一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法
阅读说明：本技术 一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法 (Non-toxic plasmid extraction kit with multifunctional reagent group and plasmid extraction method ) 是由 赵宇翔 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法,该试剂盒及质粒提取方法旨在解决现有技术下试剂盒内试剂组的功能单一,只能裂解某一类型的细胞,且提取的质粒浓度较低,并且样品最终的内毒素水平较高的技术问题。该试剂盒包括裂解试剂组、杂质去除试剂组、内毒素去除试剂组、质粒回收试剂和内毒素检测试剂,所述裂解试剂组用于裂解细胞,所述裂解试剂组包括试剂一和试剂二。该发明的具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法,将多种试剂集中在一个试剂盒内,便于质粒的提取操作,便于对内毒素水平进行检测,确保对内毒素的去除效果,适用于不同类型的细胞裂解,采用该方法提取的质粒浓度较高。(The invention discloses a non-toxic plasmid extraction kit with a multifunctional reagent group and a plasmid extraction method, and aims to solve the technical problems that the reagent group in the reagent kit has a single function, can only crack a certain type of cells, the concentration of extracted plasmids is low, and the final endotoxin level of a sample is high in the prior art. The kit comprises a lysis reagent group, an impurity removal reagent group, an endotoxin removal reagent group, a plasmid recovery reagent and an endotoxin detection reagent, wherein the lysis reagent group is used for lysing cells, and comprises a first reagent and a second reagent. According to the non-toxic plasmid extraction kit with the multifunctional reagent set and the plasmid extraction method, multiple reagents are concentrated in one reagent kit, so that the extraction operation of plasmids is facilitated, the detection of endotoxin levels is facilitated, the removal effect of endotoxin is ensured, the kit is suitable for cell lysis of different types, and the concentration of plasmids extracted by the method is high.)
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法。
背景技术
质粒广泛存在于生物界，具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体，大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。
