一种快速提取高纯度质粒dna的方法
阅读说明：本技术 一种快速提取高纯度质粒dna的方法 (Method for rapidly extracting high-purity plasmid DNA ) 是由 樊菲 杨召军 薛帮凯 王硕 王立东 田艳维 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种快速提取高纯度质粒DNA的方法,包括1)细菌的培养、2)细菌的裂解、3)质粒DNA的分离、4)质粒DNA的沉淀,其中,在步骤3)中使用的离心柱为硅膜吸附柱,步骤4)中的清洗液A为5M异硫氰酸胍、20mM Tris-cl与浓度为37.5％乙醇的混合液,其pH为6.0。本发明的方法提取的质粒DNA的含量高、纯度高,且在制备过程中没有使用有害试剂,安全无隐患,不会伤害人员健康。(The invention provides a method for quickly extracting high-purity plasmid DNA, which comprises 1) culturing bacteria, 2) cracking the bacteria, 3) separating the plasmid DNA and 4) precipitating the plasmid DNA, wherein a centrifugal column used in the step 3) is a silicon membrane adsorption column, a cleaning solution A in the step 4) is a mixed solution of 5M guanidinium isothiocyanate, 20mM Tris-cl and 37.5% ethanol, and the pH value of the mixed solution is 6.0. The plasmid DNA extracted by the method has high content and high purity, no harmful reagent is used in the preparation process, the safety is safe, no hidden danger exists, and the health of people is not injured.)
技术领域
本发明属于核酸提取纯化技术领域，尤其是涉及一种快速提取高纯度质粒DNA的方法。
背景技术
质粒是存在于细菌染色体外的能独立复制并稳定遗传的环状双链DNA分子，质粒DNA是基因工程的常用载体，可以携带外源基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达。质粒DNA提取的效率及质量对后续实验(酶切、PCR扩增等)的成功与否有着直接的关系，因此快速高效地从细菌细胞中提取和传话质粒具有重要的意义。
碱裂解法是一种应用最为广泛的现有制备质粒DNA的方法，碱变形抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变形与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变形。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但是超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
但是现有的碱裂解法存在以下不足：
1、实验过程中杂蛋白和RNA去除不干净，使得最终提取出来的质粒DNA纯度不高。
2、提取的DNA含量低。
3、在实验过程中使用到苯酚/氯仿/异戊醇等有害试剂，不利于人员健康。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种快速提取高纯度质粒DNA的方法，该方法提取的质粒DNA的含量高、纯度高，且在制备过程中没有使用有害试剂，安全无隐患，不会伤害人员健康。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种快速提取高纯度质粒DNA的方法，包括以下步骤：
1)细菌的培养：挑选单一的菌落在液体培养基中进行扩大培养，之后吸取培养后的菌液无菌封装在两个离心管中，离心，吸干上清液；
2)细菌的裂解：向离心管中加入溶液I，充分悬浮细菌沉淀；之后加入溶液II，缓慢翻转数次，使其充分混匀；之后加入溶液III，缓慢翻转数次，至形成白色聚合物；
3)质粒DNA的分离：将步骤2)中得到的溶液在离心后取上清液放置在收集管内的离心柱中；
