一种尿液基因组提取试剂盒及使用方法
阅读说明：本技术 一种尿液基因组提取试剂盒及使用方法 (Urine genome extraction kit and use method ) 是由 王文婧 张炳为 于 2021-10-15 设计创作，主要内容包括：本申请提供的尿液基因组提取试剂盒,包括：裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；其中,所述裂解液包括盐酸胍、尿素、乙酸铵及曲拉通X-100,所述裂解结合液中盐酸胍的浓度为1～1.5mol/L,尿素的浓度为50～100mmol/L,乙酸铵的浓度为1～50mmol/L、曲拉通X-100的浓度为10％～20％(v/v),上述试剂盒操作简便,无需对尿液样本进行预处理,整个过程室温操作时间短,提取效率高。(The application provides a urine genome extraction kit, includes: lysis solution, first washing solution, second washing solution and eluent; the lysis solution comprises guanidine hydrochloride, urea, ammonium acetate and Triton X-100, the concentration of the guanidine hydrochloride in the lysis binding solution is 1-1.5mol/L, the concentration of the urea is 50-100 mmol/L, the concentration of the ammonium acetate is 1-50 mmol/L, and the concentration of the Triton X-100 is 10-20% (v/v), the kit is simple and convenient to operate, a urine sample does not need to be pretreated, the room temperature operation time in the whole process is short, and the extraction efficiency is high.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种尿液基因组提取试剂盒及其使用方法。
背景技术
膀胱癌(BCa)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，全球每年约有549,393例新增病例和199,922例死亡病例。而约75％的患者患有非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)，其中有70％的肿瘤会复发，因此，患有NMIBC的患者需进行频繁的治疗和监测，这就导致需要更高的治疗成本。目前用于监测BCa复发的金标准是膀胱镜检查和细胞学检查，但具有侵入性，成本高，而尿液细胞学检查具有高度特异性，但缺乏敏感性。荧光原位杂交(FISH)的灵敏度较高，广泛用于常规的BCa临床检测，但对低度或小肿瘤的敏感性较低。DNA甲基化是基因表达的重要表观遗传调控因子，表达异常通常会导致基因表达缺陷，在许多肿瘤中，抑癌基因甲基化的增加是早期事件之一。因此可通过检测基因的异常甲基化，对膀胱癌进行筛查诊断、判断复发转移和治疗方案的选择等。
尿液中DNA来自于尿道中的脱落细胞，用尿液DNA分子进行分子生物学基础研究和临床诊断有很多特殊的优点：1)尿液收集物是非介入、无创性的。2)从尿液中提取DNA要比从血液中提取DNA更加简单。
发明内容
鉴于此，有必要针对现有技术存在的缺陷提供一种专门用于从尿液中提取基因组DNA的的尿液基因组提取试剂盒及其使用方法。
为解决上述问题，本发明采用下述技术方案：
本申请提供了一种尿液基因组提取试剂盒，包括：裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；其中，所述裂解液包括盐酸胍、尿素、乙酸铵及曲拉通X-100，所述裂解结合液中盐酸胍的浓度为1～1.5mol/L，尿素的浓度为50～100mmol/L，乙酸铵的浓度为1～50mmol/L、曲拉通X-100的浓度为10％～20％(v/v)。
