肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法
阅读说明：本技术 肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法 (Method for constructing amyotrophic lateral sclerosis cell model cell strain ) 是由 张晗 李田忠 谢中建 于 2021-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法,包括以下步骤：构建核心质粒：从含有目的基因的载体上扩增目的基因片段,酶切目的基因片段和质粒载体,将酶切后的目的基因片段和质粒载体连接,获得核心质粒；制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株：将核心质粒导入293T细胞以使目的基因在293T细胞中表达,获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株；所述目的基因为SOD1、TDP-43、FUS和C9orf72中的任一种。本发明肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法能够构建长期稳定的ALS疾病细胞模型。(The invention provides a method for constructing a cell strain of a amyotrophic lateral sclerosis cell model, which comprises the following steps: constructing a core plasmid: amplifying a target gene fragment from a vector containing a target gene, carrying out enzyme digestion on the target gene fragment and a plasmid vector, and connecting the enzyme digested target gene fragment with the plasmid vector to obtain a core plasmid; preparing a model cell strain of amyotrophic lateral sclerosis cells: introducing the core plasmid into 293T cells to enable target genes to be expressed in the 293T cells, and obtaining a model cell strain of amyotrophic lateral sclerosis cells; the target gene is any one of SOD1, TDP-43, FUS and C9orf 72. The construction method of the ALS cell model cell strain can be used for constructing a long-term stable ALS disease cell model.)
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，具体涉及一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法。
背景技术
肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)，在美国被称为卢伽雷(Lou Gehrig)症。著名物理学家斯蒂芬·威廉·霍金21岁时罹患此症，在轮椅上生活长达半个世纪。该病极为罕见，人群中发病比例约为十万分之一，发病机制是上下运动神经元损伤导致的肌肉失能。患者晚期因呼吸肌和膈膜损伤导致呼吸衰竭而死亡。遗传分析揭示，约10％表现家族聚集发病，其余为散发病例，且该病好发于45-60岁的中老年人群。细胞水平研究表明，患者运动神经元内神经纤维聚集伴随线粒体功能异常，小胶质细胞被激活并促进星形胶质细胞活化，释放炎性因子和毒素。分子水平研究发现，运动神经元内自由基产生异常导致氧化压力升高，蛋白错误折叠和聚集加速，进而引发内质网应激反应。同时细胞膜上的谷氨酸转运体减少导致胞内的谷氨酸浓度上升，进而引起兴奋毒性。与此同时，细胞大量产生炎性因子，激活Caspase-3引发细胞凋亡。
研究表明，ALS的常见致病基因包括SOD1、TDP-43、FUS和C9orf72等，其中以SOD1(Superoxide Dismutase 1，超氧化物歧化酶)最为常见，是大约20％家族性ALS的致病基因。该基因编码一种超氧化物歧化酶，在神经元和胶质细胞中均广泛表达。现已发现上百种SOD1蛋白的突变体，均可导致SOD1蛋白折叠错误，在胞内产生大量聚集体。类似地，TDP-43、FUS和C9orf72编码的蛋白错误折叠也会导致ALS的发生。
