阅读说明：本技术 一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法 (Method for high-throughput screening of high-yield sophorolipid strains ) 是由 储炬 李前会 田锡炜 杭海峰 夏建业 庄英萍 李璟曦 张嘉兴 韩思宇 徐文静 杨 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法,所述方法包括：菌种活化的步骤；常压室温等离子体与亚硝酸钠组合诱变的步骤；松弛培养的步骤；多重压力培养的步骤；其中,所述菌种为假丝酵母菌；所述多重压力培养的步骤中采用碘乙酸和丙二酸结合进行双压力培养筛选。本发明的方法中采用常压室温等离子体与亚硝酸钠组合诱变,并采用松弛培养与碘乙酸和丙二酸双压力结合进行筛选,增加菌株的突变率以及正突变率,增加得到高产菌株的概率,进而得到遗传稳定性量好的高产菌株。(The invention discloses a method for screening high-yield sophorolipid strains in a high-throughput manner, which comprises the following steps: activating strains; carrying out combined mutagenesis on the normal-pressure room-temperature plasma and sodium nitrite; a step of relaxation culture; multiple pressure culture; wherein the strain is candida; in the step of the multiple pressure culture, iodoacetic acid and malonic acid are combined to carry out double pressure culture screening. According to the method, normal-pressure room-temperature plasma and sodium nitrite are combined for mutagenesis, relaxation culture and iodoacetic acid and malonic acid dual-pressure combination are adopted for screening, the mutation rate and positive mutation rate of the strain are increased, the probability of obtaining high-yield strains is increased, and the high-yield strains with good genetic stability are obtained.)

一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法。

背景技术

槐糖脂是一种糖脂类生物表面活性剂，虽然有多种微生物能够合成槐糖脂，但Candida bombicola是研究报道中最主要的生产菌。槐糖脂在工业生产和科学研究中备受关注，由于它对环境无害，被认为是最有前途的生物活性剂之一。由于槐糖脂本身的特性，在发酵生产过程中高耗氧粘度大，导致生产成本增加，因此筛选出高产的槐糖脂生产菌株就很有必要。

理性的基因工程育种方法是菌株改良的有利方法，但其主要有以下几个缺点：(1)细胞代谢是一个非常复杂的自适应网络，改变一两个基因可能无法达到要求的目标；(2)一些基因工程菌株相关产品的生产销售受到相关应用领域的限制。因此，传统诱变育种仍然是一种不可或缺获得优良性能生产菌株的方法，同时结合高通量筛选技术的快速发展，使得高性能菌株的可获得性大大提升。传统诱变方式一般分为物理诱变和化学诱变，物理诱变包括：紫外诱变、各种射线的辐射以及微波辐射等。化学诱变包括：亚硝基胍、亚硝酸、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、芥子气类以及核酸碱基类似物类等的化学诱变剂。Hafez等采用物理化学的诱变方法，使灰链霉菌E44G生产几丁质的酶活提高了1.39倍。而大气室温等离子体(ARTP)是一种基于射频大气压发光放电等离子体的新开发的全细胞诱变工具，诱导的DNA损伤随后被SOS系统修复，导致DNA改变，操作便捷、安全。

在诱变的过程中，诱变是手段，筛选是关键，合理的筛选模型为最终得到高产菌提供了方便。在菌株诱变的过程中，单一诱变方法的使用会使得诱变剂产生“疲劳效应”，代谢缓慢等；且单一诱变筛选出的菌株比较容易退化。一般传统的筛选流程多是把经过单一诱变后的菌株直接涂布在有压力的平板上。在传统的高通量筛选方法中，如周刚等的研究结果中可以看出传统的诱变方法得到的菌株生长缓慢且容易退化，筛选效率不高；周刚等在高通量筛选的过程中只采用了单一的筛选压力，最终得到的高产菌株在实际发酵的过程中较易退化。

因此，亟需提供一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，以增加菌株的突变率以及正突变率，增加得到高产菌株的概率，得到遗传稳定性量好的高产菌株。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，将ARTP诱变与亚硝酸钠形成组合诱变，并且引入松弛培养，组合压力培养筛选，能够有效提高菌株正突变率，提高筛选过程中正突变菌株的概率。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。

