一种果上叶dna的提取方法
阅读说明：本技术 一种果上叶dna的提取方法 (Method for extracting DNA from fruit upper leaves ) 是由 杨建波 杨佳红 张旭 罗云 杨艳 张道琴 于 2021-10-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物DNA提取的技术领域,具体涉及一种果上叶DNA的提取方法,包括步骤：(1)将果上叶置于聚丙烯酰胺溶液中搅拌10-20min,取出冲洗,表面喷洒非离子表面活性剂溶液,再经液氮速冻后,研磨成粉末；(2)向粉末中加DNA提取溶液进行水浴提取；(3)加抽提溶液混匀,离心,取上清液A；(4)向上清液A中加氯仿/异戊醇混合物混匀,离心,取上清液B；(5)向上清液B中加无水乙醇混匀,静置、离心,析出沉淀、水洗；本发明方法具有DNA提取率高、杂质少的特点,符合后续DNA分子学鉴定的要求。(The invention belongs to the technical field of plant DNA extraction, and particularly relates to a method for extracting DNA of fruit leaves, which comprises the following steps: (1) placing the upper leaves of the fruits in a polyacrylamide solution, stirring for 10-20min, taking out and washing, spraying a nonionic surfactant solution on the surface, quickly freezing by liquid nitrogen, and grinding into powder; (2) adding DNA extraction solution into the powder for water bath extraction; (3) adding the extraction solution, mixing uniformly, centrifuging, and taking supernatant A; (4) adding a chloroform/isoamyl alcohol mixture into the supernatant A, uniformly mixing, centrifuging, and taking a supernatant B; (5) adding absolute ethyl alcohol into the supernatant B, uniformly mixing, standing, centrifuging, separating out a precipitate, and washing with water; the method has the characteristics of high DNA extraction rate and less impurities, and meets the requirement of subsequent DNA molecular identification.)
技术领域
本发明属于植物DNA提取的技术领域，具体涉及一种果上叶DNA的提取方法。
背景技术
果上叶为《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)收载品种，来源于兰科植物云南石仙桃Pholidota yunnanensis Rolfe的干燥根状茎和假鳞茎，具有养阴清肺，化痰止咳，行气止痛之功效，用于肺结核咳嗽、咯血，慢性气管炎，慢性咽炎，疝气疼痛，疮疡肿痛等症。
目前从收集的果上叶野生资源来看，其具有复杂的多样性，仅从形态鉴定来说，难以对其准确鉴定，因此，采用生物学鉴定能够提高鉴定的准确性，而现有的DNA提取方法，所得的DNA质量不优，难以满足后续鉴定。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出了一种果上叶DNA的提取方法。
具体是通过以下技术方案来实现的：
一种果上叶DNA的提取方法，包括如下步骤：
(1)按照1：(1.3-1.8)的料液质量比将果上叶置于聚丙烯酰胺溶液中搅拌10-20min，取出冲洗1-2次后，表面喷洒果上叶质量0.1-0.5％的非离子表面活性剂溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；
(2)将果上叶粉末倒入冷的EP管内，并加入预热至水浴温度的DNA提取溶液，摇匀后水浴30-60min，在水浴期间来回颠倒3-5次；
(3)取出EP管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液A；所述抽提溶液与DNA提取溶液的体积比为1:1；
(4)将上清液A转入新EP管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液B；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液A的体积比为1:1；
(5)取上清液B转移到新离心管中，加入0.8-1倍体积的预冷无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于-20℃下10-20min，再12000×g离心10min，使DNA充分析出得到DNA沉淀；
(6)水洗DNA沉淀1-2次。
所述聚丙烯酰胺溶液的体积浓度为10-30％。
所述非离子表面活性剂溶液的体积浓度为40-50％。
所述非离子表面活性剂选吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、司盘-20、司盘-80中任一种。
