阅读说明：本技术 一种利用artp诱变以及筛选高产油率微藻的方法 (Method for mutagenizing and screening microalgae with high oil yield by ARTP ) 是由 孙昕 李鹏飞 黄峰 王瑾 于 2019-12-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法,主要包括两个过程：(1)利用ARTP对微藻进行诱变处理,通过调节诱变时间对诱变效果的影响,以致死率为依据确定最佳的诱变时间；(2)将在各诱变时间下诱变后的藻液进行梯度稀释(可高效准确计数)。均匀涂布于固体培养基上并在光照培养箱内倒置培养。培养10天后,挑选出颜色深,直径较大的藻落接种到液体培养基中,通过测定藻液的吸光度及经尼罗红染色后的中性油脂荧光值,可掌握微藻的细胞增殖速率与油脂积累的情况,通过两种基础指标及二者的乘积综合筛选,能够更好的筛选出高产油脂的诱变藻株,进一步提高微藻制备生物柴油可能性。(The invention discloses a method for mutagenizing and screening microalgae with high oil yield by utilizing ARTP, which mainly comprises two processes: (1) performing mutagenesis treatment on the microalgae by using ARTP, and determining the optimal mutagenesis time by adjusting the influence of the mutagenesis time on the mutagenesis effect and taking the lethality as a basis; (2) the algae liquid after mutagenesis at each mutagenesis time is subjected to gradient dilution (the algae liquid can be efficiently and accurately counted). Uniformly coating on a solid culture medium and performing inverted culture in a light incubator. After 10 days of culture, selecting algae colonies with deep color and large diameter, inoculating the algae colonies into a liquid culture medium, determining the absorbance of an algae solution and the fluorescence value of neutral oil dyed by Nile red to master the cell proliferation rate and the oil accumulation condition of the microalgae, and comprehensively screening by the product of two basic indexes and the product of the two basic indexes to better screen out mutagenic algae strains with high oil yield and further improve the possibility of preparing biodiesel by the microalgae.)

一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法。

背景技术

由于化石燃料的不可再生性，以及其燃烧对环境的影响，清洁燃料和可再生新能源引起了当今世界各国的广泛关注。生物质能源是地球上最普遍的一种可再生能源，它是通过植物光合作用，将太阳能以化学能的形式储存在生物体内的一种能量形式，被称为绿色能源。生物柴油是指来自生物体的油脂经转酯作用而形成的脂肪酸甲酯或乙酯，是一种生物质液体燃料，近年来已成为生物质能源研究中的热点。

目前，制约生物柴油发展的关键问题是原料严重不足，微藻具有种类多、生长速率快、固碳能力强、生长环境要求低等诸多优势而被认为是最有潜力替代传统化石燃料的生物资源。但是，不同藻种的生物量及油脂含量各不相同，生物量产率和油脂含量并非正相关，如四尾栅藻在培养过程中虽然生物量可以达到很高水平，但其油脂含量呈现较低趋势；另外，在环境胁迫时，小球藻生物量表现出较低水平，但是油脂含量却较高。因此单一的选择高生物量或高油脂含量的突变藻株不能充分地发挥微藻生物质能源的优势。

发明内容

针对以上所存在技术问题，本发明的目的是提供一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法。

本发明采用如下技术方案来实现的：

一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法，该方法中藻液先经ARTP诱变获得多种性状突变体，再经筛选获得目标性状-高产油量的藻株，具体包括如下步骤：

(1)将待诱变藻液至对数期的微藻藻液；

(2)等离子体诱变参数信息的确定，包括电压、电流、通气流量及诱变距离；

(3)设置不同诱变时间对微藻藻液进行诱变；

(4)将诱变过的藻液转移到事先配好的经过灭菌后的含10％的甘油和培养液的混合溶液中，使得甘油最终的浓度为5％，培养液以下简称为BG-11；

(5)将藻液稀释并均匀涂布于固体培养基上，并以未诱变藻液涂布平板做空白对照；

(6)在恒温光照培养箱内倒置培养观察，培养至10d后，分别对固体培养基上的诱变藻株和对照藻株进行计数并以确定各个诱变时间下的经ARTP诱变后的致死率；

(7)用灭菌后的接种环挑选直径较大，颜色较深的突变藻株，并接种于含BG-11培养基的6孔培养板中，并置于恒温光照培养箱内进行分批培养；

(8)对6孔板内培养的微藻分别测定其在第三天和第八天的吸光度OD680及经尼罗红染色后的油脂荧光值，以获得各突变藻株的比生长速率和相对荧光值，用来评估各突变藻株的增殖快慢及油脂积累情况；