本发明提供了一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，所述方法包括：

菌种活化的步骤；

常压室温等离子体(ARTP)与亚硝酸钠组合诱变的步骤；

松弛培养的步骤；

多重压力培养的步骤；

其中，所述菌种为假丝酵母菌；所述多重压力培养的步骤中采用碘乙酸和丙二酸结合进行双压力培养筛选。

进一步，所述亚硝酸钠与所述ARTP组合诱变的总致死率为88～92％。

进一步，所述亚硝酸钠与所述ARTP组合诱变的总致死率90％。

进一步，所述菌种活化的步骤包括：取甘油管菌种接到活化培养基中，在220r/min、25℃摇瓶培养48h，以活化菌种，稀释使菌种浓度为10⁷个/ml，得到活化菌液。

进一步，所述常压室温等离子体(ARTP)与亚硝酸钠组合诱变的步骤包括：将所述活化菌液和亚硝酸钠溶液混合，得到5mg/L的亚硝酸钠的混合菌液，后置于220r/min、25℃培养10min，洗涤重悬，稀释，取适量菌液涂布并在ARTP仪器上诱变18～20s。

进一步，所述松弛培养的步骤包括：将组合诱变后的菌液接种到不含压力的96孔板种子培养基中进行松弛培养48h。

进一步，所述多重压力培养的步骤包括：将松弛培养结束后的菌液转接到96孔板中培养24h后，挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到24孔板中培养24h，再次挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到24孔板中培养24h，后，选菌浓(OD)较高的菌株稀释后涂布在固体平板上，培养三天，挑选菌落较大的菌株进行保存；

其中，所述96孔板和所述24孔板中均添加了含0.02g/L的碘乙酸的孔板种子液体压力培养基；所述固体平板中添加有含有10g/L的丙二酸的固体压力培养基。

进一步，所述多重压力培养的步骤包括：将松弛培养结束后的菌液转接到96孔板中培养24h后，挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到两个24孔板中培养24h，再次挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到一个24孔板中培养24h，后，选菌浓(OD)较高的5株菌株稀释后涂布在固体平板上，培养三天，挑选菌落较大的菌株进行保存。

进一步，所述高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法还包括初筛的步骤；

所述初筛的步骤包括：将所述挑选菌落较大的菌株转接到96孔板中无压力培养两天，后转接到24孔板无压力发酵培养基中培养三天，用碘法测定孔板中槐糖脂产量，选取槐糖脂产量较高的菌株。

进一步，所述活化培养基包括：50g/L葡萄糖、1g/L的KH₂PO₄、4g/L的(NH₄)₂SO₄、0.5g/L的MgSO₄·7H₂O、10g/L玉米浆。

进一步，所述孔板种子培养基包括：50g/L葡萄糖、1g/L的KH₂PO₄、4g/L的(NH₄)₂SO₄、0.5g/L的MgSO₄·7H₂O、10g/L玉米浆。

进一步，所述孔板种子液体压力培养基包括：50g/L葡萄糖、1g/L的KH₂PO₄、4g/L的(NH₄)₂SO₄、0.5g/L的MgSO₄·7H₂O、10g/L玉米浆。

进一步，所述固体压力培养基包括：20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L琼脂；pH自然。

本发明中，所述摇瓶发酵可采用常规方法进行培养。

本发明一具体实施例中，ARTP亚硝酸钠组合诱变的正突变率可以采用如下方法获得：将活化后的种子首先用合适浓度的亚硝酸钠处理，之后用无菌水重悬进行ARTP诱变；将诱变后的菌液稀释合适的倍数进行涂板，培养三天后挑选较大的单菌落接入96种子空板中进行培养两天，而后转接到24孔板发酵培养三天，结束后检测；计算ARTP亚硝酸钠组合诱变的正突变率。

本发明一具体实施例中，所使用的培养基可以采用常规培养基。例如，采用下列摇瓶发酵培养基、孔板发酵培养基和发酵培养基：

摇瓶发酵培养基包括：150g/L葡萄糖、1g/L的KH₂PO₄、4g/L的(NH₄)₂SO₄、0.5g/L的MgSO₄·7H₂O、10g/L玉米浆、6g/L的CaCO₃、50g/L菜籽油；

孔板发酵培养基包括：150g/L葡萄糖、1g/L的KH₂PO₄、4g/L的(NH₄)₂SO₄、0.5g/L的MgSO₄·7H₂O、10g/L玉米浆、6g/L的CaCO₃、50g/L三油酸甘油酯；

发酵培养基包括：100g/L葡萄糖、1g/L的KH₂PO₄、4g/L的(NH₄)₂SO₄、0.5g/L的MgSO₄·7H₂O、10g/L玉米浆10；灭菌时把葡萄糖液称到500g。