目前，专利号为CN201710352847.X的发明专利公开了一种质粒提取试剂盒以及提取方法其包括用于裂解细胞的裂 解试剂组、用于去除杂质的洗涤试剂组、质粒溶解试剂和内毒素去除试剂。优选地，所述裂解试剂组由裂解液I、II和III组成，所述裂解液I为包含10mM EDTA、0.1067mg/ml RNase A和25mM Tris-HCl的水溶 液，所述裂解液I的pH为8.0；所述裂解液II为包含0.2M NaOH和质量分数1％的SDS的水溶液；所述裂解液III为包含2-6M盐酸胍和0.5M醋酸钾的水溶液，所述裂解液III的pH为 4.2。优选地，所述洗涤试剂组由洗液A和洗液B组成，所述洗液A为包含6-8M盐酸胍、20mM Tris-HCl和体积分数30-50％乙醇的水溶液， 所述洗液A的pH为6.0；所述洗液B为体积分数75-90％的乙醇水溶液。优选地，所述内毒素去除试剂为包含5-20％TritonX-114的水溶液。其成分简单，方便得到，但该试剂盒内试剂组的功能单一，只能裂解某一类型的细胞，且提取的质粒浓度较低，并且样品最终的内毒素水平较高。
因此，针对上述试剂盒功能单一和的问题，亟需得到解决，以改善试剂盒的使用场景。
发明内容
（1）要解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法，该试剂盒及质粒提取方法旨在解决现有技术下试剂盒内试剂组的功能单一，只能裂解某一类型的细胞，且提取的质粒浓度较低，并且样品最终的内毒素水平较高的技术问题。
（2）技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了这样一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法，该试剂盒包括裂解试剂组、杂质去除试剂组、内毒素去除试剂组、质粒回收试剂和内毒素检测试剂，
所述裂解试剂组用于裂解细胞，所述裂解试剂组包括试剂一和试剂二,所述试剂一包含1%的tritonX-100和苯甲基磺酰氟溶液，所述tritonX-100和苯甲基磺酰氟溶液的体积比为100:1.5，所述试剂二包含NP-40 Lysis Buffer和苯甲基磺酰氟溶液,所述NP-40Lysis Buffer和苯甲基磺酰氟溶液的体积比为100:1.5；
所述杂质去除试剂组用于从细胞破碎液得到质粒粗提液，所述杂质去除试剂组包括试剂三和试剂四；
所述质粒回收试剂用于将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒；
所述内毒素去除试剂组用于去除溶液中的内毒素，所述内毒素去除试剂组包括试剂五、试剂六和试剂七，所述试剂五、试剂六和试剂七的体积比为1.5：125:125；
所述内毒素检测试剂用于检测所得的质粒溶液中内毒素含量。
进一步地，所述试剂三中包含6-8M盐酸胍、20mM Tris-HCl、乙醇和水，所述试剂四包含乙醇和水。
进一步地，所述试剂五为1.5ml亲和树脂预装柱，所述试剂六为125ml再生缓冲液，其中包含1M Tris-HCl、0.5M EDTA和1M葡萄糖，所述试剂七为125ml平衡缓冲液，其中包含2M NaOH和10%SDS，所述试剂六和试剂七的PH值为8。
进一步地，所述质粒回收试剂为含有聚乙二醇和二甲基亚砜的水溶液。
进一步地，所述内毒素检测试剂为包含5- 20％TritonX-114的水溶液。
一种质粒提取方法，其包括如上述所述的一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒，其步骤如下：
步骤一：获取细胞破碎液：
a）: 根据需要，选用试剂一或试剂二，将1%的tritonX-100或NP-40 Lysis Buffer在室温下溶解混匀，然后加入苯甲基磺酰氟溶液，使溶液最终浓度达到1mM;
b）: 将待处理的培养液低速离心1-3min，弃上清液，留取沉淀物;
c）:往沉淀物中加入步骤一中的溶液，用移液器轻轻吹打，使溶液与细胞充分接触，离心后取上清液，所得上清液为细胞破碎液;
步骤二：获取质粒粗提液：
a）:将细胞破碎液上载于质粒吸附柱上，离心并滤出质粒吸附柱上的液体;
b）: 用试剂三洗涤质粒吸附柱，离心并滤出质粒吸附柱的液体;
c）: 用试剂四洗涤质粒吸附柱，离心并滤出质粒吸附柱的液体，重复操作两次，得到的滤液即为质粒粗提液;
步骤三：以1000:40~60的比例，往质粒粗提液中加入质粒回收试剂，振荡1-3min后，高速离心，去除上清液，得到带有内毒素的回收质粒溶液；
步骤四：去除内毒素：
