一种混合菌株发酵制备茶渣饲料的方法
阅读说明：本技术 一种混合菌株发酵制备茶渣饲料的方法 (Method for preparing tea residue feed by fermenting mixed strains ) 是由 黄炜乾 蒋顺进 张文 周绍迁 林万华 张泳 林昊 于 2020-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明涉及动物饲料技术领域,具体涉及一种混合菌株发酵制备茶渣饲料的方法。所述的方法包括如下步骤：S1.ARTP诱变及驯化筛选功能性微生物；S2.突变菌株的混合发酵。本发明以开发地源性的绿茶茶渣制备功能性的菌茶生物饲料为目的,采用ARTP诱变及驯化筛选的方法进行功能性微生物的选育,并建立“一罐多菌”混合培养工艺,同时配以合适的辅料组合,促进混合功能微生物的繁殖,结合外源酶的协同,消化茶渣中的大分子,释放茶中的活性成分,进一步挖掘原料利用空间,充分强化固体发酵中的群落优势,提供高含量的益生菌及其功能性活性物质,有效的实现茶渣资源化利用,维护动物肠道健康,为健康养殖带来益处。(The invention relates to the technical field of animal feed, in particular to a method for preparing tea residue feed by fermenting mixed strains. The method comprises the following steps: s1, performing ARTP mutagenesis, domestication and screening on functional microorganisms; s2, mixed fermentation of mutant strains. The invention aims to develop the ground-source green tea residues to prepare the functional bacterial tea biological feed, adopts the ARTP mutagenesis and domestication screening method to breed the functional microorganisms, establishes a one-pot multi-bacteria mixed culture process, is matched with a proper auxiliary material combination to promote the propagation of the mixed functional microorganisms, combines the cooperation of exogenous enzyme to digest macromolecules in the tea residues, releases active ingredients in the tea, further excavates the raw material utilization space, fully strengthens the community advantage in solid fermentation, provides high-content probiotics and functional active substances thereof, effectively realizes the resource utilization of the tea residues, maintains the intestinal health of animals, and brings benefits for the healthy culture.)
技术领域
本发明涉及动物饲料技术领域，具体涉及一种混合菌株发酵制备茶渣饲料的方法。
背景技术