目前美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准上市用于治疗ALS的药物为两种小分子。利鲁唑片(英文名：Riluzole)为苯并噻唑类抗谷氨酸药物，可以通透血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)，抑制脑内神经递质(谷氨酸和天冬氨酸)的释放。依达拉奉(英文名：Radicava，edaravone)属于吡唑啉酮类化合物，可以清除胞内自由基，减轻氧化应激压力。利鲁唑只能延长患者生存周期约3个月，依达拉奉也只能改善患者的生活质量，无法根治此病。因此，有必要构建合适的ALS的细胞模型，模拟体内ALS的发病机制和运动神经元内SOD1存在和分布状态，为新药研发提供帮助。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，本发明还提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法制备的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株，以解决现有肌萎缩侧索硬化细胞模型建模困难、影响因素繁多、造模效果差、成本高以及操作复杂等问题。
第一方面，本发明提供了一种肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法，包括以下步骤：
构建核心质粒：从含有目的基因的载体上扩增目的基因片段，酶切目的基因片段和质粒载体，将酶切后的目的基因片段和质粒载体连接，获得核心质粒；
制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株：将核心质粒导入293T细胞以使目的基因在293T细胞中表达，获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株；
所述目的基因为SOD1、TDP-43、FUS和C9orf72中的任一种。
肌萎缩侧索硬化(ALS)的致病原理在于基因表达错误，具体基因类型有SOD1、TDP-43、FUS和C9orf72等。本发明肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法通过构建表达错误基因的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株，用于后续研究肌萎缩侧索硬化发病过程中错误表达蛋白的表达变化以及在细胞水平上筛选用于治疗肌萎缩侧索硬化病的的候选药物。本发明肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法包括两步，首先是构建含有目的基因片段的核心质粒，其次将该核心质粒导入293T细胞以使目的基因在293T细胞中表达，由此获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株。本发明肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法能够构建长期稳定的ALS疾病细胞模型，可以反映多数家族遗传型ALS的发病机制，示踪SOD1蛋白在细胞内的表达和分布情况，还能用于筛选潜在的ALS疾病治疗药物。
优选的，所述核心质粒为慢病毒核心质粒，构建慢病毒核心质粒的具体步骤为：将酶切后的目的基因片段和慢病毒核心质粒载体连接后通过受体扩增，获得慢病毒核心质粒。
优选的，所述目的基因为SOD1，所述慢病毒核心质粒载体含有EGFP表达序列。
优选的，在制备肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株步骤中，取慢病毒核心质粒、pSPAX2包装质粒和pMD2.G病毒包装质粒混合于转染培养基中，将含有慢病毒核心质粒、pSPAX2包装质粒和pMD2.G病毒包装质粒的转染培养基逐滴加入到293T感受态细胞培养液中并孵育，收集含有慢病毒的上清，再将含有慢病毒的上清与293T细胞孵育，获得肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株。
优选的，所述慢病毒核心质粒、pSPAX2包装质粒和pMD2.G病毒包装质粒的质量之比为3:2:1。
优选的，所述293T感受态细胞培养液采用以下方法制备：
将处于对数生长期的293T细胞用0.25％胰酶37℃消化30～300s后，然用完全培养基收集293T细胞，培养至细胞汇合度为60％～90％，再将293T细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育至细胞贴壁完全后，去除原有培养基并加入Opti-MEM培养基，获得293T感受态细胞培养液。
优选的，所述肌萎缩侧索硬化细胞模型的构建方法还包括抗生素筛选稳定株的步骤，具体为：