a）：调节回收质粒溶液的PH值，使回收质粒溶液的PH值为6-9，将亲和树脂预装柱置于铁架台上，垂直固定，去除亲和树脂预装柱顶部盖子，使保护液在重力作用下流干，往亲和树脂预装柱中加入5ml预冷过的试剂六，保持流速在0.25ml/min待试剂六流干后，再次加入5ml试剂六，然后重复操作两次；
b）：加入6ml预冷过的试剂七，流速不高于0.25ml/min，流出液体积达到1.5ml后，使用无热原接收管接受带有内毒素的回收质粒溶液，溶液流干后，再加入1.5-3ml预冷过的试剂七，收集质粒溶液；
步骤五：通过质粒溶液内毒素检测试剂对质粒溶液的内毒素含量进行检测，若未能达到预期值，则重复步骤四的操作。
步骤六：将质粒溶液以高速离心1分钟停30秒的规律，重复操作5次，彻底去除残留液体，得到质粒，并于-20℃保存。
（3）有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法，将多种试剂集中在一个试剂盒内，便于质粒的提取操作，通过在试剂盒内增加通过内毒素检测试剂，便于对内毒素水平进行检测，内毒素去除试剂组可重复使用，确保对内毒素的去除效果，且从而确保内毒素水平符合要求，且裂解试剂组内包含有两中不同的试剂，适用于不同类型的细胞裂解，功能性更强，采用该方法提取的质粒浓度较高，能满足实验的要求。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面对本发明具体实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述，以进一步阐述本发明，显然，所描述的具体实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的样式。
实施例1
本具体实施方式是具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法，该试剂盒包括裂解试剂组、杂质去除试剂组、内毒素去除试剂组、质粒回收试剂和内毒素检测试剂，
裂解试剂组用于裂解细胞，裂解试剂组包括试剂一和试剂二,试剂一包含1%的tritonX-100和苯甲基磺酰氟溶液，1%的tritonX-100和苯甲基磺酰氟溶液的体积比为100:1.5，试剂二包含NP-40 Lysis Buffer和苯甲基磺酰氟溶液,NP-40 Lysis Buffer和苯甲基磺酰氟溶液的体积比为100:1.5；
杂质去除试剂组用于从细胞破碎液得到质粒粗提液，杂质去除试剂组包括试剂三和试剂四；
质粒回收试剂用于将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒；
内毒素去除试剂组用于去除溶液中的内毒素，内毒素去除试剂组包括试剂五、试剂六和试剂七，试剂五、试剂六和试剂七的体积比为1.5：125:125；
内毒素检测试剂用于检测所得的质粒溶液中内毒素含量。
进一步地，试剂三中包含6-8M盐酸胍、20mM Tris-HCl、乙醇和水，试剂四包含乙醇和水。
进一步地，试剂五为1.5ml亲和树脂预装柱，试剂六为125ml再生缓冲液，其中包含1M Tris-HCl、0.5M EDTA和1M葡萄糖，试剂七为125ml平衡缓冲液，其中包含2M NaOH和10%SDS，试剂六和试剂七的PH值为8。
进一步地，质粒回收试剂为含有聚乙二醇和二甲基亚砜的水溶液。
进一步地，内毒素检测试剂为包含5- 20％TritonX-114的水溶液。
一种质粒提取方法，其包括如上述所述的一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒，其步骤如下：
步骤一：获取细胞破碎液：
a）: 根据需要，选用试剂一或试剂二，将1%的tritonX-100或NP-40 Lysis Buffer在室温下溶解混匀，然后加入苯甲基磺酰氟溶液，使溶液最终浓度达到1mM;
b）: 将待处理的培养液低速离心1-3min，弃上清液，留取沉淀物;
c）:往沉淀物中加入步骤一中的溶液，用移液器轻轻吹打，使溶液与细胞充分接触，离心后取上清液，所得上清液为细胞破碎液;
步骤二：获取质粒粗提液：
a）:将细胞破碎液上载于质粒吸附柱上，离心并滤出质粒吸附柱上的液体;
b）: 用试剂三洗涤质粒吸附柱，离心并滤出质粒吸附柱的液体;
c）: 用试剂四洗涤质粒吸附柱，离心并滤出质粒吸附柱的液体，重复操作两次，得到的滤液即为质粒粗提液;
步骤三：以1000:40的比例，往质粒粗提液中加入质粒回收试剂，振荡1-3min后，高速离心，去除上清液，得到带有内毒素的回收质粒溶液；