我国是产茶大国，2018年干毛茶叶产量超过260万吨，其中绿茶类占比超过65％，是 全球绿茶的主要生产国，总产量超过全球绿茶总产量的75％。绿茶作为传统饮料，其可食部 分仅占茶叶的一小部分，目前伴随着茶叶产业链的延伸，更多的干茶叶进入茶叶深加工企业， 通过高温水提制备速溶茶粉及茶浓缩液，而目前的茶叶深加工后的干物质总量也仅为茶叶干 重的3％左右，有效成分含量也仅提取不到40％。茶叶加工后产生茶叶原料量近三倍的湿茶 渣，其中含有超过60％的茶营养成分，包含有大量的蛋白、脂肪、纤维以及茶多酚等。研究 表明，绿茶渣中含有17-19％的粗蛋白，16-18％的粗纤维，1-2％的茶多酚，0.1-0.3％的咖啡 碱，不仅如此，其蛋白氨基酸组成丰富，氨基酸比值系数分达到57.51-68.01，较常规饲用玉 米及麸皮要好，与鱼粉接近，兼具营养与功能，具有非常高的利用与开发价值。目前，茶渣 利用仍以低值化的燃料、肥料、饲料或吸附材料为主，也包括一些茶渣蛋白的提取研究，但 其不论是规模化还是工业化应用都非常有限，如何实现茶渣的资源化越来越受到关注，急需 拓展高效、价值化的综合方案。
随着开发技术的不断推进，有研究者利用微生物发酵的方式对茶渣饲料进行运用，开发 生物饲料。有研究表明，茶渣经过不同的微生物发酵后其营养成分会有所增加。如刘姝等 (2001年)以茶渣为原料，利用木霉、曲霉以及有益微生物发酵进行发酵，发现粗蛋白质 和可溶性物质的含量显著增加，并且其营养含量已经完全满足仔猪配合日粮的需求。目前已 报道用于茶渣发酵的微生物有黑曲霉、青霉属、酵母属、根霉属、灰绿曲霉、细菌类等。将 茶渣开发成饲料的研究刚刚起步，尚存在一些问题，除了基质原料本身的营养性之外，另外 一个很重要的方面就是微生物的种类和功能性。发酵菌株的选择首先应在《饲料添加剂品种 目录》当中，但作为发酵饲料用的菌种，其核心目的还在于针对不同原料的预处理，以及在 饲料“熟化”过程中的代谢产物，所以不同的基质原料和不同的目标选择的菌种是不一样。 如何利用微生物发酵的方法来处理茶渣，使得茶渣中氨基酸含量提高，纤维素含量减少，更 适于家禽的饲喂，这是目前研究需要攻克的一个方面。因此，需要根据茶渣的营养特性，筛 选更多能够利用茶渣作为碳氮源生长的菌株，开发茶渣固态发酵工艺。
常压室温等离子体(Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP)被称为除气体、液 体、固体以外物质的第四态，通过改变激发方式和发生器结构可以产生不同热力学状态的等 离子体。等离子体具有臭氧浓度及紫外辐射强度均极低，安全性高、环境友好、诱变快速等 特点，常压室温等离子体诱变操作简单，条件温和，菌株突变率高、突变点位和跨度广泛。 ARTP工作气源种类、流量、放电功率、处理时间等条件均可控，通过改变仪器操作条件， 可以大大提高菌种突变的强度和突变库容量，结合压力筛选和高通量筛选技术，ARTP已经 成为高效进化育种的新方法。ARTP诱变一般以致死率作为筛选诱变条件等的指标，致死率 不宜过高或过低，有研究表明，致死率越接近90％，诱变效果越好，此时的诱变条件越佳。 陈瑞龙等(2018)的文章公开了植物乳杆菌细菌素高产菌株的诱变选育及其对肉丸的防腐保 鲜作用，具体是以植物乳杆菌JL-A65为出发菌株，对其进行ARTP诱变、甲基硝基亚硝基 胍(MNNG)诱变与基因组改组。ARTP诱变参数设置为：载气：高纯氦气(99.99％)；入 射功率：200W；载气流速：10SLM；处理温度：25℃；反射功率：40W；载物台与放射源 距离：10.0mm；照射时间分别为15、30、45、60、75、90和105s进行诱变。然后利用琼脂扩散法对诱变处理后菌株进行初筛和复筛，得到细菌素产量提高的突变株。
目前未见采用ARTP诱变及驯化筛选的方法进行功能性微生物的选育，并结合多种菌株 混合、优选辅料组合、菌酶协同发酵的方法进行茶渣发酵饲料研究的相关报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是采用ARTP诱变及驯化筛选功能 性微生物，建立“一罐多菌”混合培养工艺，同时配以合适的辅料组合和外源菌酶，用于茶 渣发酵及茶渣资源的高值化利用，开发以茶营养为主要成分的“菌茶”生物饲料。
为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
一种混合菌株发酵制备茶渣饲料的方法，包括如下步骤：
S1.ARTP诱变及驯化筛选功能性微生物：采用ARTP诱变短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，得到的突变菌株接种至驯化培养基中， 通过逐级提高驯化培养基中的茶渣含量，筛选获得耐受高浓度茶渣的突变菌株；
S2.突变菌株的混合发酵：将步骤S1得到的耐受高浓度茶渣的突变菌株混匀，得到菌落 总数为0.5×106-1.5×106cfu/g的混合菌液；将混合菌液与发酵基质按重量比为4-6：94-96混 匀，得到混合发酵基质；向混合发酵基质中添加纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶， 调整混合发酵基质的含水量为35-45％，于20-30℃条件下发酵7-10d，即得茶渣饲料。