在其中一些实施例中，所述第一洗涤液包括以下原料：盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、盐酸和异丙醇。
在其中一些实施例中，所述第一洗涤液中盐酸胍的浓度为3～6mol/L、三羟甲基氨基甲烷的浓度为15～25mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为2～3mmol/L、盐酸的体积浓度为0.1％～0.2％、异丙醇的体积浓度为20％～30％。
在其中一些实施例中，所述第二洗涤液包括以下原料：乙酸钠、乙酸铵和冰乙酸。
在其中一些实施例中，所述第二洗涤液中乙酸钠浓度为150～200mmol/L，所述乙酸铵的浓度为200～300mmol/L、冰乙酸的体积浓度为1％～2％，所述乙醇的体积浓度为5-10％。
在其中一些实施例中，所述洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸。
在其中一些实施例中，所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度5～15mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1～2mmol/L。
另外，本申请还提供了一种所述的尿液基因组提取试剂盒的使用方法，包括下述步骤：
将尿液样本离心收取沉淀，在沉淀中加入所述裂解液和蛋白酶K溶液，并置于离心管中混合均匀后得到第一混合液；
将所述第一混合液置于金属浴中孵育后进行离心处理，收集上清液；
在所述上清液中加入异丙醇混合均匀后静置，得到第二混合液；
将所述第二混合液转移至DNA制备管中离心，弃滤液；
将所述DNA制备管置回到所述离心管中然后加入所述第一洗涤液后离心并弃滤液；
将所述DNA制备管置回到所述离心管中然后加入所述第二洗涤液后离心并弃滤液；
将所述DNA制备管晾干后加入所述洗脱液以洗脱核酸，离心收集上清液并保存。
在其中一些实施例中，在将所述DNA制备管晾干后加入所述洗脱液以洗脱核酸，离心收集上清液并保存的步骤中，所述上清液于-18～-22℃下保存。
本申请采用上述技术方案具备下述效果：
本申请提供的尿液基因组提取试剂盒，包括：裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；其中，所述裂解液包括盐酸胍、尿素、乙酸铵及曲拉通X-100，所述裂解结合液中盐酸胍的浓度为1～1.5mol/L，尿素的浓度为50～100mmol/L，乙酸铵的浓度为1～50mmol/L、曲拉通X-100的浓度为10％～20％(v/v)，上述试剂盒操作简便，无需对尿液样本进行预处理，整个过程室温操作时间短，提取效率高。
此外，本申请提供的尿液基因组提取试剂盒，可提取大量体积尿液样本，10-50ml的尿液样本均可使用本试剂盒提取，所提取的DNA纯净，可直接用于PCR、DNA甲基化鉴定、癌症早期检测等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的尿液基因组提取试剂盒的使用方法的步骤流程图。
图2为本申请实施例1及实施例2所提样本中β-actin基因扩增曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本申请提供的尿液基因组提取试剂盒，包括：裂解液、第一洗涤液、第二洗涤液和洗脱液；其中，所述裂解液包括盐酸胍、尿素、乙酸铵及曲拉通X-100，所述裂解结合液中盐酸胍的浓度为1～1.5mol/L，尿素的浓度为50～100mmol/L，乙酸铵的浓度为1～50mmol/L、曲拉通X-100的浓度为10％～20％(v/v)。
在其中一些实施例中，所述第一洗涤液包括以下原料：盐酸胍、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、盐酸和异丙醇。
进一步地，所述第一洗涤液中盐酸胍的浓度为3～6mol/L、三羟甲基氨基甲烷的浓度为15～25mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为2～3mmol/L、盐酸的体积浓度为0.1％～0.2％、异丙醇的体积浓度为20％～30％。
在其中一些实施例中，所述第二洗涤液包括以下原料：乙酸钠、乙酸铵和冰乙酸。