本发明中，突变率(QM)以及正突变率(QT)的计算公式如下：

式中：H代表挑选菌落总数；M代表突变菌总数；T代表产量高于出发菌的菌落数。本发明中，取槐糖脂产量超出5％的菌株作为正突变菌株的有效菌株，因为平行误差在3％左右。

本发明中，槐糖脂含量的测定：在初筛的过程中是采用碘法快速检测槐糖脂含量，配制出不同浓度梯度的纯的槐糖脂溶液，绘制成标准曲线。在复筛过程中采用DNS法进行检测，测定槐糖脂的含量。

本发明中，数据处理和分析是可采用origin8软件进行处理。

本发明的有益效果在于：

本发明采用常压室温等离子体与亚硝酸钠组合诱变，并采用松弛培养与压力培养结合，且采用碘乙酸和丙二酸双重压力培养筛选，可增加菌株的突变率以及正突变率，增加得到高产菌株的概率，进而得到遗传稳定性量好的高产菌株。组合诱变具有协同效应，能够有效提高菌株正突变率，并且使获得的菌株的遗传稳定较好，代与代之间产量变化较小；而松弛培养能够提高筛选过程中正突变菌株的概率，解决菌株生长缓慢筛选效率不高的问题；组合压力也是可以增加筛选过程中的突变率和正突变率，增加得到高产菌株的概率，同时，得到的高产菌株遗传稳定性好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明试验例1中菌株的槐糖脂产量图一。

图2为本发明试验例1中菌株的槐糖脂产量图二。

图3为本发明试验例2中菌株的槐糖脂产量图一。

图4为本发明试验例2中菌株的槐糖脂产量图二。

图5为本发明试验例3中菌株的槐糖脂产量图一。

图6为本发明试验例3中菌株的槐糖脂产量图二。

图7为本发明中的高产菌株与出发菌株摇瓶实验中的槐糖脂产量对比图。

图8为本发明中的高产菌株的遗传稳定性示意图。

图9为本发明中的高产菌株与出发菌株5L发酵罐实验中的槐糖脂产量对比图。

图10为本发明中的高产菌株与出发菌株5L发酵罐中的CER对比图。

图11为本发明中的高产菌株与出发菌株5L发酵罐中的槐糖脂产率对比图。

图12为本发明实施例2中的高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法的过程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，所述方法包括：

菌种活化的步骤；

常压室温等离子体(ARTP)与亚硝酸钠组合诱变的步骤；

松弛培养的步骤；

多重压力培养的步骤；

其中，所述菌种为假丝酵母菌；所述多重压力培养的步骤中采用碘乙酸和丙二酸结合进行双压力培养筛选。

本实施例中，所述菌种活化的步骤包括：取甘油管菌种接到活化培养基中，在220r/min、25℃摇瓶培养48h，以活化菌种，稀释使菌种浓度为10⁷个/ml，得到活化菌液。

本实施例中，所述常压室温等离子体(ARTP)与亚硝酸钠组合诱变的步骤包括：将所述活化菌液和亚硝酸钠溶液混合，得到5mg/L的亚硝酸钠的混合菌液，后置于220r/min、25℃培养10min，洗涤重悬，稀释，取菌液涂布并在ARTP仪器上诱变18～20s。

本实施例中，所述松弛培养的步骤包括：将组合诱变后的菌液接种到不含压力的96孔板的种子培养基中进行松弛培养48h。

本实施例中，所述多重压力培养的步骤包括：将所述松弛培养结束后的菌液转接到96孔板中培养24h后，挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到两个24孔板中培养24h，再次挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到一个24孔板中培养24h，后，选菌浓(OD)较高的5株菌株稀释后涂布在固体平板上，培养三天，挑选菌落较大的菌株进行保存。

本实施例中，所述96孔板和所述24孔板中均添加了含0.02g/L的碘乙酸的孔板种子液体压力培养基；所述固体平板中添加有含有10g/L的丙二酸的固体压力培养基。

实施例2

本实施例提供一种高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法，所述方法包括：

菌种活化的步骤；

常压室温等离子体(ARTP)与亚硝酸钠组合诱变的步骤；

松弛培养的步骤；

多重压力培养的步骤；

其中，所述菌种为假丝酵母菌；所述多重压力培养的步骤中采用碘乙酸和丙二酸结合进行双压力培养筛选。

本实施例中，所述菌种活化的步骤包括：取200μl甘油管菌种接到活化培养基中，500ml的摇瓶中，在220r/min、25℃摇瓶培养48h，以活化菌种，稀释使菌种浓度为10⁷个/ml，得到活化菌液。