4)质粒DNA的沉淀：离心后弃掉收集管内的废液，继续装载离心柱；
向离心柱内加入清洗液A，离心后弃掉滤液；
之后向离心柱内加入清洗液B，离心后弃掉滤液并重复该步骤4次；
将离心柱放入无菌工作台的无菌EP管内，加入预热后的TE缓冲液，静置1min；
离心后，去掉离心柱，无菌EP管内即得到目的DNA，放入-20℃保存或者常温干燥保存；
其中，所述的离心柱为硅膜吸附柱，所述清洗液A为5M异硫氰酸胍、20mM Tris-cl与浓度为37.5％乙醇的混合液，其pH为6.0。
一种快速提取高纯度质粒DNA的方法，包括以下步骤：
1)细菌的培养：挑选单一的菌落在液体培养基中进行扩大培养，在35℃-40℃下培养12-16小时，吸取培养后的菌液3.0ml无菌封装在两个1.5ml的离心管中，4℃下10000rpm-12000rpm离心2min，吸干上清液；
2)细菌的裂解：向每个离心管中加入150μL溶液I，充分悬浮细菌沉淀；之后加入200μL溶液II，缓慢翻转数次，使其充分混匀，裂解3-5min；之后加入250μL溶液III，缓慢翻转数次且温和振荡10s，至形成白色聚合物，室温放置10min；
3)质粒DNA的分离：将步骤2)中得到的溶液在4℃下10000rpm-12000rpm离心15min，之后取上清液放置在收集管内的离心柱中；
4)质粒DNA的沉淀：10000rpm-12000rpm离心1min，弃掉收集管内的废液，继续装载离心柱；
向离心柱内加入400μL清洗液A，10000rpm-12000rpm离心30s，弃掉滤液；
之后向离心柱内加入580μL清洗液B，10000rpm-12000rpm离心30s，弃掉滤液并重复该步骤4次；
将离心柱放入无菌工作台的1.5ml的无菌EP管内，加入预热后的TE缓冲液60-100μL，静置1min；
10000rpm-12000rpm离心1min，去掉离心柱，无菌EP管内即得到目的DNA，放入-20℃保存或者常温干燥保存。
进一步地，溶液I为25mM Tris-cl与10mM EDTA高压灭菌后加入RNaseA 2.5mg/ml得到，其pH为8.0。
进一步地，溶液II为0.2M NaOH与1％SDS。
进一步地，溶液III为5M盐酸胍与4M醋酸钾，其pH为4.8。
进一步地，清洗液B为浓度为60％-80％的乙醇。
进一步地，TE缓冲液为10mM Tris·HCl，pH8.0和1mM EDTA，pH8.0。
本发明具有的优点和积极效果是：
1、本发明的质粒DNA的提取方法，提取的质粒DNA的纯度高，且在提取过程中不使用有害试剂，可以保证实验安全，另外，在该方法中的收集管内使用硅膜吸附可以吸附裂解后的DNA，便于将后期的杂蛋白和RNA除去，且保证不会有多余的DNA损失。
2、本发明的方法中，清洗液A为5M异硫氰酸胍、20mM Tris-cl与浓度为37.5％乙醇的混合液，在进行清洗时，可以将多余的杂蛋白进行溶解，使得杂蛋白和RNA去除干净，从而提高质粒DNA的纯度和含量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。
实施例1：
一种快速提取高纯度质粒DNA的方法，包括以下步骤：
1)细菌的培养：挑选单一的菌落在液体培养基中进行扩大培养，在35℃下培养12小时，吸取培养后的菌液3.0ml无菌封装在两个1.5ml的离心管中，4℃下10000rpm离心2min，吸干上清液；
2)细菌的裂解：向每个离心管中加入150μL溶液I，充分悬浮细菌沉淀；之后加入200μL溶液II，缓慢翻转数次，使其充分混匀，裂解3min；之后加入250μL溶液III，缓慢翻转数次且温和振荡10s，至形成白色聚合物，室温放置10min；
3)质粒DNA的分离：将步骤2)中得到的溶液在4℃下10000rpm离心15min，之后取上清液放置在收集管内的离心柱中；离心柱为硅膜吸附柱；
4)质粒DNA的沉淀：10000rpm离心1min，弃掉收集管内的废液，继续装载离心柱；
向离心柱内加入400μL清洗液A，10000rpm离心30s，弃掉滤液；
之后向离心柱内加入580μL清洗液B，10000rpm离心30s，弃掉滤液并重复该步骤4次；
将离心柱放入无菌工作台的1.5ml的无菌EP管内，加入预热后的TE缓冲液60，静置1min；
10000rpm离心1min，去掉离心柱，无菌EP管内即得到目的DNA，放入-20℃保存。
其中，在本实施例中，溶液I为25mM Tris-cl与10mM EDTA高压灭菌后加入RNaseA2.5mg/ml得到，其pH为8.0；溶液II为0.2M NaOH与1％SDS；溶液III为5M盐酸胍与4M醋酸钾，其pH为4.8；清洗液A为5M异硫氰酸胍、20mM Tris-cl与浓度为37.5％乙醇的混合液，其pH为6.0；清洗液B为浓度为60％的乙醇；TE缓冲液为10mM Tris·HCl，pH8.0和1mM EDTA，pH8.0。