优选地，所述的耐受高浓度茶渣的突变菌株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP-09 和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP-08；
所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP-09于2020年6月16日保藏于广东省微生物 菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：61062；
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP-08于2020年6月16日保藏于广东省微 生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：61061。
优选地，步骤S1中所述的ARTP诱变的条件为：电源功率60W，照射距离3mm，等离 子体的温度26℃，气流量10L/min，短小芽孢杆菌的ARTP处理时间为120s，植物乳杆菌的 ARTP处理时间为60s。
优选地，步骤S1中所述的高浓度茶渣是指驯化培养基中含有20％茶渣浸提液。
优选地，所述的混合菌液中短小芽孢杆菌BP-09与植物乳杆菌LP-08的比例为1：1.5。
更优选地，所述的混合菌液中菌落总数为1×106cfu/g。
优选地，所述的混合菌液与发酵基质的重量比为5：95。
优选地，所述的发酵基质包括茶渣、脱脂米糠和豆粕粉，三者质量比为7：2：1。
优选地，所述的混合发酵基质中纤维素酶终浓度为300μ/g，半纤维素酶终浓度为300μ/g， 木聚糖酶终浓度为200μ/g，果胶酶终浓度为200μ/g。
优选地，所述的混合发酵基质的含水量为40-45％，发酵温度为25-30℃，发酵时间为8- 9d。
优选地，所述的茶渣为绿茶茶渣。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的方法选择符合国家饲料微生物目录的安全菌株，为短小芽孢杆菌和 植物乳杆菌，这两种菌株组合具有正协同作用。在此基础上，从ARTP诱变和茶渣的驯化定 向选育出发，筛选能够耐受一定浓度茶渣，并能够以茶渣为主要营养源生长的菌株进行混合 菌株发酵。
(2)本发明提供的方法通过评估不同功能突变菌株混合培养的可能性，建立“一罐多 菌”混合培养工艺，既解决单个菌株培养的费时费力费钱的问题，又能大大增加混合菌株的 “共生”特性，同时配以合适的辅料组合，促进混合功能微生物的繁殖，结合外源酶的协同， 消化茶渣中的大分子，释放茶中的活性成分，进一步挖掘原料利用空间，充分强化固体发酵 中的群落优势，提供高含量的益生菌及其功能性活性物质，有效的实现茶渣资源化利用，维 护动物肠道健康，为健康养殖带来益处。
附图说明
图1为ARTP处理时间对不同菌株存活率的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明， 仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条 件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
新鲜绿茶茶渣含水量较高(含水量70.5％)，而且粗纤维的含量也较高(粗纤维含量达 到24.1％，以干重计)，其中尤以纤维类含量最为丰富，其通常是纤维素与半纤维素、果胶 和木质素结合在一起，很难直接被微生物利用。为加速茶渣的生物利用，本发明选用一定量 的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木聚糖酶，尽可能的打开植物细胞壁，再通过配伍合适 的辅料，改善和提高整个固体发酵的微生物营养结构(提高碳氮比、速效氮、无机盐和维生 素等)，为不同功能的微生物高强度的繁殖创造基础，结合菌酶同步发酵的方式对绿茶茶渣 进行高效发酵，从而提高茶渣的生物可利用性。
1、菌种
(1)原始菌
芽孢杆菌类：短小芽孢杆菌BP(Bacillus pumilus,BP)。
乳酸菌类：植物乳杆菌LP(Lactobacillus plantarum,LP)。
(2)检菌
G+菌株为藤黄微球菌ATCC 4698(Micrococcus luteus ATCC 4698)，G-菌株为大肠杆 菌ATCC25922(Escherichia coli ATCC25922)，孔径6.0±0.2mm。