进一步地，所述第二洗涤液中乙酸钠浓度为150～200mmol/L，所述乙酸铵的浓度为200～300mmol/L、冰乙酸的体积浓度为1％～2％，所述乙醇的体积浓度为5-10％。
可以理解，由于第二洗涤液中包括的乙酸铵、乙酸钠均有利于溶解残留蛋白。
在其中一些实施例中，所述洗脱液包括三羟甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸。
进一步地，所述洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度5～15mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1～2mmol/L。
可以理解，由于洗脱液中加入了乙二胺四乙酸可去除干扰离子影响，从而更稳定溶解核酸。
请参阅图1，本申请还提供了本申请还提供了一种所述的尿液基因组提取试剂盒的使用方法，包括下述步骤：
步骤S110：将尿液样本离心收取沉淀，在沉淀中加入所述裂解液和蛋白酶K溶液，并置于离心管中混合均匀后得到第一混合液。
具体地，提供新鲜的10～50ml尿液样本，3000×g离心，留取1ml沉淀并转移到1.5ml离心管中12000×g离心1min弃上清收集沉淀，向沉淀中加入500μL的裂解液、20μL的蛋白酶K。
步骤S120：将所述第一混合液置于金属浴中孵育后进行离心处理，收集上清液。
具体地，将混合液置于85℃金属浴中裂解15min，并将裂解后的溶液12000×g离心收集上清液，并转移至一干净的1.5ml离心管中。
步骤S130：在所述上清液中加入异丙醇混合均匀后静置，得到第二混合液。
具体地，在收集到的上清中加入0.5倍体积的异丙醇并混匀，得到第二混合液。
步骤S140：将所述第二混合液转移至DNA制备管中离心，弃滤液。
具体地，将上述第二混合液转移至准备好的DNA制备管中6000×g离心1min并弃掉滤液。
步骤S150：将所述DNA制备管置回到所述离心管中然后加入所述第一洗涤液后离心并弃滤液。
具体地，将所述DNA制备管置回到所述离心管中，加入500μL第一洗涤液，12000×g离心1min。
步骤S160：将所述DNA制备管置回到所述离心管中然后加入所述第二洗涤液后离心并弃滤液。
具体地，将所述DNA制备管置回到所述离心管中后加入700μL第二洗涤液12000×g离心1min，弃滤液后重复一次。
步骤S170：将所述DNA制备管晾干后加入所述洗脱液以洗脱核酸，离心收集上清液并保存。
具体地，将晾干后的DNA制备管置于另一干净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加入50μL洗脱液，室温静置2min，12000×g离心2min洗脱DNA，收集洗脱液并保存。
在其中一些实施例中，在将所述DNA制备管晾干后加入所述洗脱液以洗脱核酸，离心收集上清液并保存的步骤中，所述上清液于-18～-22℃下保存。
上述尿液基因组提取试剂盒在使用过程中无需对尿液样本进行预处理，减少提取时间，提取过程中未使用有毒试剂，操作安全，可高效提取基因组DNA，提取产物可用于下游进一步实验。
此外，本申请提供的尿液基因组提取试剂盒，可提取大量体积尿液样本，10-50ml的尿液样本均可使用本试剂盒提取，所提取的DNA纯净，可直接用于PCR、DNA甲基化鉴定、癌症早期检测等。
以下结合具体实施例对本申请的技术方案进行详细描述。
实施例1
本申请实施例1提供了一种提取尿液中细胞基因组DNA的试剂盒，包括裂解结合液、第一洗涤液、第二洗涤液及洗脱液。
其中，裂解液包括以下原料：盐酸胍、尿素、乙酸钠、曲拉通X-100；盐酸胍的浓度为1.25mol/L，尿素的浓度为75mmol/L，乙酸钠的浓度为40mmol/L，曲拉通X-100的浓度为18.75％(v/v)。
第一洗涤液中盐酸胍的浓度4mol/L、三羟甲基氨基甲烷的浓度为20mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为2.5mmol/L、盐酸的体积浓度为0.15％、异丙醇的体积浓度为25％；
第二洗涤液中乙酸钠浓度为180mmol/L、乙酸铵的浓度为250mmol/L，冰乙酸的体积浓度为1.5％；
洗脱液中三羟甲基氨基甲烷的浓度10mmol/L、乙二胺四乙酸的浓度为1.5mmol/L；洗脱液的pH为8。
使用实施例1中的试剂盒提取人体尿液样本3份，按如下步骤操作：
1)实验前准备：
(1)第一次使用时，在试剂瓶中加入指定体积的无水乙醇；
(2)准备85℃温浴；