(9)建立了三指标的筛选原则，通过以比生长速率、相对荧光值以及比生长速率和相对荧光值的乘积值为筛选指标来获得高油脂产量的突变体；

(10)确定了比生长速率大于正常株的10％，且相对荧光值大于正常株20％为第一筛选原则；以比生长速率和相对荧光值的乘积值大于对照株的35％第二筛选原则，补漏筛选高比生长速率突变体或高相对荧光值突变体；

(11)对筛选出的优势藻株进行传代培养，测定其比生长速率和相对荧光值的变化，利用SPSS数据统计分析确定传代培养的差异是否显著，差异不显著即传代培养性状较为稳定，满足高油脂基因的遗传稳定表达；

(12)通过组合筛选方式确定出油脂产量高的藻株，并进行油脂基因表达测定，最终确定高油脂基因表达的突变体并对其进行扩大培养，以进行后续制备生物柴油的研究。

本发明进一步的改进在于，步骤(1)中藻液预处理的方法为：微藻的最适诱变期为对数期，细胞浓度为10⁶个/毫升，该浓度下的细胞活力强更易于发生突变；并将5mL培养基和与同体积5mL10％甘油混合，甘油最终浓度为5％，以作为诱变后的保护营养液。

本发明进一步的改进在于，步骤(2)中诱变仪控制电源输入电压120V，电流1A，通入的空气流量为5L/min，诱变距离调节为2mm。

本发明进一步的改进在于，步骤(3)中对藻液进诱变的处理时间为0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、65s、70s；诱变前用酒精擦拭等离子体下方的载物台，并利用事先经过灭菌的盖子存放待诱变藻液并置于载物台上，调节盖子与等离子体装置出射口之间的距离为2mm；设置等离子体电压120V，电流1A，通入的空气流量为5L/min并稳压10min；通过调节不同诱变时间对藻液进行诱变，以致死率95％以上为参考，确定最佳诱变时间。

本发明进一步的改进在于，步骤(4)中要求将诱变过的藻液转移到甘油和BG-11培养基混合溶液中，对突变体起保护作用；分别准备5mL灭菌BG-11培养基和5mL体积分数为10％的灭菌甘油溶液加入到50mL塑料离心管，使得甘油最终的体积分数为5％。

本发明进一步的改进在于，步骤(5)中稀释涂布平板具体操作为：取1mL诱变后的藻液即含5％甘油和BG-11培养基的混合溶液，加入到9mL混合溶液即含5％甘油和BG-11培养基的混合溶液中进行稀释；再取稀释后的藻液200μL加入到90mm含BG-11培养基的固体平板上并用灭菌后的三角涂布棒均匀涂布，立即盖上盖子并倒置放入恒温光照培养箱进行培养；每一诱变条件下涂布三个平板作为平行，并且以未诱变处理藻液做空白对照。

本发明进一步的改进在于，步骤(6)和(7)中固体培养和6孔板培养均要求在恒温光照培养箱培养，光照周期为12h:12h，培养温度为25±1℃；固体培养10d后，对诱变组和对照组进行藻落计数，计算致死率并绘制致死曲线，按以下公式计算致死率：

致死率＝(未诱变组藻落数-诱变组藻落数)/未诱变组藻落数×100％

以致死率95％以上为最佳诱变时间的判断指标，对生长出的诱变藻株用灭菌过的接种环挑选直径较大，颜色较深的突变藻株至6孔板中进行液体培养。

本发明进一步的改进在于，步骤(8)和步骤(9)中比生长速率和相对荧光值分别由利用紫外分光光度计在680nm测定的吸光值和利用尼罗红对突变体藻液染色在荧光分光光度计下测定发射光波长570nm下的荧光值，其由激发光波长480，发射波长范围500-650nm计算决定，且步骤(8)中采用6孔板培养法实现对突变藻类的快速培养，缩短整个诱变的时间。

本发明进一步的改进在于，步骤(10)中考虑的第一筛选原则可以将同时具有快速生长速度和油脂积累能力的优势藻株突变筛选中，即具有两种优势性状；而通过第二筛选原则获取高生长速率或高油脂积累的优势突变体的单一优势性状；经过两个筛选原则获得所有高含油突变体。