2、试剂
绿茶提取后的茶渣由福建仙洋洋生物科技有限公司提供；
脱脂米糠、麸皮、豆粕粉等由广东容大生物股份有限公司提供；
纤维素酶(200000μ/g)、木聚糖酶(200000μ/g)、果胶酶(30000μ/g)、半纤维素酶(100000μ/g)均购自于枣庄市杰诺生物酶有限公司；
酵母提取粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨等购自于生工生物工程(上海)股份有限公司；
乳酸细菌培养基(MRS)等购自于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；
常压室温等离子体诱变仪(ARTP)购自于无锡源清天木生物科技有限公司；
发酵呼吸袋购自于温州创佳包装材料有限公司；
其它试剂、耗材均购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。
3、培养基
细菌培养基(％)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，氯化钠0.5，NaOH调pH至7.0，若制固 体培养基，加入2.0％琼脂粉，121℃灭菌21min。该培养基主要用于芽孢类细菌的培养。
MRS培养基(％)：蛋白胨1.0，牛肉膏1.0，酵母膏0.5，柠檬酸氢二铵0.2，葡萄糖2.0，吐温80 0.1mL，三水合乙酸钠0.5，三水合磷酸氢二钾0.2，七水合硫酸镁0.058，一水合硫酸锰0.025，NaOH调pH至6.5，若制固体培养基，加入2.0％琼脂粉，121℃灭菌21min。 该培养基主要用于乳酸菌类的培养。
LB培养基(％)：胰蛋白胨1.0，酵母提取物0.5，NaCl 1.0，NaOH调pH至7.0，若制 固体培养基，加入2.0％琼脂粉，121℃灭菌21min。该培养基主要用于检菌的培养。
平板计数培养基(％)：TSA培养基+1.0％葡萄糖，主要用于混合培养菌株及固体发酵 后的菌落平板计数。
驯化培养基(％)：以热水浸提后的绿茶茶渣作为主要碳源，筛选能够在一定浓度茶渣 中繁殖代谢的菌株，具体配方包括(％)：茶渣5.0，硫酸铵0.5，磷酸二氢钾0.15，无水乙 酸钠0.1，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，硫酸亚铁0.005，碳酸钙0.3，NaoH调pH至6.5-7.0，121℃灭菌20min。固体平板需添加2.0％的琼脂粉。
多菌株混合培养基(％)：豆粕粉2.0，玉米淀粉1.5，红糖粉2.0，葡萄糖0.5，酵母膏0.5，蛋白胨0.5，甘蔗糖蜜1.0，乙酸钠0.5，柠檬酸二铵0.2，硫酸胺0.1，磷酸二氢钾0.15，轻质碳酸钙0.3，硫酸镁0.02，硫酸锰0.005，吐温80 0.1，NaOH调pH至6.5-7.0，121℃灭 菌20min，备用。主要用于多菌株的混合培养。
茶渣固体发酵培养基(％)：硫酸胺0.1，硫酸镁0.02，磷酸二氢钾0.15，轻质碳酸钙0.5，甘蔗糖蜜0.6，混合后与茶渣和辅料一起搅拌均匀，每个发酵袋装量10kg。
磷酸盐缓冲液：将3.4g KH2PO4溶解于50mL的蒸馏水中，用1mol/L的NaOH调整PH 值至7.2，最后用加入蒸馏水使体积达到100mL。121℃高压灭菌15分钟，4℃保存备用。
4、检测方法
总酸含量的测定：参照国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法 测定。
粗蛋白含量：参照GB/T 6432-2018《饲料中粗蛋白的测定》凯氏定氮法。
酸溶蛋白含量：参照GB/T 22492-2008《大豆肽粉》中酸溶蛋白质含量的测定。
粗纤维含量：参照GB/T 6434-2006《饲料中粗纤维的含量测定》过滤法。
氨基酸含量：参照GB/T 18246-2000《饲料中氨基酸的测定》。
5、平板菌落计数
称取1.0g固体发酵样品(或1mL发酵液样品)加入到9.0mL的磷酸盐缓冲液中，然后加入2滴吐温80，这样就得到了浓度为10-1的稀释溶液。150rpm震荡摇匀5-10min，然后用 磷酸盐缓冲溶液对震荡液进行梯度稀释，分别得到10-3，10-5和10-7的稀释梯度，将不同梯 度的稀释液分别涂布2个平板计数培养皿，30℃培养72小时，计算总菌落数，并对不同的 菌落类型进行分类计数。
6、抑菌活性分析
采用改良的琼脂扩散法检测代谢产物的抑菌活性。
参考文献：郝湘妹,王宇航,王媛,等.几种检测乳酸菌抑制真菌性能的方法比较[J].食品 研究与开发,2020(9).