所述DNA提取溶液为2-3％CTAB，0.08％-0.1％(V/V)β-巯基乙醇，0.01％-0.04％阴离子表面活性剂，1.1-1.3mol/LNaCl。
所述阴离子表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠。
所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物。
所述水浴温度为55-60℃。
所述氯仿/异戊醇混合物为按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物。
所述预冷无水乙醇的温度为5-10℃。
有益效果：
本发明方法具有DNA提取率高、杂质少的特点，符合后续DNA分子学鉴定的要求。
本发明根据果上叶化学成分含量的特点，研究出了适合果上叶组DNA的提取方法，降低了多糖、多酚等次生代谢产物对完整DNA提取步骤的干扰，同时降低了提取温度，避免了温度对DNA的破坏，提高了DNA完整率，具体体现在：
1)本发明利用聚丙烯酰胺，对表面杂质进行脱除。
2)本发明利用非离子表面活性剂以及液氮速冷的手段，改善了果上叶的孔隙结构，使得DNA易于溶出。
3)本发明通过优化DNA提取溶液配方，尤其加入阴离子表面活性剂后，极大改善了蛋白质、多糖、纤维等物质的水解和结合情况，同时改善了DNA等成分的增溶效果，降低了提取温度，进而避免了较高温度对DNA的分解破坏。
4)由于高盐存在下，CTAB与蛋白质、多糖等物质结合，而不与DNA结合，进一步确保了DNA的完整性。
5)本发明使用无水乙醇，避免了异丙醇沉淀DNA的同时，与盐类、糖类等发生共沉淀，并且由于乙醇易于挥发，因此通过水洗即可，避免了乙醇清洗，减少了化学试剂的使用。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
实施例1
一种果上叶DNA的提取方法，包括如下步骤：
(1)按照1：1.3的料液质量比将果上叶置于体积浓度为10％的聚丙烯酰胺溶液中搅拌10min，取出冲洗1次后，表面喷洒果上叶质量0.1％的吐温20溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；所述吐温20溶液的体积浓度为40％；
(2)将果上叶粉末倒入冷的EP管内，并加入温度55℃的DNA提取溶液，摇匀后55℃条件下水浴30min，在水浴期间来回颠倒3次；所述DNA提取溶液为2％CTAB，0.08％(V/V)β-巯基乙醇，0.01％十二烷基苯磺酸钠，1.1mol/LNaCl；
(3)取出EP管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液A；所述抽提溶液与DNA提取溶液的体积比为1:1；所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物；
(4)将上清液A转入新EP管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液B；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液A的体积比为1:1；所述氯仿/异戊醇混合物按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物；
(5)取上清液B转移到新离心管中，加入0.8倍体积的5℃无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于-20℃下10min，再12000×g离心10min，使DNA充分析出得到DNA沉淀；
(6)水洗DNA沉淀1次。
实施例2
一种果上叶DNA的提取方法，包括如下步骤：
(1)按照1：1.8的料液质量比将果上叶置于体积浓度为30％的聚丙烯酰胺溶液中搅拌20min，取出冲洗2次后，表面喷洒果上叶质量0.5％的吐温40溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；所述吐温40溶液的体积浓度为50％；
(2)将果上叶粉末倒入冷的EP管内，并加入温度60℃的DNA提取溶液，摇匀后60℃条件下水浴60min，在水浴期间来回颠倒5次；所述DNA提取溶液为3％CTAB，0.1％(V/V)β-巯基乙醇，0.04％十二烷基苯磺酸钠，1.3mol/LNaCl；
(3)取出EP管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液A；所述抽提溶液与DNA提取溶液的体积比为1:1；所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物；
(4)将上清液A转入新EP管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液B；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液A的体积比为1:1；所述氯仿/异戊醇混合物按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物；
(5)取上清液B转移到新离心管中，加入1倍体积的10℃无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于-20℃下20min，再12000×g离心10min，使DNA充分析出得到DNA沉淀；
(6)水洗DNA沉淀2次。
实施例3
一种果上叶DNA的提取方法，包括如下步骤：
(1)按照1：1.4的料液质量比将果上叶置于体积浓度为15％的聚丙烯酰胺溶液中搅拌18min，取出冲洗2次后，表面喷洒果上叶质量0.4％的司盘-20溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；所述司盘-20溶液的体积浓度为48％；