本发明进一步的改进在于，步骤(11)中考虑的遗传稳定性基于各代之间的比生长速率和相对荧光值差异是否显著以及能否保持筛选条件的要求；

步骤(12)中获得的高产油突变藻株，进行扩大培养并在周期培养结束后，用离心法收集藻液并-80℃保存；通过基因库gene bank获得相关调控油脂合成的基因序列，利用RT-qPCR技术测定相关基因的表达量，最终验证并确定高产油突变株的产油能力。

本发明至少具有如下有益的技术效果：

为了更好的反映微藻产油能力，同时考虑高生物量和高油脂含量是评估微藻高产油能力最有效的指标。本发明通过对藻液进行ARTP诱变并进行了6孔板快速培养，建立了以比增长速率，相对油脂荧光的基础筛选原则以及比生长速率和相对油脂荧光乘积的综合指标作为补漏筛选的综合原则，筛选出产油量较高的突变藻株。能否提高微藻油脂产量、降低产品成本，关键在于能否选育出既能保证高生物量又能提高微藻的油脂含量，使得微藻油脂产量在短时间内达到较高水平，因此微藻诱变育种技术在生物质能源领域扮演着越来越重要的变得越来越重要。本发明筛选得到的诱变藻株可用于以下几个方面：

(1)可快速高效地筛选高油脂产量的突变藻株，在诱变育种中具有较大优势；

(2)利用组合筛选原则可获得高生物量，高油脂含量和高生物量和高油脂含量等不同性状藻株，可用作不同用途。

综上所述，本发明先通过确定常压室温等离子体诱变参数，以改变诱变时间来诱变微藻，通过致死率获得最佳诱变时间，在此基础上对最佳诱变时间下的突变藻株进行综合指标筛选，即比生长速率和相对荧光值为优先筛选原则，比生长速率与相对荧光值的乘积为补漏筛选原则，最终获得了高产油突变藻株，相比较目前已有的筛选方法，该筛选办法可以获得所有高产油性状的突变藻株，大大地提高了高产油突变藻株的获得率，可以更有效地筛选出目标藻株。

附图说明

图1为不同诱变时间下的致死率示意图；

图2为高油脂突变体的筛选示意图；

图3为高油脂突变体的遗传稳定性(1-AT60-5代表了60s条件下第五株第一代，与其他突变体表示类似)；

图4为油脂基因accD和dgat7566表达图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明做出进一步的说明，

本发明提供的一种利用ARTP诱变以及筛选高产油率微藻的方法，利用ARTP建立了一种高产油藻株的高效筛选方法。藻液先经ARTP诱变获得多种性状突变体，再经高效的筛选方法获得目标性状-高产油量的藻株，具体包括如下步骤：

(1)选择合适浓度的藻液进行诱变，即将藻液培养至对数期，浓度保持在10⁶个/mL左右；该步骤中藻液预处理的方法为：微藻的最适诱变期为对数期，此时细胞活力强，细胞浓度为10⁶个/毫升左右，取此时期的藻液0.1mL进行诱变；并将5mL培养基和5mL10％甘油混合，甘油最终浓度为5％，以作为诱变后的保护液。

(2)等离子体基本参数的确定及诱变前装置需通气通电稳定；该步骤中诱变仪控制电源输入电压120V，电流1A，通入的空气流量为5L/min，诱变距离调节为2mm。诱变前需要对仪器进行预热并通气稳定10分钟。

(3)以时间作为诱变过程的变量，对藻也进行诱变；该步骤中对藻液进行诱变具体操作为：对藻液进行诱变的处理时间为0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、65s、70s。诱变前用酒精擦拭等离子体下方的载物台，并利用事先经过灭菌的直径为1cm的塑料盖子存放待诱变藻液并置于载物台上，调节盖子与等离子体装置出射口之间的距离为2mm。设置等离子体电压120V，电流1A，通入的空气流量为5L/min并稳压10min。通过调节不同诱变时间对藻液进行诱变，以致死率95％以上为参考，确定最佳诱变时间。

(4)利用含5％的甘油培养基(BG-11)对诱变产生的突变体进行保护，并稳定3小时；该步骤中要求将诱变过的藻液转移到含5％甘油的BG-11培养基混合溶液中，高浓度下的甘油可以保护所产生的突变体保持当前的突变性状。

(5)将诱变过的藻液和未诱变的原始藻株稀释10³倍后，在无菌环境中均匀涂布到固体培养基；该步骤中稀释涂布平板具体操作为：将诱变的100μL的藻液连同灭菌盖子转移到10mL混合营养液(含5％甘油的BG-11培养基)置于光照培养箱稳定3h，之后再取稳定后的1mL诱变后的藻液加入到9mL混合溶液(含5％甘油的BG-11培养基)进行稀释，前后共稀释10³倍。最后取稀释后的突变藻液200μL加入到90mm含BG-11培养基的固体平板上并用灭菌的三角涂布棒均匀涂布，立即盖上盖子并倒置放入恒温光照培养箱进行培养。每一诱变条件下涂布三个平板作为平行，并且以未诱变处理藻液做空白对照。