实施例1菌株的ARTP诱变
1、菌株活化
取不同菌株(短小芽孢杆菌、植物乳杆菌)的甘油菌接种于相应的斜面培养基，30℃培 养24h，培养结束后，从中取一环菌株划线至新鲜的斜面培养基中，30℃培养16h，进一步 强化菌株活力，复壮菌株，达到菌株活化的目的。
2、菌株ARTP诱变参数的确定
活化培养好的斜面中加入无菌生理盐水，洗脱，制备菌悬液，控制菌悬液OD600nm值在 0.5-0.7之间。取10μL的菌悬液，均匀涂布在金属载片的表面，干燥后用灭菌镊子将装有样 品载片的平板转移至ARTP操作仓。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体处理菌物载片， 设置电源功率60W，照射距离3mm，等离子体的温度26℃，气流量10L/min，设置不同的处理组，各组的处理时间分别为0(对照)、30、60、90、120、150、180s，每组设置三次 重复。将处理后的载片转移到装有1mL灭菌生理盐水的EP管中，振荡器洗脱60s，把附着 在载片上的微生物洗脱到无菌生理盐水中，形成菌悬液。将菌悬液适当稀释后涂布至相应的 平板，置于30℃培养箱内培养48h后进行计数，计算致死率，致死率计算方法如下所示：
致死率％＝(未经诱变处理菌落数-经诱变处理菌落数)/未经诱变菌落数×100％
通过统计各处理组的致死率，选择致死率约80％的照射处理时间进行正式实验，即保证 一定的突变丰富度，又提供一定的存活率。
结果：不同类型菌株菌悬液经ARTP诱变，以未经ARTP处理的(处理时间0s)的菌株为对照，绘制不同类型菌株的致死率曲线(图1)。由图1可知，不同类型菌株对ARTP的 耐受性有明显差异：(1)就植物乳杆菌而言，ARTP处理30s，致死率仅为36.6％，处理时 间60s时，致死率大幅度增加，达到76.8％，而当处理时间超过90s时，致死率超过95％， 处理时间120s，致死率几乎达到100％。(2)而同样作为原核生物的短小芽孢杆菌对ARTP 就具备更好的耐受性，其同样条件下处理60s，致死率仅为24.6％，处理90s，致死率上升至 50.6％，处理120s，致死率为80.1％，而处理时间达到150s时，细胞存活率还有3.6％，处 理180s，细胞存活率基本为0。
所以，在保证诱变效果的同时又有一定的细胞存活率进行后续筛选，选择致死率约为 80％的条件进行ARTP处理，所以植物乳杆菌的ARTP处理时间确定为60s，短小芽孢杆菌 的处理时间确定为120s。
实施例2突变株的驯化筛选
取ARTP处理后的菌悬液直接接种至驯化培养基中，装液量为250mL三角瓶装液50mL， 30℃，220rpm，培养72h，考察菌株在以茶渣为主要碳源的培养基中的生长与繁殖能力。并 通过逐级的提高驯化培养基中的茶渣含量，结合平板分离，获得菌株生长力强，可以耐受和 利用高浓度茶渣的优良菌株，保存，备用。具体如下：
(1)低浓度茶渣对突变株的驯化
将ARTP处理后的菌悬液直接转接至驯化培养基进行培养，以未处理的菌株为对照，观 察发酵液的颜色及气味变化，并对发酵液菌落进行计数。
结果显示：不同类型突变菌株在含有以5.0％茶渣为唯一碳源的培养基中都能够不同程 度的进行繁殖，并且能够正常一定的代谢活动，而其原始菌株在同样的培养基条件下均不能 正常生长。从生长情况来说，短小芽孢杆菌突变菌生长最好，植物乳杆菌突变菌次之；从代 谢产物活性来说，短小芽孢杆菌体现了一定的对G+(藤黄微球菌)的抑菌活性，而植物乳 杆菌则同时具有G+与G-(大肠杆菌)的抑菌活性，但抑菌圈相对比较模糊，而且边界也不 清晰，这可能与乳酸菌类产生的有机酸有关，低浓度的有机酸的抑菌性能往往都不太彻底 (表1)。