(2)将果上叶粉末倒入冷的EP管内，并加入温度58℃的DNA提取溶液，摇匀后58℃条件下水浴50min，在水浴期间来回颠倒4次；所述DNA提取溶液为2.5％CTAB，0.08％(V/V)β-巯基乙醇，0.04％十二烷基苯磺酸钠，1.2mol/LNaCl；
(3)取出EP管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液A；所述抽提溶液与DNA提取溶液的体积比为1:1；所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物；
(4)将上清液A转入新EP管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液B；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液A的体积比为1:1；所述氯仿/异戊醇混合物按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物；
(5)取上清液B转移到新离心管中，加入0.9倍体积的8℃无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于-20℃下15min，再12000×g离心10min，使DNA充分析出得到DNA沉淀；
(6)水洗DNA沉淀1次。
实施例4
一种果上叶DNA的提取方法，包括如下步骤：
(1)按照1：1.5的料液质量比将果上叶置于体积浓度为20％的聚丙烯酰胺溶液中搅拌15min，取出冲洗1次后，表面喷洒果上叶质量0.3％的司盘-80溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；所述司盘-80溶液的体积浓度为45％；
(2)将果上叶粉末倒入冷的EP管内，并加入温度57℃的DNA提取溶液，摇匀后57℃条件下水浴45min，在水浴期间来回颠倒4次；所述DNA提取溶液为2.5％CTAB，0.09％(V/V)β-巯基乙醇，0.02％十二烷基苯磺酸钠，1.2mol/LNaCl；
(3)取出EP管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液A；所述抽提溶液与DNA提取溶液的体积比为1:1；所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物；
(4)将上清液A转入新EP管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液B；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液A的体积比为1:1；所述氯仿/异戊醇混合物按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物；
(5)取上清液B转移到新离心管中，加入0.9倍体积的8℃无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于-20℃下15min，再12000×g离心10min，使DNA充分析出得到DNA沉淀；
(6)水洗DNA沉淀2次。
实施例5
一种果上叶DNA的提取方法，包括如下步骤：
(1)按照1：1.6的料液质量比将果上叶置于体积浓度为25％的聚丙烯酰胺溶液中搅拌13min，取出冲洗2次后，表面喷洒果上叶质量0.2％的吐温80溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；所述吐温80溶液的体积浓度为45％；
(2)将果上叶粉末倒入冷的EP管内，并加入温度59℃的DNA提取溶液，摇匀后59℃条件下水浴32min，在水浴期间来回颠倒3次；所述DNA提取溶液为2％CTAB，0.1％(V/V)β-巯基乙醇，0.01％十二烷基苯磺酸钠，1.1mol/LNaCl；
(3)取出EP管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液A；所述抽提溶液与DNA提取溶液的体积比为1:1；所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物；
(4)将上清液A转入新EP管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000×g离心5min，取上清液B；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液A的体积比为1:1；所述氯仿/异戊醇混合物按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物；
(5)取上清液B转移到新离心管中，加入0.8倍体积的7℃无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于-20℃下12min，再12000×g离心10min，使DNA充分析出得到DNA沉淀；
(6)水洗DNA沉淀1次。
实验例1
将实施例1、3所得DNA沉淀挥干后用100μLTE溶解并用凝胶电泳检查DNA提取情况，经电泳检测的条带明亮、清晰、无脱带；同时利用紫外吸收方法检测显示：实施例1和实施例3所得DNA沉淀中均无蛋白质、多糖等杂质残留；一般按照果上叶粉末0.04g用DNA提取溶液600μL进行处理，用1.00g果上叶提取后，实施例1获得约32.10μg的DNA，实施例3获得约31.06μg的DNA，其他实施例组经过相同的方法检测，情况一致，且每1.00g果上叶的DNA提取量在31.00-32.10μg之间，各实施例组的DNA提取量结果无显著差异。
实验例2
采用实施例2的方法对以下果上叶样品进行鉴定；样品情况如下：
样品1：根状茎匍匐，粗壮，粗2-6毫米，被杯状膜质鞘或鞘腐烂后残存的纤维。假鳞茎在根状茎上，卵状圆锥形或狭卵形，顶生1枚叶，干后灰褐色。叶革质，长圆形。花葶黄绿色带紫红色条斑，从假鳞茎基部抽出，直立。假鳞茎在根状茎上聚生或紧靠，近圆柱形，顶生1枚叶，基部被鞘腐烂后残存的纤维。叶革质，狭长圆形，近无柄，在背面中肋隆起。