本实施例中，所述常压室温等离子体(ARTP)与亚硝酸钠组合诱变的步骤包括：将所述活化菌液和亚硝酸钠溶液混合，得到5mg/L的亚硝酸钠的混合菌液，后置于220r/min、25℃培养10min，洗涤重悬，稀释，取10μl菌液涂布并在ARTP仪器上诱变20s。

本实施例中，所述松弛培养的步骤包括：将组合诱变后的菌液接种到不含压力的96孔板的种子培养基中进行松弛培养48h。

本实施例中，所述多重压力培养的步骤包括：将所述松弛培养结束后的菌液转接到96孔板中培养24h后，挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到两个24孔板中培养24h，再次挑选菌浓(OD)较高的菌株转接到一个24孔板中培养24h，后，选菌浓(OD)较高的5株菌株稀释后涂布在固体平板上，培养三天，挑选菌落较大的菌株进行保存。

本实施例中，所述96孔板和所述24孔板中均添加了含0.02g/L的碘乙酸的孔板种子液体压力培养基；所述固体平板中添加有含有10g/L的丙二酸的固体压力培养基。

本实施例中，所述高通量筛选高产槐糖脂菌株的方法还包括初筛的步骤；所述初筛的步骤包括：将所述多重压力培养的步骤中挑选的菌落较大的菌株转接到96孔板中无压力培养两天，后转接到24孔板无压力发酵培养基中培养三天，用碘法测定孔板中槐糖脂产量，选取槐糖脂产量较高的菌株，即可。

本实施例中，所述活化培养基和所述孔板种子培养基均包括：50g/L葡萄糖、1g/L的KH₂PO₄、4g/L的(NH₄)₂SO₄、0.5g/L的MgSO₄·7H₂O、10g/L玉米浆。

本实施例中，所述孔板种子液体压力培养基包括：50g/L葡萄糖、1g/L的KH₂PO₄、4g/L的(NH₄)₂SO₄、0.5g/L的MgSO₄·7H₂O、10g/L玉米浆。

本实施例中，所述固体压力培养基包括：20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L琼脂；pH自然。

本实施例中的组合诱变的致死率在90％左右。

本发明中，采用本实施例的方法进行多组平行实验。

实施例3

实施例3与实施例2相比较，区别仅在于：诱变组合条件为10min、5mg/L的亚硝酸钠诱变条件结合ARTP诱变18s。

对比例1

对比例1与实施例2相比较，区别仅在于：对比例1采用常压室温等离子体(ARTP)单独诱变。

对比例2

对比例2与实施例2相比较，区别仅在于：对比例2在诱变结束后直接进行多重压力培养，未采用松弛培养的步骤。

对比例3

对比例3与实施例3相比较，区别仅在于：对比例3只采用丙二酸压力作为筛选压力。

试验例1

本试验例分别对实施例2和对比例1中的菌株诱变结果进行测定。

方法：在诱变的步骤完成后，分别对诱变后的菌株进行测定，记录测定结果，如下所示：

①见图1，对比例1中，ARTP单独诱变的结果：总共菌株192株，其中突变菌株56株，突变率为29.2％，正突变率为12.5％。

②见图2，实施例2中，ARTP-亚硝酸钠的组合诱变的结果：总共菌株192株，其中突变菌株68株，突变率为35.4％，正突变率为24.5％。

本发明中，组合诱变应用在槐糖脂高产菌株的高通量筛选的过程中，不仅可以提高菌株的突变率，菌株的正突变率也得到了很大的提高。

试验例2

本试验例分别对实施例2和对比例2中的菌株突变结果进行测定。

方法：在压力培养结束后，分别对实施例2和对比例2中的菌株的突变情况进行测定，结果如下所示：

①见图3，对比例2中，无松弛培养的突变的结果如下：总共菌株192株，其中突变菌株90株，突变率为46.9％，正突变率为20.3％。

②见图4，实施例2中，松弛培养的菌株突变的结果如下：总共菌株192株，其中突变菌株112株，突变率为58.3％，正突变率为32.3％。

本发明中，松弛培养不仅增加了菌株的突变率，正突变率也得到很大的提高。松弛培养在一定程度上提高了高产菌株被筛选到的概率。

试验例3

本试验例分别对实施例3和对比例3中菌株的突变结果进行测定。

方法：在压力培养的筛选结束后，分别对实施例3和对比例3中的菌株的突变情况进行测定，结果如下所示：

①如图5所示，对比例3中，筛选的过程中只添加丙二酸压力作为筛选压力，总共192株，其中有56株发生突变，15株正突变。所以单一压力的突变率为29.17％，正突变率为7.81％。而产量超过10％的菌株为0，产量超过10％的菌株的正突变率为0。

