后加入生理盐水冲洗2次，3,000rpm再次离心5min，弃上清，加入10mL磷酸缓冲液制成孢子悬液。将孢子悬液与甲基磺酸乙酯(EMS)混匀制成1-5％的母液振荡反应0-60min，对照加入与EMS相同体积量的生理盐水，诱变结束后再次加入与EMS相同体积量的2％Na₂S₂O₃静置10min，3,000rpm离心5min后留1mL处理液。再用无菌生理盐水将菌液稀释到10^-2倍，取100μL菌液涂布到固体平板培养基上，待培养基上长出单菌落后进行复筛。

种子培养基的组成如下：K₂HPO₄ 1g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，MgSO₄ 0.1g/L，琼脂粉20g/L。磷酸盐缓冲液(pH 7.5)的组成如下：KH₂PO₄ 3.92g/L，Na₂HPO₄·12H₂O79.24g/L。

(2)青霉菌(Penicillium sp.)Y-21的复筛

从致死率在70-90％的平板中共挑选出形状、大小、色度不一的23株诱变菌(见表1)进行固体发酵培养，培养温度28℃，培养时间3d。发酵结束后根据国标方法测定这23株菌所产果胶酶酶活，从中挑选出酶活最高的一株菌(#21)进行后续的优化。

发酵培养基的组成如下：豆粕20g，初始含水量70％，葡萄糖4％，蛋白胨1％，MgSO₄0.02％，CaCl₂ 0.02％。

表1甲基磺酸乙酯(EMS)诱变复筛表

本实施例说明，通过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变后筛选出一株产酶活最高菌株(#21)，酶活可达19000U/g，相比原始菌株的酶活提高了37.7％。

实施例2

通过选取Penicillium sp.Y-21生长的最优固体基质，我们采用米糠、豆饼粉、麸皮、豆粕、棉籽饼粉、菜籽饼粉发酵菌株，每组试验做3次对照，具体试验操作如下：

在超净工作台中，用接种环从平板中挑取少许菌接入已灭好菌的种子培养基中，培养至对数生长期后按2％的接种量接入到上述提到的以米糠、豆饼粉、麸皮、豆粕、棉籽饼粉、菜籽饼粉为固体基质的发酵培养基中，在38℃恒温培养箱中培养3天，取样测定菌株所产酶活，结果如图1所示。

本实施例说明，以豆粕为发酵底物，在发酵第3天时，菌株所产果胶酶酶活最高，达到13200U/g；以麸皮、米糠为发酵底物时，菌株所产酶活微乎其微。因此我们最终选择以豆粕为菌株发酵底物来进行后续培养基组分的优化。

实施例3

通过确定Penicillium sp.Y-21菌株在发酵过程中的最适接种量，我们选取2％、4％、6％、8％、10％的接种量接入到发酵培养基中，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例2，结果如图2所示。

本实施例说明，以豆粕为发酵底物，按4％的种子接种量接入到发酵培养基中培养至第3天时，菌株所产果胶酶酶活最高，达到22400U/g。因此我们最终选择4％为适合菌株产酶的最佳接种量。

实施例4

通过确定Penicillium sp.Y-21菌株在发酵过程中的最佳初始含水量，我们选取60％、65％、70％、75％的初始含水量添加到发酵培养基中，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例2，结果如图3所示。

本实施例说明，以豆粕为发酵底物，按4％的接种量接入到初始含水量为70％的发酵培养基中培养至第3天时，菌株所产果胶酶酶活最高，达到22600U/g。

实施例5

通过确定Penicillium sp.Y-21菌株在发酵过程中所需的最适碳源及其浓度，我们选取了葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖为发酵碳源，并且选择1％、2％、4％、6％、8％的碳源浓度添加到发酵培养基中，每组试验做3次对照，具体试验操作如下：

发酵培养基配制过程中选取葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖为单一碳源并保证其他变量不变，培养基制备完成后115℃灭菌30min。在超净工作台中，用灭好菌的枪头吸取2mL种子液接入到发酵培养基中，再用无菌玻璃棒将培养基搅拌均匀放入38℃恒温培养箱中培养3天后，取样测酶活。从中挑选出适合菌株产酶的最佳碳源，进而优化其碳源浓度，结果如图4,5所示。

本实施例说明，适合菌株产酶的最适碳源为葡萄糖，以葡萄糖为碳源发酵果胶酶酶活可达22500U/g，进而优化葡萄糖浓度为4％时，菌株所产酶活最高，达到23500U/g。

实施例6

通过确定Penicillium sp.Y-21菌株在发酵过程中所需的最适氮源及其浓度，在保证培养基中其他组分不变的情况下，我们选取了牛肉膏、蛋白胨、NH₄Cl、KNO₃为发酵氮源，并且选择1％、2％、4％、6％、8％的氮源浓度添加到发酵培养基中，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例4，结果如图6,7所示。

本实施例说明，适合菌株产酶的最佳氮源为蛋白胨，以蛋白胨为氮源发酵菌株果胶酶酶活可达23550U/g，进而优化蛋白胨浓度为1％时，菌株所产酶活最高，达到23500U/g。

实施例7

通过确定Penicillium sp.Y-21菌株在发酵过程中所需的最适金属离子及其浓度，在保证培养基中其他组分不变的情况下，我们选取了一定量的MgSO₄、CaCl₂、FeCl₃、K₂HPO₄、BaCl₂添加到发酵培养基中，而后选择0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％的金属离子浓度再次添加到发酵培养基中，确定适合菌株产酶的最适金属离子浓度，每组试验做3次对照，具体试验操作见实施例4，结果如图8所示。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。