样品2：根状茎匍匐，每相距3-6个节间发出1个茎。茎黄色或黄褐色，通常下垂，多分枝。假鳞茎金黄色，稍扁纺锤形，具1个节间，顶生1枚叶。叶革质，长圆形或长圆状披针形。
样品3：假鳞茎密集，卵形，略扁，叶椭圆状长圆形，革质，稍带肉质，花葶长10-20厘米；花序柄近圆柱形，无明显的翅，亦无不育苞片；总状花序通常具10余朵花，淡橘红色，稍疏离，花期10-11月。
样品4：根状茎匍匐，假鳞茎密集，近长圆形，顶端或近顶端具1叶。
样品5：根状茎较细长，匍匐。假鳞茎狭卵形至近圆柱形，顶端生2枚叶。叶长圆形或长圆状披针形，纸质。
样品6：根状茎较细长，匍匐。假鳞茎狭卵形至近圆柱形，顶端生2枚叶。叶长圆形或长圆状披针形，纸质。花葶从已长成的假鳞茎顶端发出，长5-10厘米；总状花序通常具1-2朵花，花淡黄色，仅唇瓣上有红色斑纹；花瓣丝状或狭线形，与萼片近等长；唇瓣卵形，3裂。
样品7：根状茎匍匐，常分枝，假鳞茎细长梭形，顶端生1枚叶，较小。须根较多。
样品8：根状茎较细长，匍匐。假鳞茎狭卵形至近圆柱形，顶端生2枚叶。叶长圆形或长圆状披针形，纸质。花葶从已长成的假鳞茎顶端发出，长5-10厘米；总状花序通常具1-2朵花，花淡黄色，仅唇瓣上有红色斑纹；花瓣丝状或狭线形，与萼片近等长；唇瓣卵形，3裂。
样品9：假鳞茎密集，近狭卵形或卵形，叶倒披针形或狭椭圆状倒披针形，坚纸质，花葶长11-25厘米；
样品10：根状茎匍匐，常分枝，假鳞茎卵形，叶披针形，厚革质，花葶生于幼嫩的假鳞茎顶端，连同幼叶从靠近老假鳞茎基部的根状茎上发出。
样品11，根状茎匍匐，分枝，密被鳞片状鞘，节上疏生根；假鳞茎狭卵形至卵状长圆形，顶端生2叶。叶线形或线状披针形，纸质。花葶生于幼嫩假鳞茎顶端，发出时其基部连同幼叶均为鞘所包。
样品12：根状茎匍匐，幼时被鞘，老的在节上被鞘残留下来的纤维，根出自生有假鳞茎的根状茎节上。假鳞茎卵形，基部被鞘腐烂后残留的硬直纤维，干后黄色，具纵棱，叶厚革质，狭长圆形，叶柄对折。
对以上样品提取的DNA做ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列PCR反应，以通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)为引物按照表1的反应体系以如下反应条件扩增真菌的ITS1-5.8SrRNA-ITS4序列。
然后，利用1％(w/v)琼脂糖凝胶在100V电压下对电泳扩增产物30min，以检查扩增是否成功。
表1 PCR反应体系
序列分析：将所得PCR电泳检测后送交Invitrogen(上海，中国)或擎科生物技术有限公司(北京，中国)公司测序，将所测序列提交到NCBI Genebank数据库上进行BLAST比对，根据比对结果选取相似度最大且具有代表性的菌种利用MEGA5.10软件采用邻-接(Neighbor-joining，NJ)法进行聚类分析。
结果显示：
样品1：将其扩增得到的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列在NCBI GenBank数据库数据上进行Blast比对后发现其与Bulbophyllum andersonii isolate SMSDLITS(AccessionNo.JN619417.1)相似度最大，达到98％。同时，采用MEGA 5.10软件用N-J构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据Blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品1鉴定为梳帽卷瓣兰B.andersonii。
样品2：将其扩增得到的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列在NCBI GenBank数据库数据上进行Blast比对后发现其与Dendrobium albopurpureum isolate CT2(Accession No.:MK483264.1)相似度最大，达到97％。同时，采用MEGA 5.10软件用N-J构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据Blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品2鉴定为D.albopurpureum。
样品3：将其扩增得到的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列在NCBI GenBank数据库数据上进行Blast比对后发现其Liparis guangxiensis voucher L.Li 153(AccessionNo.KF589875.1)相似度最大，达到99％。同时，采用MEGA 5.10软件用N-J构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据Blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品3鉴定为广西羊耳蒜L.guangxiensis。
样品4和样品5中植物为形态完全相同，为同一种植物：将其扩增得到的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列在NCBI GenBank数据库数据上进行Blast比对后发现其与L.balansaevoucher L.Li 152(Accession No.KF589874.1)和L.latilabris voucher Z.J.Liu 4770(Accession No.KJ459291.1)相似度最大，均达到98％。同时，采用MEGA 5.10软件用N-J构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据Blast比对结果和系统发育树分析结果，样品4和样品5未能与某一个序列单独聚类在一起，同时参考其形态特征，将样品4和样品5初步鉴定为羊耳蒜Liparis sp.属植物。