(6)将涂布的固体培养及在恒温光照培养箱上倒置培养观察，培养10d后，分别对诱变组和对照组生长出来的藻落计数并计算各诱变时间下的致死率；

(7)对生长出诱变藻落用灭菌后的接种环挑选直径较大，颜色较深的藻株，接种至6孔板中用液体培养基培养筛选；步骤(6)和(7)中要求固体培养和6孔板培养均要求在恒温光照培养箱培养，光照周期为12h:12h，培养温度为25±1℃。固体培养10d后，形成了较为明显的藻落，并对诱变组和对照组进行藻落计数，计算各个诱变时间下的致死率并绘制致死曲线，按以下公式计算致死率：

致死率＝(对照组藻落数-诱变组藻落数)/未诱变组藻落数×100％

以致死率95％以上为最佳诱变时间的判断指标。对生长出的诱变藻株用灭菌过的接种环挑选直径较大，颜色较深的突变藻株至6孔板中进行液体培养。

(8)对6孔板内培养的微藻分别测定其在第三天和第八天的吸光度OD680及经尼罗红染色后的油脂荧光值，以获得各突变藻株的比生长速率和相对荧光值，用来评估各突变藻株的增殖快慢及油脂积累情况；

(9)建立了三指标的筛选原则，通过以比生长速率、相对荧光值以及比生长速率和相对荧光值的乘积值为筛选指标来获得高油脂产量的突变体的筛选办法；步骤(8)、(9)中要求藻细胞比生长速率和相对荧光值分别利用紫外分光光度计在680nm测定的吸光值以及利用尼罗红对突变体藻液染色前后的油脂荧光在荧光分光光度计下测定，即测定发射光波长570nm下的荧光值(激发光波长480，发射波长范围500-650nm)。

(10)确定了比生长速率大于正常株的10％，且相对荧光值大于正常株20％为第一筛选原则；以比生长速率和相对荧光值的乘积值大于对照株的35％第二筛选原则，主要补漏筛选高比生长速率突变体或高相对荧光值突变体。该步骤中考虑的第一筛选原则可以将同时具有快速生长速度和油脂积累能力的优势藻株突变筛选中，即具有两种优势性状；而通过第二筛选原则获取高生长速率或高油脂积累的优势突变体的单一优势性状。经过两个筛选原则可以获得所有高含油突变体。

(11)根据步骤(10)中组合筛选原则对筛选出的优势藻株进行传代培养，测定其比生长速率和相对荧光值的变化，利用SPSS数据统计分析确定传代培养的差异是否显著，差异不显著即传代培养性状较为稳定，满足高油脂基因的遗传稳定表达。该步骤中考虑的遗传稳定性基于各代之间的比生长速率和相对荧光值差异是否显著以及能否保持筛选条件的要求。

(12)通过组合筛选方式确定出油脂产量高的藻株，并进行油脂基因表达测定，最终确定高油脂基因表达的突变体并对其进行扩大培养，以进行后续制备生物柴油的研究。该步骤中获得的高产油突变藻株，进行扩大培养并在周期培养结束后，用离心法收集藻液并-80℃保存。通过基因库gene bank获得相关调控油脂合成的基因序列，利用RT-qPCR技术测定相关基因的表达量，最终验证并确定高产油突变株的产油能力。

实施例

本实施例以栅藻为例，详细说明此方法，本实施例栅藻购于中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库。所采用的ARTP诱变系统购自南京苏曼等离子科技有限公司。

1.采用BG11培养基培养删藻，将200mL栅藻藻液接种于500mL三角锥形瓶中，用无菌膜封闭瓶口，置于恒温光照培养箱中，采用半连续培养模式培养。平均光照强度：80μmol·m^-1·s^-1，光照周期：12L:12D，培养温度：(25±1)℃。每天随机调换三角锥形瓶的位置并摇动3-4次。

2.待培养至对数期，细胞浓度为10⁶个/毫升左右，此时细胞活力强，更适宜诱变，取藻液0.1mL于灭菌过的塑料盖子中待进行诱变。

3.配置5mL灭菌BG-11培养基和5mL体积分数为10％的灭菌甘油溶液并加入到50mL塑料离心管，使得甘油最终的体积分数为5％，作为诱变后的突变体保护溶液兼营养液；