表1 ARTP突变菌在含绿茶茶渣培养基中的驯化培养特性
菌株类型
pH
菌落数(CFU/mL)
G<sup>+</sup>活性(mm)
G<sup>-</sup>活性(mm)
短小芽孢杆菌
7.19±0.05
3.9±0.05×10<sup>7</sup>
11.2±0.1
ND
植物乳杆菌
4.10±0.05
8.9±0.05×10<sup>6</sup>
10.2±0.1
10.3±0.1
注：ND表示未检测到抑菌活性。
(2)高茶渣浓度耐受性突变株的复筛
同时，继续将驯化培养获得的菌液分别涂布至含有10％、15％、20％茶渣浸提液的驯化 培养基平板，挑取能够在高浓度茶渣中生长的菌落进行摇瓶培养。
结果显示：不同类型的菌株都有能够在20％茶渣浸提液中生长的菌落，而其液体发酵的 菌浓与低浓度茶渣驯化培养结果基本一致，说明高浓度的茶渣营养环境对突变株的生长基本 没有抑制，反而不同类型变株合成活性成分的能力还受到明显的刺激，不管是抑菌活性还是 产酸能力都有一定程度的提高(表2)。
整体来说，短小芽孢杆菌对于G+的抑菌活性比较低，最高的为12±0.1mm。而乳酸菌类 突变株均体现了较好的产酸能力，pH最低为4.01(LP-08菌株)，体现了较好的乳酸菌发酵 特性。
表2 突变株对高浓度茶渣的耐受性筛选(部分)
注：ND表示未检测到抑菌活性。
选择生物量最好、代谢产物活性好的菌株短小芽孢杆菌BP-09、植物乳杆菌LP-08进行 摇瓶复筛，采用琼脂扩散法进行活性抑菌活性检测。
结果显示：短小芽孢杆菌BP-09只对G+菌株有明显抑菌效果，能够形成清晰明确的抑 菌圈；而植物乳杆菌LP-08对G+和G-菌株都有一定的抑制效果，但抑菌圈透明度低，这与上述耐受筛选的结果基本一致。
将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)BP-09于2020年6月16日保藏于广东省微生物菌 种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：61062。保藏地址为广州市先烈中路 100号大院59号楼5楼。
将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP-08于2020年6月16日保藏于广东省微生 物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：61061。保藏地址为广州市先烈中 路100号大院59号楼5楼。
实施例3混合突变菌株的液体培养
(1)单一菌株发酵产物的抑菌分析
在进行多菌株混合培养前，有必要考察不同菌株的代谢产物对其它菌株的抑制作用，采 用混合发酵培养基分别将上述筛选获得的菌株进行单独培养，离心收集发酵液上清，根据琼 脂扩散法，检测菌株之间的抑制作用。
结果显示：菌株之间基本没有相互的抑制作用。
(2)多菌株的混合培养分析
在单一菌株与同类型菌株纯培养的基础上，根据不同菌株的生理及代谢特性，设计同一 发酵体系中培养不同类型的菌株，实现“一罐多菌”培养，考察混合培养条件的活菌数及代 谢产物活性。具体步骤如下：
分别在不同菌的活化斜面(18×180mm)中刮一大环接种至相应的茄子瓶斜面，30℃培 养24h，每个茄子瓶加入50mL无菌水洗脱，制备菌悬液，OD600nm控制在0.5-0.6之间，此即斜面种子液。
将洗脱的菌悬液混合后，全量接种至50L混合培养罐，进行菌株的扩大培养，培养罐装 液量30L。培养温度：30℃，罐压0.05-0.08Mpa，初搅拌250rpm，溶氧自然下降直至到0，pH自然下降后流加20％的氨水控制pH5.0左右，通气量15L/min，周期：24h。每隔两小时 取样检测发酵液抑菌活性(G+与G-)和菌落总数。