将肌萎缩侧索硬化细胞模型的培养基去除并添加含有嘌呤霉素的DMEM完全培养基，继续培养1～3周后的培养物为293T稳定株。
优选的，所述含有嘌呤霉素的DMEM完全培养基中嘌呤霉素的浓度为1～10μg/mL。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
为更清楚地阐述本发明的内容，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。
图1为实施例1提供的PCR产物电泳图；
图2为实施例1提供的酶切产物电泳图；
图3为实施例1提供的酶切产物电泳图；
图4为效果实施例中SOD1蛋白突变体和EGFP荧光蛋白的融合蛋白表达图；
图5为效果实施例中肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的荧光显微镜图；
图6为效果实施例中肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的流式细胞仪结果；
图7为效果实施例中肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的Western Blot结果。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株的构建方法的具体步骤以及制备出的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株，如下通过具体实施方式说明。
实施例1
第一步，293T细胞的培养和传代，为后续实验准备293T细胞。
细胞贴壁培养在含有10％胎牛血清和青霉素-链霉素的DMEM培养基中，每天更换培养基，每2-3天细胞传代一次，每次传代比例为1:3。
第二步，构建慢病毒核心质粒。
2.1PCR从含有SOD1(G93A)蛋白突变体的载体上扩增编码DNA序列，具体为：
采用Taq酶扩增，反应体系20μL，其中含有载体模板0.5μL，正反向引物(浓度20μM)各0.5μL，Taq酶0.5μL，10X缓冲液2μL。PCR扩增程序如下：共计35个循环，每个循环包括95度变性30s，56度退火30s，72度延伸1min。
引物序列如下：
正向引物(含有Nhe I酶切位点)：
5’-actGCTAGCCACCATGGCGACGAAGGCCGTGTGC-3’
反向引物(含有BamH I酶切位点)：
5’-actGGATCCGCTTGGGCGATCCCAATTACACC-3’
2.2电泳鉴定PCR产物：
PCR产物中加入DNA上样缓冲液，然后上样至1％琼脂糖凝胶，120V恒压电泳约20min，紫外透射仪成像并分析。参见附图1，M为DL 2000DNA分子量标准；1为SOD1-G93A扩增条带；2为以H2O为模板扩增产物(无条带)。由此可见，SOD1-G93A扩增条带的大小约为500bp大小，表明该SOD1-G93A片段已经被成功扩增。
PCR产物
2.3柱回收PCR扩增条带：
本操作使用艾科瑞生物公司的PCR产物回收试剂盒(货号AG21003)，具体操作流程如下：
取50μL上述PCR反应液，和150μL的Buffer BS-3上下颠倒混匀。将上述溶液转移至PCR DNA Mini column中，室温静置1min后，室温下12,000rpm离心1分钟，弃滤液。向Minicolumn中加入750μL的Buffer WB，室温12,000rpm离心1分钟，弃滤液。重复此步骤一次。将Mini column安置于新的2ml Collection Tube上，室温12,000rpm离心2分钟。将Minicolumn安置于新的1.5ml的离心管上，在Mini column膜的中央处加入50μL灭菌水，室温静置1分钟。室温12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。
2.4酶切PCR产物和核心质粒并纯化：
使用NEB公司的NheI和BamHI限制性内切酶处理PCR产物。配制50μL反应体系，其中含有Cut Smart Buffer 5μL，两种内切酶各0.5μL，PCR产物40μL。37度酶切反应4h。同时慢病毒核心质粒也使用同样的内切酶处理，反应体系同上，将上述PCR产物40μL替换为核心质粒5μg。同样37度酶切反应4h。酶切产物电泳鉴定，过程如2.2。参见附图2，M：DL 8000DNA分子量标准。1，慢病毒核心质粒酶切(BamHI+NheI)后产物；2，慢病毒核心质粒酶切前电泳。电泳结果显示，慢病毒核心质粒已经被内切酶切割完全，可用于后续连接实验。上述酶切反应完成后，采用艾科瑞生物公司的PCR产物回收试剂盒(货号AG21003)回收产物，具体操作流程同2.3。
2.5PCR产物和核心质粒连接：
使用NEB公司的T4连接酶，反应体系10μL:其中含有Ligation Buffer 1μL，2.4中获得的PCR产物6μL，核心质粒2μL，T4连接酶1μL。连接反应室温1h。
2.6转化Stbl3感受态大肠杆菌：