采用本实施例的方法提取DNA的含量为896μg/mL，A260/A280＝1.85。
实施例2：
一种快速提取高纯度质粒DNA的方法，包括以下步骤：
1)细菌的培养：挑选单一的菌落在液体培养基中进行扩大培养，在40℃下培养16小时，吸取培养后的菌液3.0ml无菌封装在两个1.5ml的离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液；
2)细菌的裂解：向每个离心管中加入150μL溶液I，充分悬浮细菌沉淀；之后加入200μL溶液II，缓慢翻转数次，使其充分混匀，裂解5min；之后加入250μL溶液III，缓慢翻转数次且温和振荡10s，至形成白色聚合物，室温放置10min；
3)质粒DNA的分离：将步骤2)中得到的溶液在4℃下12000rpm离心15min，之后取上清液放置在收集管内的离心柱中；离心柱为硅膜吸附柱；
4)质粒DNA的沉淀：12000rpm离心1min，弃掉收集管内的废液，继续装载离心柱；
向离心柱内加入400μL清洗液A，12000rpm离心30s，弃掉滤液；
之后向离心柱内加入580μL清洗液B，12000rpm离心30s，弃掉滤液并重复该步骤4次；
将离心柱放入无菌工作台的1.5ml的无菌EP管内，加入预热后的TE缓冲液100μL，静置1min；
12000rpm离心1min，去掉离心柱，无菌EP管内即得到目的DNA，放入-20℃保存。
其中，在本实施例中，溶液I为25mM Tris-cl与10mM EDTA高压灭菌后加入RNaseA2.5mg/ml得到，其pH为8.0；溶液II为0.2M NaOH与1％SDS；溶液III为5M盐酸胍与4M醋酸钾，其pH为4.8；清洗液A为5M异硫氰酸胍、20mM Tris-cl与浓度为37.5％乙醇的混合液，其pH为6.0；清洗液B为浓度为80％的乙醇；TE缓冲液为10mM Tris·HCl，pH8.0和1mM EDTA，pH8.0。
采用本实施例的方法提取DNA的含量为842μg/mL，A260/A280＝1.83。
实施例3：
一种快速提取高纯度质粒DNA的方法，包括以下步骤：
1)细菌的培养：挑选单一的菌落在液体培养基中进行扩大培养，在38℃下培养14小时，吸取培养后的菌液3.0ml无菌封装在两个1.5ml的离心管中，4℃下11000rpm离心2min，吸干上清液；
2)细菌的裂解：向每个离心管中加入150μL溶液I，充分悬浮细菌沉淀；之后加入200μL溶液II，缓慢翻转数次，使其充分混匀，裂解4min；之后加入250μL溶液III，缓慢翻转数次且温和振荡10s，至形成白色聚合物，室温放置10min；
3)质粒DNA的分离：将步骤2)中得到的溶液在4℃下11000rpm离心15min，之后取上清液放置在收集管内的离心柱中；离心柱为硅膜吸附柱；
4)质粒DNA的沉淀：11000rpm离心1min，弃掉收集管内的废液，继续装载离心柱；
向离心柱内加入400μL清洗液A，11000rpm离心30s，弃掉滤液；
之后向离心柱内加入580μL清洗液B，11000rpm离心30s，弃掉滤液并重复该步骤4次；
将离心柱放入无菌工作台的1.5ml的无菌EP管内，加入预热后的TE缓冲液80μL，静置1min；
11000rpm离心1min，去掉离心柱，无菌EP管内即得到目的DNA，常温干燥保存。
其中，在本实施例中，溶液I为25mM Tris-cl与10mM EDTA高压灭菌后加入RNaseA2.5mg/ml得到，其pH为8.0；溶液II为0.2M NaOH与1％SDS；溶液III为5M盐酸胍与4M醋酸钾，其pH为4.8；清洗液A为5M异硫氰酸胍、20mM Tris-cl与浓度为37.5％乙醇的混合液，其pH为6.0；清洗液B为浓度为70％的乙醇；TE缓冲液为10mM Tris·HCl，pH8.0和1mM EDTA，pH8.0。
采用本实施例的方法提取DNA的含量为909μg/mL，A260/A280＝1.85。
本发明的质粒DNA的提取方法，提取的质粒DNA的纯度高，且在提取过程中不使用有害试剂，可以保证实验安全，另外，在该方法中的收集管内使用硅膜吸附可以吸附裂解后的DNA，便于将后期的杂蛋白和RNA除去，且保证不会有多余的DNA损失。制得的质粒DNA的A260/A280＞1.80，满足常规分子生物学实验的需求。
以上对本发明的三个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
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