步骤四：去除内毒素：
a）：调节回收质粒溶液的PH值，使回收质粒溶液的PH值小于6.8，将亲和树脂预装柱置于铁架台上，垂直固定，去除亲和树脂预装柱顶部盖子，使保护液在重力作用下流干，往亲和树脂预装柱中加入5ml预冷过的试剂六，保持流速在0.25ml/min待试剂六流干后，再次加入5ml试剂六，然后重复操作两次；
b）：加入6ml预冷过的试剂七，流速不高于0.25ml/min，流出液体积达到1.5ml后，使用无热原接收管接受带有内毒素的回收质粒溶液，溶液流干后，再加入1.5-3ml预冷过的试剂七，收集质粒溶液；
步骤五：通过质粒溶液内毒素检测试剂对质粒溶液的内毒素含量进行检测，若未能达到预期值，则重复步骤四的操作。
步骤六：将质粒溶液以高速离心1分钟停30秒的规律，重复操作5次，彻底去除残留液体，得到质粒，并于-20℃保存。
实施例2
本具体实施方式是具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法，该试剂盒包括裂解试剂组、杂质去除试剂组、内毒素去除试剂组、质粒回收试剂和内毒素检测试剂，
裂解试剂组用于裂解细胞，裂解试剂组包括试剂一和试剂二,试剂一包含1%的tritonX-100和苯甲基磺酰氟溶液，1%的tritonX-100和苯甲基磺酰氟溶液的体积比为100:1.5，试剂二包含NP-40 Lysis Buffer和苯甲基磺酰氟溶液,NP-40 Lysis Buffer和苯甲基磺酰氟溶液的体积比为100:1.5；
杂质去除试剂组用于从细胞破碎液得到质粒粗提液，杂质去除试剂组包括试剂三和试剂四；
质粒回收试剂用于将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒；
内毒素去除试剂组用于去除溶液中的内毒素，内毒素去除试剂组包括试剂五、试剂六和试剂七，试剂五、试剂六和试剂七的体积比为1.5：125:125；
内毒素检测试剂用于检测所得的质粒溶液中内毒素含量。
进一步地，试剂三中包含6-8M盐酸胍、20mM Tris-HCl、乙醇和水，试剂四包含乙醇和水。
进一步地，试剂五为1.5ml亲和树脂预装柱，试剂六为125ml再生缓冲液，其中包含1M Tris-HCl、0.5M EDTA和1M葡萄糖，试剂七为125ml平衡缓冲液，其中包含2M NaOH和10%SDS，试剂六和试剂七的PH值为8。
进一步地，质粒回收试剂为含有聚乙二醇和二甲基亚砜的水溶液。
进一步地，内毒素检测试剂为包含5- 20％TritonX-114的水溶液。
一种质粒提取方法，其包括如上述所述的一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒，其步骤如下：
步骤一：获取细胞破碎液：
a）: 根据需要，选用试剂一或试剂二，将1%的tritonX-100或NP-40 Lysis Buffer在室温下溶解混匀，然后加入苯甲基磺酰氟溶液，使溶液最终浓度达到1mM;
b）: 将待处理的培养液低速离心1-3min，弃上清液，留取沉淀物;
c）:往沉淀物中加入步骤一中的溶液，用移液器轻轻吹打，使溶液与细胞充分接触，离心后取上清液，所得上清液为细胞破碎液;
步骤二：获取质粒粗提液：
a）:将细胞破碎液上载于质粒吸附柱上，离心并滤出质粒吸附柱上的液体;
b）: 用试剂三洗涤质粒吸附柱，离心并滤出质粒吸附柱的液体;
c）: 用试剂四洗涤质粒吸附柱，离心并滤出质粒吸附柱的液体，重复操作两次，得到的滤液即为质粒粗提液;
步骤三：以1000:60的比例，往质粒粗提液中加入质粒回收试剂，振荡1-3min后，高速离心，去除上清液，得到带有内毒素的回收质粒溶液；
步骤四：去除内毒素：
a）：调节回收质粒溶液的PH值，使回收质粒溶液的PH值大于8.2，将亲和树脂预装柱置于铁架台上，垂直固定，去除亲和树脂预装柱顶部盖子，使保护液在重力作用下流干，往亲和树脂预装柱中加入5ml预冷过的试剂六，保持流速在0.25ml/min待试剂六流干后，再次加入5ml试剂六，然后重复操作两次；
b）：加入6ml预冷过的试剂七，流速不高于0.25ml/min，流出液体积达到1.5ml后，使用无热原接收管接受带有内毒素的回收质粒溶液，溶液流干后，再加入1.5-3ml预冷过的试剂七，收集质粒溶液；
步骤五：通过质粒溶液内毒素检测试剂对质粒溶液的内毒素含量进行检测，若未能达到预期值，则重复步骤四的操作。
步骤六：将质粒溶液以高速离心1分钟停30秒的规律，重复操作5次，彻底去除残留液体，得到质粒，并于-20℃保存。