4.诱变操作具体步骤：

(1)诱变仪控制电源输入电压设置为120V，电流1A，通入的空气流量为5L/min并稳压10min。

(2)本实施例以调节诱变时间为例，分别为0s、10s、20s、30s、40s、50s、60s、65s、70s，诱变前用酒精擦拭等离子体下方的载物台，并利用事先经过灭菌的直径为1cm的塑料盖子存放待诱变藻液并置于载物台上，调节盖子与等离子体装置出射口之间的距离为2mm。通过调节不同诱变时间对藻液进行诱变，以致死率95％以上为参考，确定最佳诱变时间。

(3)将诱变过的藻液转移到含5％甘油的BG11培养基(5mL BG11培养基+5mL 10％甘油溶液)中再悬浮并稳定在光照培养箱3h。

(4)取1mL悬浮后的藻液(含5％甘油和BG-11培养基的混合溶液)加入到9mL混合溶液(含5％甘油的BG-11培养基)进行稀释。再取稀释后的藻液200μL加入到90mm含BG-11培养基的固体平板上并用灭菌后的三角涂布棒均匀涂布，立即盖上盖子并倒置放入恒温光照培养箱进行培养。培养条件为光照周期为12h:12h，培养温度为25±1℃。每一诱变条件下涂布三个平板作为平行，并且以未诱变处理藻液做空白对照。

(5)培养10d后，对诱变组和对照组进行藻落计数，计算致死率并绘制致死曲线，按以下公式计算致死率：

致死率＝(未诱变组藻落数-诱变组藻落数)/未诱变组藻落数×100％

根据诱变育种理论，致死率在95％上时更容易获得正向突变。用接种环挑选直径较大，颜色较深的突变藻落转移至6孔板中进行液体培养，培养条件：平均光照强度：80μmol·m^-1·s^-1，光照周期：12L:12D，培养温度：(25±1)℃。为防止贴壁、静沉等现象的发生，每天轻微晃动六孔板2次，每次持续1分钟。

最终确定了60s、65s为最佳诱变时间(致死率分别达到了95％以上，70s后致死率达到了100％)。

(5)在第三天和第八天进行吸光度OD680及经尼罗红染色后的油脂荧光值进行监测，OD680nm为紫外分光光度计在波长680nm时测定的吸光值，相对荧光值测量方法为，取2mL藻液，再加入25％的二甲基亚砜1mL，同时做两组(其中一组为空白)，利用超声(500KW)超声3min，取其中一组加入50μL尼罗红试剂(100mg/L)，避光15min后，在荧光分光光度计下测定发射光波长570nm下的荧光值(激发光波长480，发射波长范围500-650nm)。以此获得各突变藻株的比生长速率和相对荧光值，用来评估各突变藻株的细胞增殖快慢及油脂积累情况；

(6)具体筛选原则以比生长速率大于正常株的10％，且相对荧光值大于正常株20％为第一筛选原则(优先)；以比生长速率和相对荧光值的乘积值大于正常株的35％为补漏筛选原则，此条件主要补漏筛选高比生长速率突变体或高相对荧光值突变体。筛选过程中AT命名个突变体，突变体之间以诱变时间区分，如AT60-1代表了在60s下挑选出的第一个藻株。将以上原则筛选出的诱变藻株接种于6孔板中在相同的条件下传代培养。

(7)测定6孔板中栅藻的比生长速率和相对荧光值的变化，利用SPSS数据统计软件分析确定传代培养的差异是否显著(建立在满足筛选条件的基础上)，差异不显著即传代培养性状较为稳定，满足高油脂基因的遗传稳定表达。如图3所示：

(8)确定了各突变株的产油稳定性后，对各优势突变株进行扩大培养(培养于250mL锥形瓶，培养条件不变)，待周期培养结束后，用离心法收集藻液并置于-80℃冰箱中保存。参考gen bank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的调控油脂合成代谢的油脂基因accD和dgat7566序列，利用q-PCR技术测定各油脂基因的表达。如图4所示：

经过测定油脂基因的表达，发现突变株的油脂基因表达量远高于正常株，利用以上筛选可以得到的高产油突变体。

发明人通过以上方法筛选出了一株遗传性能稳定，油脂产量达到343mg/L的优势突变藻株，较正常株提高了117％，大大提高了微藻生物质对制备生物柴油的可能性。如表1所示：

表1各突变株的生物量及油脂积累对比