(3)使用前检查裂解结合液是否有沉淀析出，若出现沉淀，应于70℃温浴加热至沉淀完全溶解后再使用；
(4)配制浓度为20mg/ml的蛋白酶K溶液。
2)实验步骤：
(1)准备3支50ml的离心管，分别收集三份30ml的尿液样本；将三份样本3000×g离心5min，留取1ml沉淀并转移到1.5ml离心管中12000×g离心弃上清收集沉淀；
(2)向沉淀中加入500μL的裂解液、20μL的蛋白酶K溶液并混合均匀；
(3)将(2)中的混合液置于85℃金属浴中裂解15min；
(4)将裂解后的溶液12000×g离心收集上清并转移至干净的1.5ml离心管中；
(5)在收集到的上清中加入0.5倍体积的异丙醇并混匀；
(6)将步骤(5)得到的混合液转移至准备好的DNA制备管中6000×g离心1min并弃掉滤液；
(7)将制备管置回到原来的离心管中，加入500μL第一洗涤液，12000×g离心1min；
(8)将制备管置回到原来的离心管中后加入700μL第二洗涤液，12000×g离心1min，弃滤液后重复一次；
(9)将晾干后的DNA制备管置于另一干净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加入50μL洗脱液，室温静置2min，12000×g离心2min洗脱DNA，收集洗脱液并保存。
提取完成后对DNA进行定量和纯度检测。各取2μL样本，以上述所用洗脱液为空白，使用Quawell超微量分光光度计Q3000测定样本A260、A280的值并利用比值评估核酸的纯度。
实施例2
准备3支50ml的离心管，分别收集三份30ml的尿液样本；将三份样本3000×g离心5min，留取1ml沉淀并转移到1.5ml离心管中12000×g离心弃上清收集沉淀。使用普通市售尿液基因组提取试剂盒提取3份尿液样本。
提取完成后对DNA进行定量和纯度检测。各取2μL样本，以上述所用洗脱液为空白，使用Quawell超微量分光光度计Q3000测定样本A260、A280的值并利用比值评估核酸的纯度。
对于上述实施例1和实施例2中提取尿液DNA用实时荧光定量PCR检测β-actin基因，Ct值结果如下表。
表1-本发明试剂盒提取不同尿液样本中DNA的浓度及PCR检测Ct值
从表1中可知，实施例1即使用本发明中的试剂盒可以很好地提取尿液中细胞基因组DNA，提取到的DNA浓度和纯度都较高，表中C(ng/μL)表示所提取的DNA浓度，A260/280的比值表示了蛋白质等有机物的污染程度，高质量的样品A260/280的比值应在1.8-2.0之间。样本1-3均为使用上述方法所提取，可以看出3份样本的260/280比值均大于1.8，说明样本中无蛋白质等物质污染，使用30mL尿液提取的DNA浓度均高于80ng/μL。不论是从提取浓度还是提取纯度上都要优于实施例2即普通市售试剂盒的提取结果。从荧光定量PCR的结果来看实施例1提取样本β-actin基因扩增的Ct值比实施例2中提取样本的Ct值要低2-3，Ct值越大说明靶DNA的含量越低，说明本试剂盒能有效地提取到尿液中的基因组DNA，提取的量可供下一步实验使用。
实施例3-6
实施例3-6与实施例1的不同之处在于裂解液中盐酸胍浓度不同，具体如表2所示
表2实施例3-7裂解液中盐酸胍浓度
实施例3
实施例4
实施例5
实施例6
实施例7
盐酸胍浓度
0.5mol/L
1mol/L
1.5mol/L
2mol/L
2.5mol/L
分别收集30ml的尿液样本；将样本3000×g离心5min，留取1ml沉淀并转移到1.5ml离心管中12000×g离心弃上清收集沉淀。使用本试剂盒提取样本。除裂解液中盐酸胍浓度不同外其余均同实施例1，提取完成后对DNA进行定量和纯度检测。各取2μL样本，以上述所用洗脱液为空白，使用Quawell超微量分光光度计Q3000测定样本A260、A280的值并利用比值评估核酸的纯度。结果如表3所示。
表3实施例3-7提取样本结果
从表3中可知实施例3-7中提取的尿液样本结果，提取样本浓度在60-90ng/μL，核酸A260/280均在1.80以上，样本中无蛋白质等物质污染。其中实施例4、5中提取的核酸浓度和实施例3、6和7中相比均要高，实施例3-7中提取样本纯度之间并无明显差异。以上结果说明本试剂盒裂解液中盐酸胍最适浓度在1-1.5mol/L之间，样本裂解效果较好，提取的核酸可供下一步实验使用。
以上仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。