实施例3
本具体实施方式是具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒及质粒提取方法，该试剂盒包括裂解试剂组、杂质去除试剂组、内毒素去除试剂组、质粒回收试剂和内毒素检测试剂，
裂解试剂组用于裂解细胞，裂解试剂组包括试剂一和试剂二,试剂一包含1%的tritonX-100和苯甲基磺酰氟溶液，1%的tritonX-100和苯甲基磺酰氟溶液的体积比为100:1.5，试剂二包含NP-40 Lysis Buffer和苯甲基磺酰氟溶液,NP-40 Lysis Buffer和苯甲基磺酰氟溶液的体积比为100:1.5；
杂质去除试剂组用于从细胞破碎液得到质粒粗提液，杂质去除试剂组包括试剂三和试剂四；
质粒回收试剂用于将质粒与细菌基因组 DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒；
内毒素去除试剂组用于去除溶液中的内毒素，内毒素去除试剂组包括试剂五、试剂六和试剂七，试剂五、试剂六和试剂七的体积比为1.5：125:125；
内毒素检测试剂用于检测所得的质粒溶液中内毒素含量。
进一步地，试剂三中包含6-8M盐酸胍、20mM Tris-HCl、乙醇和水，试剂四包含乙醇和水。
进一步地，试剂五为1.5ml亲和树脂预装柱，试剂六为125ml再生缓冲液，其中包含1M Tris-HCl、0.5M EDTA和1M葡萄糖，试剂七为125ml平衡缓冲液，其中包含2M NaOH和10%SDS，试剂六和试剂七的PH值为8。
进一步地，质粒回收试剂为含有聚乙二醇和二甲基亚砜的水溶液。
进一步地，内毒素检测试剂为包含5- 20％TritonX-114的水溶液。
一种质粒提取方法，其包括如上述所述的一种具有多功能试剂组的无毒型质粒提取试剂盒，其步骤如下：
步骤一：获取细胞破碎液：
a）: 根据需要，选用试剂一或试剂二，将1%的tritonX-100或NP-40 Lysis Buffer在室温下溶解混匀，然后加入苯甲基磺酰氟溶液，使溶液最终浓度达到1mM;
b）: 将待处理的培养液低速离心1-3min，弃上清液，留取沉淀物;
c）:往沉淀物中加入步骤一中的溶液，用移液器轻轻吹打，使溶液与细胞充分接触，离心后取上清液，所得上清液为细胞破碎液;
步骤二：获取质粒粗提液：
a）:将细胞破碎液上载于质粒吸附柱上，离心并滤出质粒吸附柱上的液体;
b）: 用试剂三洗涤质粒吸附柱，离心并滤出质粒吸附柱的液体;
c）: 用试剂四洗涤质粒吸附柱，离心并滤出质粒吸附柱的液体，重复操作两次，得到的滤液即为质粒粗提液;
步骤三：以1000:50的比例，往质粒粗提液中加入质粒回收试剂，振荡1-3min后，高速离心，去除上清液，得到带有内毒素的回收质粒溶液；
步骤四：去除内毒素：
a）：调节回收质粒溶液的PH值，使回收质粒溶液的PH值为7-8，将亲和树脂预装柱置于铁架台上，垂直固定，去除亲和树脂预装柱顶部盖子，使保护液在重力作用下流干，往亲和树脂预装柱中加入5ml预冷过的试剂六，保持流速在0.25ml/min待试剂六流干后，再次加入5ml试剂六，然后重复操作两次；
b）：加入6ml预冷过的试剂七，流速不高于0.25ml/min，流出液体积达到1.5ml后，使用无热原接收管接受带有内毒素的回收质粒溶液，溶液流干后，再加入1.5-3ml预冷过的试剂七，收集质粒溶液；
步骤五：通过质粒溶液内毒素检测试剂对质粒溶液的内毒素含量进行检测，若未能达到预期值，则重复步骤四的操作。
步骤六：将质粒溶液以高速离心1分钟停30秒的规律，重复操作5次，彻底去除残留液体，得到质粒，并于-20℃保存。
采用实施例3进行操作时，样品的内毒素水平最低，且提取的质粒浓度最高。
以上描述了本发明的主要技术特征和基本原理及相关优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性具体实施方式的细节，而且在不背离本发明的构思或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将上述具体实施方式看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
表1
此外，应当理解，虽然本说明书按照各实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
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