结果显示：以初始(发酵0h)菌落总数(CFU)约1.0×107/mL进入发酵体系，0-6h菌株处于适应期，此时培养体系中还原糖的浓度没有减少，这并不是说混合菌株没有消耗还原 糖，恰恰相反，混合菌株在适应期通过合成系列的淀粉酶类，通过水解复合糖原保持着体系 中的还原糖浓度，发酵6-8h后菌株进入对数生长期，菌落数急剧增加，发酵泡沫急剧增加， 还原糖的消耗也相应增多，并且随着混合的菌的繁殖，还原糖的量急剧减少，并在约16h还 原糖的量基本检测不到，泡沫的生长也基本停止，培养20h菌落数达到最大，CFU为3.5×1010/mL，说明混合菌能够非常好的适应混合培养体系，并且能够充分利用混合培养成分 进行菌体的繁殖与代谢。
从不同培养时期的菌体情况看，发酵0h时，视野中长杆和短杆菌数量基本一致，基本 没有芽孢的形成，而且菌体染色深，说明混合菌株的活力是可以的；培养12h镜检显示，整 个视野中菌落数明显增加，短杆菌增多，而且开始出现少量芽孢，其中长杆菌由细长***， 而且主要呈“对生”或“八字形”菌株较多，说明混合菌株正处于旺盛的繁殖生长期；培养 结束前取样，菌体数量进一步增加，特别是芽孢数量增加明显，同时视野中偶见个别短杆菌， 染色，视野中菌落类型的比例大致为芽孢：杆菌＝9：7。
另外，鉴于功能菌株本身的代谢特性，采用琼脂扩散法检测混合培养各个时期上清液的 抑菌性能，结果如下表3。
表3 功能菌株混合培养下的抑菌性能
从抑菌性能来说，整个取样期的抑菌活性以G+抑菌活性为主，而且在混合菌培养前期， 随着短小芽孢杆菌数量增加，发酵过程泡沫的增加，其发酵液上清的抑菌活性也相应增加， 并且在12h时达到最大，G+抑菌圈直径达到22.2±0.2mm，随着发酵泡沫的减少，其它类型 菌株的增殖，G+抑菌性能也略有降低，从其G+抑菌特性与泡沫的联系，G+的抑菌活性成分 可能为脂肽类成分(如表面活性素、伊枯草菌素等)。不同于G+抑菌活性，G-抑菌活性直到培养12h后才勉强看到，而且抑菌圈也不清晰透明。
总的来说，不同类型的菌株在这同一体系下能够很好的共栖。不仅如此，菌株混合培养 展现的良好抑菌活性也为后续的固体发酵及动物养殖应用带来益处。
实施例4茶渣的菌酶协同发酵
固体发酵茶渣试验步骤如下：
发酵基质由湿的绿茶茶渣和辅料构成，茶渣：脱脂米糠：豆粕＝7：2：1。同时为了更好 的促进微生物对茶渣的转化，选用酶的协同发酵，其中，纤维素酶终浓度为300μ/g，半纤维 素酶终浓度为300μ/g，木聚糖酶终浓度为200μ/g，果胶酶终浓度为200μ/g。
采用液体混合菌液(即短小芽孢杆菌BP-09和植物乳杆菌LP-08的混合菌液，初始菌落 总数约1×106cfu/g；其中，短小芽孢杆菌BP-09：植物乳杆菌LP-08＝1：1.5)接种，接种量 按混合菌液与发酵基质的重量比为5：95计，同时，调节含水量，保证基质一触即散，且手 捏成团但不滴水为最佳(含水量约为40-45％)。然后将混合好的基质装入带有单向阀的发 酵袋中，常温(25-30℃)发酵7-10d，直至有酸甜的酒曲香味，表明发酵完成且充分。发酵完成后主要测定发酵样品的总活菌数、总酸、粗蛋白、酸溶蛋白、粗纤维、赖氨酸、苏氨酸 及甲硫氨酸等指标，检测方法参考国标及行业标准方法执行。
菌酶协同发酵9天，检测结果见表4。
表4 菌酶协同发酵茶渣
注：此次发酵指标的检测数据均以湿重计。
表4中的结果显示，采用混合菌液进行茶渣发酵：