样品6：将其扩增得到的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列在NCBI GenBank数据库数据上进行Blast比对后发现其与Coelogyne fimbriata voucher L.Li 11(IBSC)(AccessionNo.KR857330.1)和C.fimbriata var.leungiana voucher KFBG260(AccessionNo.KY966507.1)相似度最大，均达到99％。同时，采用MEGA 5.10软件用N-J构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据Blast比对结果和系统发育树分析结果，同时参考其形态特征，将样品6初步鉴定为流苏贝母兰C.fimbriata。
样品7：将其扩增得到的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列在NCBI GenBank数据库数据上进行Blast比对后发现其与Bulbophyllum shweliense voucher Jian-Wu_Li1636(Accession No.MK164507.1)相似度最大，达到99％。同时，采用MEGA 5.10软件用N-J构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据Blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品7鉴定为伞花石豆兰B.shweliense W.W.Sm.。
样品8：将其扩增得到的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列在NCBI GenBank数据库数据上进行Blast比对后发现其与Coelogyne fimbriata voucher KFBG712(AccessionNo.KY966506.1)和C.fimbriata voucher L.Li 11(IBSC)(Accession No.KR857330.1)相似度最大，达到99％。同时，采用MEGA 5.10软件用N-J构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据Blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品8鉴定为流苏贝母兰C.fimbriata。
样品9：将其扩增得到的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列在NCBIGenBank数据库数据上进行Blast比对后发现其与L.balansae voucher L.Li 152(Accession No.KF589874.1)相似度最大，达到97％。同时，采用MEGA 5.10软件用N-J构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据Blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品9鉴定为羊耳蒜Liparis sp.属植物。
样品10：将其扩增得到的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列在NCBI GenBank数据库数据上进行Blast比对后发现其与Pholidota missionariorum voucher KFBG225(AccessionNo.KY966652.1)相似度最大，达到99％。同时，采用MEGA 5.10软件用N-J构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据Blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品10鉴定为尖叶石仙桃P.missionariorum。
样品11：将其扩增得到的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列在NCBI GenBank数据库数据上进行Blast比对后发现其与P.cantonensis voucher KFBG658A(AccessionNo.KY966649.1)相似度最大，达到96％。同时，采用MEGA 5.10软件用N-J构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据Blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品11鉴定为细叶石仙桃P.cantonensis。
样品12：将其扩增得到的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列在NCBI GenBank数据库数据上进行Blast比对后发现其与Bulbophyllum tianguii isolate TGSDLITS(AccessionNo.JN619415.1)相似度最大，达到99％。同时，采用MEGA 5.10软件用N-J构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据Blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品12鉴定为天贵卷瓣兰B.tianguii。
以上鉴定中，除了样品4、样品5和样品9仅鉴定到属外，其它所有植物均鉴定到种，且其余9种材料分属8个不同种。
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