取100μLStbl3感受态细菌悬液，室温融化后，将2.5中连接产物全部加入悬液，混匀后冰上静置30min。42度水浴热击90s，然后冰上冷却2min。向其中加入1mL预热到37度的LB培养基，混匀后，37度摇床培养1h。取出100μL细菌悬液，涂布在氨苄青霉素抗性的LB-琼脂糖平板上，37度培养过夜。
2.7单克隆质粒的抽提：
2.6中的LB-琼脂糖平板培养约18h后取出，从中挑取单克隆，在含有50μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基中培养约16h。所得菌液抽提质粒，采用艾科瑞生物公司的质粒小量提取试剂盒(货号AG21001)。具体操作流程如下：
菌液12000rpm室温下离心2分钟，弃上清。向离心管中加入250μL的Buffer RS(含RNase A)充分悬浮菌体沉淀，直至悬浮液中没有菌块残留。向上述悬浮液中加入250μL的Buffer LS，轻柔上下颠倒混匀6～8次，溶液变透明，此时溶液比较粘稠。此步骤不宜超过5分钟。加入350μL预冷的Buffer BS，此时溶液中出现白色团状物。轻柔上下颠倒混匀6～8次。静置2分钟，室温下12,000rpm离心10分钟，取上清。
将上述溶液转移至Plasmid DNA Mini Column中，室温静置1min后，室温下12,000rpm离心1分钟，弃滤液。向Mini Column中加入500μL的Buffer WA，室温下12,000rpm离心1分钟，弃滤液。向Mini Column中加入750μL的Buffer WB，室温下12,000rpm离心1分钟，弃滤液。并重复该步骤一次。将Mini Column安置于新的2mL Collection tube上，室温12,000rpm离心2分钟。将Mini Column安置于新的1.5mL的离心管上，向Mini Column膜的中央处加入50μL的去离子水，室温放置1分钟。室温12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
2.8单克隆质粒的酶切验证和测序：
采用BamHI和NheI双酶切验证，限制性内切酶均购自NEB公司。具体操作流程如下：
配制20μL酶切反应体系，其中包含Cut Smart Buffer 2μL，质粒7μL,两种内切酶各0.5μL，ddH2O 10μL。酶切在37度进行约2h。酶切产物上样至1％的琼脂糖凝胶中，120V恒压电泳约20min。然后置于紫外投射分析仪上，观察电泳结果并成像。参见附图3，酶切验证慢病毒核心质粒(pCDH-SOD1-G93A-EGFP)，其中M为DL 8000DNA分子量标准；1-4为挑取的4个单克隆抽提质粒后双酶切(BamHI+NheI)产物电泳结果。5为阴性对照，以H2O为模板酶切产物。结果表明，所挑取的4个重组慢病毒核心质粒均含有融合蛋白编码序列，均为阳性质粒，可进行后续测序确认。
同时取10μL单克隆质粒送测序公司采用Sanger法测序。测序引物为：
CMV-F:5’CgCAAATgggCggTAggCgTg 3’
EGFP-R:5’ACACgACATCACTTTCCCAg 3’
测序结果正确，无突变。质粒保存在-20度备用。
第三步，慢病毒的包装和感染
3.1细胞接种：
处于对数生长期的293T细胞，PBS清洗一遍，除去PBS。加入0.25％胰酶37度消化约1分钟，然后用完全培养基收集细胞，平铺细胞于六孔板的一个孔内，使细胞汇合度约为80％(即贴壁后所占面积达到培养皿总面积的80％)。将细胞置于含5％CO2的37℃温箱中孵育12小时,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前用1.5ml Opti-MEM培养基置换旧的培养基。
3.2细胞转染：
本方案中采用脂质体作为转染试剂，具体操作流程如下：
取2个无菌1.5ml EP管，分别加入250μl Opti-MEM培养基。其中一管加入5μL的Lipofectamine 2000，另一管中三种质粒，分别为1.5μg核心质粒(Pcdh-SOD1-G93A-EGFP)，1μg的包装质粒pSPAX2和0.5μg病毒包装质粒pMD2.G，两管均充分混匀，静置5min。然后将两管内液体吹打混匀，继续室温静置20min。将约500μl的混合液逐滴加入上述293T细胞的上清中，轻轻前后左右晃动培养板，以混合均匀。然后置于含5％CO2的37℃培养箱孵育约12h。
3.3收集慢病毒上清：
培养箱孵育后，加入2ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，24h后收集第一批含慢病毒的上清，保存在4度。然后同样加入2ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放置温箱孵育，48h后收集第二批含慢病毒的上清。将两次收集到的上清合并，总体积为4mL，向其中加入终浓度为10μg/mL的polybrene，备用。
3.4.病毒感染
