mtDNA的提取和建库试剂
阅读说明：本技术 mtDNA的提取和建库试剂 (mtDNA extraction and library construction reagent ) 是由 何怡华 李�杰 孙海瑞 郝晓燕 亦桐 王欣 张思瑶 陈兆艺 杨琪 于 2021-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及基因组DNA富集技术领域,尤其涉及mtDNA的提取和建库试剂。本发明提供的mtDNA提取的试剂中裂解液的组成更合理,以该裂解液处理后的人血样品能够富集得到更多的mtDNA。且该mtDNA能够提高测序文库的建库效率,经检测测序效果良好。(The invention relates to the technical field of genomic DNA enrichment, in particular to a mtDNA extraction and library building reagent. The composition of the lysis solution in the mtDNA extraction reagent provided by the invention is more reasonable, and a human blood sample treated by the lysis solution can be enriched to obtain more mtDNA. And the mtDNA can improve the library building efficiency of a sequencing library, and has a good sequencing effect through detection.)
技术领域
本发明涉及基因组DNA富集技术领域，尤其涉及mtDNA的提取和建库试剂。
背景技术
线粒体DNA(mtDNA)是线粒体中的遗传物质，线粒体基因组是裸露的DNA双链分子，主要呈环状但也有线性的分子。各个物种的线粒体基因组大小不一。一般而言，动物细胞中的线粒体基因组较小，为10～39kb。
mtDNA的遗传过程严格遵守单性母性遗传方式，与核基因组相比，线粒体基因组有如下性质：所有的基因都位于一个单一的环状DNA分子上。遗传物质不为核膜所包被。DNA不为蛋白质所压缩。基因组没有包含那么多非编码区域(调控区域或“内含子”)。一些密码子与通用密码子不同。相反，与一些紫色非硫细菌相似。一些碱基为两个不同基因的一部分(重叠基因)：某碱基作为一个基因的末尾，同时作为下一个基因的开始。线粒体DNA比DNA存活时间长得多，而且遗传自母亲，因此用来确认家庭关系十分理想。
mtDNA已经被广泛应用与动物群体遗传学和进化生物学的研究，并取得了许多有意义的结果。而对mtDNA进行研究过程中，有效的提取方法无疑是开展研究的前提，进一步的测序过程中建库也是必不可少的步骤。为了获得更准确的研究结果，对mtDNA的提取和建库方法的优化具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供mtDNA的提取和建库试剂。
本发明提供的mtDNA提取试剂盒，其包括裂解液和提取试剂；所述裂解液包括水和钠盐、镁盐、Tris-HCl和表面活性剂。
本发明中，所述表面活性剂选自IGEPAL-CA630。
本发明中，所述钠盐为NaCl。所述镁盐为MgCl2。
一些实施例中，所述裂解液包括水和130～150mM NaCl、8～12mM Tris-HCl、1～10mM MgCl2、0.1～1％IGEPAL-CA630。
一些具体实施例中，所述裂解液由水和如下组分组成：140mM NaCl、10mM Tris-HCl、5mM MgCl2、0.6％IGEPAL-CA630。
本发明中，所述提取试剂包括：蛋白酶和纯化试剂。
所述纯化试剂中包括硅胶柱或者磁珠。
本发明还提供了一种mtDNA的提取方法，其包括：以所述的试剂盒对样品进行提取。
本发明中，所述提取物方法中的样品为全血。优选的为人类的全血。
本发明所述的提取方法具体包括：将全血与裂解液混合，0～4℃裂解20～40min后，经离心取上清；上清液经蛋白酶解后经柱纯化，获得mtDNA。一些实施例中，所述裂解的时间为30min。所述全血与裂解液的体积比为1:2。
本发明还提供了一种mtDNA的建库试剂，其包括：2×TD缓冲液、转座酶、2‰SDS溶液、Q5 High-Fidelity DNAPolymerase、Ultra II Q5 Master Mix；
所述缓冲液包括水和10mM Tris-Cl、5mM MgCl2和10wt％N,N-Dimethylformamide。
本发明还提供了一种mtDNA的建库方法，其将由本发明所述提取方法制备获得的mtDNA，85℃孵育后，以所述的建库试剂进行建库。本发明中，所述孵育的温度为70～85℃，但当孵育温度为85℃时，可显著提高建库效率。所述孵育的时间为1～10min，优选为5min。孵育后，于55℃保存。
本发明中，所述建库具体包括：将1ng所述mtDNA、10μl2×TD缓冲液、0.05μLTn5转座酶混合，以水补足20μL，55℃孵育10min；
加入2μl2wt‰SDS，70℃孵育20min；
加入0.5μl Q5 High-Fidelity DNA Polymerase和25μlUltra II Q5 MasterMix、2μl引物后，进行扩增后，经磁珠纯化后，获得测序文库。
本发明所述建库方法中，所述扩增程序包括：72℃3分钟循环1次；98℃30秒，65℃75秒循环20次。所述引物的序列为
5′-AATGATACGGCGACCACCGA-3′和
5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3。
本发明提供的建库方法建立的文库可直接上机测序。
本发明提供了mtDNA提取的试剂，其中裂解液的组成更合理，以该裂解液处理后的人血样品能够富集得到更多的mtDNA。且该mtDNA能够提高测序文库的建库效率，经检测测序效果良好。
附图说明
图1示该裂解液提取获得mtDNA的富集建库效果；
图2示孵育温度对mtDNA富集建库效果的影响。
具体实施方式
本发明提供了mtDNA的提取和建库试剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，mtDNA提取试剂盒来自Magen，货号为D3018-03。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
向100μl全血中加入200μl裂解液[140mM NaCl(Invitrogen,Cat.No.AM9759),10mM Tris-HCl(amresco,Cat.No.E199-500 mL),5mM MgCl(Invitrogen,Cat.No.AM9530G),0.6％IGEPAL-CA630(MP,Cat.No.19856)],用枪轻轻吹打或者上下颠倒5次后，4℃或者冰上静置30分钟。3000g离心10分钟，用枪小心的取150ul上清(避免扰动底部的细胞核沉淀)。用商业试剂盒(Magen,Cat.No.D3018-03)提取上清中的DNA(mtDNA的富集效果如图1，该裂解液的效果优于在其他条件下裂解后的富集mtDNA效果。)。
建库前，DNA在85℃孵育5分钟有助于提高mtDNA建库效率。保存在55℃直到下一步(不同孵育温度获得的mtDNA样品的建库效果如图2)。
取1ng上述DNA建库。反应体系包括10ul2xTD缓冲液[10mM Tris-Cl(pH 7.6),5mMMgCl2,10％N,N-Dimethylformamide]，0.05μL Tn5转座酶(Vazyme,Cat.No.TD501-01)，补水至20ul。55℃孵育10min后添加2ul2‰SDS，70℃孵育20min。加入0.5ul Q5 High-Fidelity DNAPolymerase(NEB,Cat.No.M0491L)和25ulUltra II Q5 Master Mix(NEB,Cat.No.M0544 L)以及2ul相应的引物(单条引物浓度为5uM)进行如下程序的扩增：72℃3分钟循环1次；98℃30秒，65℃75秒循环20次。经过磁珠纯化即可测序。
引物序列为：
5′-aatgatacggcgaccaccga-3′；5′-caagcagaagacggcatacga-3′。
测序结果表明，mtDNA含量(30％以上)显著高于未经富集的mtDNA理论含量(1‰-1％)，仅需50Mbp测序量即可获得平均1000x的线粒体基因组覆盖度。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。