②如图6所示，实施例3中，总共192株，其中有69株发生突变，32株正突变。所以双压力的突变率为35.94％，正突变率为16.69％。而产量超过10％的菌株为8，产量超过10％的菌株的正突变率为4.17％。

本发明中，以上结果表明组合压力筛选应用在槐糖脂高产菌株高通量筛选的过程中，可以提高菌株的突变率以及正突变率，同时也可以提高菌株的产量。

试验例4

本试验例对本发明实施例2中筛选出的菌株进行的遗传稳定性验证实验，具体步骤如下所示：

方法：取实施例2中经过所述初筛步骤后选取的产量较高的菌株进入摇瓶培养，采用DNS法进行检测，测定槐糖脂的含量，最终选出槐糖脂产量较高的一株进行发酵罐发酵，验证遗传稳定性。

所述发酵罐发酵：在5L的生物反应器中进行发酵，25℃下发酵7天，接种量为3％；溶解氧通过调整转速等保持在25％以上，使用4mol/L的氢氧化钠将发酵液的PH控制在3.5；发酵液中的葡萄糖浓度控制在30-80g/L，油浓度控制在2-10g/Kg。其中，发酵液中的葡萄糖浓度采用DNS法测定。

上述方法中最终筛选到一株高产菌株H1.5。

①见图7，对高产菌株H1.5进行摇瓶实验，对比出发菌株F6.5。将高产菌株与出发菌株进行对比。出发菌株为F6.5，高产菌株为H1.5，高产菌株较原始菌株产量提高41％。

②见图8，对高产菌株H1.5进行遗传稳定性实验。结果表明，该高产菌株经过五代传代产量变化不大，遗传稳定性较好。

可见，本发明中获得的高产菌株确为高产菌株，产量较出发菌株高出41％，且遗传稳定性较好。

③对槐糖脂高产菌株H1.5进行5L发酵罐验证，对比出发菌株F6.5。结果如下所示。

见图9，结果表明，出发菌株F6.5的槐糖脂产量为226g/L，高产菌株H1.5的槐糖脂产量为286.9g/L，高产菌株槐糖脂产量比出发菌株提高26.9％。

见图10，表明两个菌株的CER趋势基本相同，但发酵后期高产菌株的CER比出发菌株高。

见图11，为高产菌株H1.5与出发菌株F6.5的产率结果。从图上可以明显的看出高产菌株H1.5的产率比出发菌株F6.5高。

槐糖脂高产菌株在5L罐上的验证结果与出发菌株在5L罐上的验证结果相比，高产菌株的产量，产率等皆比出发菌株高。本发明得到的高产菌株H1.5，其发酵产量为286.9g/L，转化率为0.78g/g，产率为1.84g/L/h。由此可见，本发明筛选出的高产菌株的发酵性能较出发菌株优良许多。

目前报道的槐糖脂产量最高的是连续发酵的400g/L的。林雨萌等通过高通量筛选诱变等最终得到一株双底物利用的高产菌株，采用分批发酵，最终其高产菌株槐糖脂产量为225g/L；同时，其高产菌株的转化率为0.48g/g，产率为1.33g/L/h。而周刚等通过高通量筛选诱变得到一株高产菌株，采用分批发酵的方法，其高产菌株的最终产量为200g/L；同时，其高产菌株的转化率为0.49g/g。然而，本发明得到的高产菌株，其发酵产量最高达286.9g/L，转化率达0.78g/g，产率达1.84g/L/h。由此可见，本发明的方法能够有效筛选出槐糖脂高产菌株。

综上所述，本发明采用了组合诱变、松弛培养、组合压力培养的方法，基于组合诱变和松弛培养的理性高效高通量筛选体系，提高了提高了菌株的突变率和正突变率，获得槐糖脂高产菌株。通过不断的初筛以及复筛增大菌株的诱变库，正突变率以及突变率的提高，以获得更多高产菌株，用于提高产物的产量降低生产成本。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。