将293T细胞平铺于6孔板中，使得细胞汇合度约为50-60％。吸取旧的培养基，然后向每孔加入2mL的2.3中的病毒上清，充分混匀后置于37℃温箱继续孵育约48h，得到一种基于SOD1的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株，该细胞株能够表达SOD1蛋白突变体。
第四步，细胞冻存
将肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株传代后获得的细胞悬液，250g室温离心3min后弃去上清，加入细胞冻存液(70％DMEM培养基+20％胎牛血清+10％DMSO)，重悬后，梯度降温至-80度(降温速度不超过1度/min)，然后转移至液氮中长期贮存。
实施例2
实施例2与实施例1不同之处在于：还包括抗生素筛选稳定株的步骤，具体为：将培养基换成含有4μg/mL嘌呤霉素的DMEM完全培养基(其中含有10％的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素)，继续培养约2周，其中每两天更换培养液一次。获得的培养物为293T稳定株。
效果实施例
第一，细胞表达SOD1蛋白突变体的检测
本方案使用荧光显微镜观察绿色荧光分布：将实施例1中的肌萎缩侧索硬化细胞模型细胞株置于倒置荧光显微镜载物台上，调整物镜为20X，目镜为10X，滤光片切换为GFP通道，曝光时间设置为300ms，增益设置为1.0。
选取不同视野，拍摄荧光图片。附图4上含有绿色荧光的细胞表明病毒已经感染293T细胞，SOD1蛋白突变体和EGFP荧光蛋白的融合蛋白已经表达。如图4a和4b所示，293T细胞被慢病毒感染48h后的荧光显微照片，左侧为明场图像，右侧为EGFP荧光通道下细胞成像结果。结果表明，大多数细胞都已经被慢病毒感染，并表达EGFP荧光，融合蛋白已经成功表达。
第二，荧光显微镜观察绿色荧光分布
将实施例2中嘌呤霉素处理约2周后的细胞置于倒置荧光显微镜载物台上，调整物镜为20X，目镜为10X，滤光片切换为GFP通道，曝光时间设置为300ms，增益设置为1.0。选取不同视野，拍摄荧光图片，定性分析EGFP阳性细胞比例。参见附图5，感染慢病毒的293T被嘌呤霉素抗性筛选2周后的荧光显微照片，左侧5a为明场图像，右侧5b为EGFP荧光通道下细胞成像结果。结果表明，未达标融合蛋白的细胞已经被抗生素筛选杀死，存活的耐药细胞均表达融合蛋白。
第三，流式细胞仪确定细胞株的筛选效率
筛选效率定义为EGFP阳性细胞占总活细胞的比例。将实施例2中嘌呤霉素处理约2周后的细胞用PBS清洗2遍，吸取PBS。加入1mL的0.25％胰酶，37度培养箱静置1min，然后加入3mL完全培养基，吹打细胞混匀。取500μL细胞悬液，250g离心3min，弃去上清。加入500μL的PBS，重悬细胞，用BD FACSelleta流式细胞仪分析。各通道电压设置如下：FSC-A:500,SSC-A:250,FITC：300。
在FSC-SSC二维散点图上圈出活细胞亚群P1，然后通过和未感染的293T细胞相比，设定EGFP阳性细胞门(P2)，确定阳性细胞百分比。参见附图6，感染慢病毒的293T被嘌呤霉素抗性筛选2周后的流式细胞分析结果。左侧6a为未感染慢病毒的293T细胞中EGFP阳性亚群比例，右侧6b为感染慢病毒后抗性筛选2周后的稳定株EGFP阳性亚群比例。结果显示，抗性筛选后的细胞内，表达EGFP荧光和融合蛋白的比例高达97％。这些细胞可以认为是融合蛋白的稳定株。
第四，Western Blot确认稳定株中SOD1蛋白突变体的表达
取200μL 5.2中所述的细胞悬液，用血球计数板计算密度，取1X106个细胞，250g离心3min，弃去上清。同样取1X106个未感染慢病毒的293T细胞，相同处理。向两种细胞中分别加入100μL的RIPA裂解液，吹打混匀，冰上孵育30min。然后15000rpm在台式离心机内离心20min，小心吸取上清，加入蛋白上样缓冲液，96度加热10min，然后冷却到室温。
两种细胞分别取20uL蛋白样品上样，10％SDS-PAGE胶电泳，90V恒压电泳约2h。取出PAGE胶后将蛋白转印到0.2μm的PVDF膜上，然后用5％的牛奶室温封闭约1h。膜裁剪后分别与抗SOD1,EGFP和GAPDH的兔源一抗(稀释比例为1：1000，稀释于TBST缓冲液中)4度孵育过夜。
次日取出膜，用TBST洗3遍，每次摇晃约10min。然后加入HRP偶联的抗兔二抗(1：5000稀释于TBST缓冲液中)，室温摇晃孵育2h。然后取出膜，用TBST洗3遍，每次摇晃约10min。最后用化学发光法显影，观察条带的亮度，确认SOD1蛋白突变体在稳定株细胞中已经表达。参见附图7，WT:未感染慢病毒的293T细胞，TR：感染慢病毒的293T被嘌呤霉素抗性筛选2周后的293T细胞。分别检测内源性和融合蛋白形式的SOD1蛋白表达情况。GAPDH：内参蛋白。结果显示：该细胞稳定株高表达SOD1融合蛋白和EGFP，而未转染慢病毒的细胞不表达SOD1和EGFP。细胞株已经构建成功。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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