(1)从发酵前后的水分含量来看，发酵后的水份含量较发酵前略有减少，说明BP-09和 LP-08的混合功能菌株能够在发酵基质中有效生长，并在整个发酵过程中产气或热。
(2)从菌落总数来看，发酵前接入混合菌的总菌落数为1×106cfu/g，该菌株能够首先 利用易消化的碳、氮源进行基础代谢(先好氧后厌氧)，特别是辅料豆粕，其中的氨基酸氮 等最有利于菌株的生长(菌株增加两个数量级)，同时其合成代谢产物如有机酸、酶等进一 步助力水解复杂底物，反过来促进菌株的进一步生长繁殖，体现了BP-09和LP-08菌株较好的 茶渣基质的适应性和生长特性。
(3)从蛋白含量来看，发酵后基质的粗蛋白有提高，其中酸溶蛋白明显增多。总粗蛋 白的含量的增加可能与水分、产气代谢等相关，毕竟辅料的添加有利于微生物繁殖，也有助 于微生物的代谢。另外，BP-09和LP-08菌株也加速基质中难溶蛋白分解，以及非蛋白氮的转 化与合成为可溶的小分子蛋白或肽，酸溶蛋白增加了83.6％。
(4)从发酵后的总酸来看，总酸含量大幅度提高，表明BP-09和LP-08菌株都能够适应 一定的酸性环境，并具备较好的产酸特性，特别是LP-08菌株，在厌氧条件下利用基质进行 酸代谢，而作为发酵饲料，一定的酸度值不仅利于发酵基质的防霉，而且作为生物饲料其也 有一定的诱食作用，体现了较好的应用特性。
(5)从粗纤维的含量来看，发酵前后，粗纤维的含量差异明显，这其中和外源添加的 酶制剂有关，同时也与菌株BP-09和LP-08的生长代谢密切相关。BP-09菌株较好的茶渣耐受 性和生长特性也充分展示了BP-09的粗纤维的降解能力，同时LP-08菌株的有机酸发酵特性， 也为复杂基质的代谢创造条件，这也是混合菌株能够发酵茶渣基质的基础，菌、酶协同条件 下，粗纤维含量降低了51.6％。
(6)从氨基酸的含量看，发酵前后必需氨基酸中的赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸都成倍的 增加，分别增加了7.7倍、8.0倍和3.3倍。这三个氨基酸作为动物营养中的限制性氨基酸，直 接影响动物对其他氨基酸的吸收利用，也充分体现了LP-08和BP-09菌株良好的茶渣发酵代谢 能力。
综上，本发明首选符合国家饲料微生物目录的安全菌株，为短小芽孢杆菌和植物乳杆菌， 这两种菌株组合有些具有正协同作用。短小芽孢杆菌具有较强的产酶能力，能够产包含蛋白 质酶、糖苷酶、淀粉酶以及脂肪酶等多种酶，并且能够代谢复合的碳氮源，分泌多种生物活 性物质如环脂肽、细菌素以及抗菌肽等等，这非常有利于降解绿茶茶渣中复杂含氮化合物， 并且利用部分碳水化合，从而提高饲料中氨基酸含量；植物乳杆菌不仅可以分泌一些酶类， 同时能够代谢产生多种有机酸及乳酸菌素，而这对提高饲料的品质大有帮助。在此基础上， 从ARTP诱变和茶渣的驯化定向选育出发，筛选能够耐受一定浓度茶渣，并能够以茶渣为主 要营养源生长的菌株，并通过评估不同功能菌株混合培养的可能性，建立“一罐多菌”混合 培养工艺，既解决单个菌株培养的费时费力费钱的问题，又能大大增加混合菌株的“共生” 特性，同时配以合适的辅料组合，促进混合功能微生物的繁殖，结合外源酶的协同，消化茶 渣中的大分子，释放茶中的活性成分，进一步挖掘原料利用空间，充分强化固体发酵中的群 落优势，提供高含量的益生菌及其功能性活性物质，有效的实现茶渣资源化利用，维护动物 肠道健康，为健康养殖带来益处。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的 限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离 本发明技术方案的实质和范围。