一种富含黄精多糖及多种活性成分的黄精提取物制备方法
阅读说明：本技术 一种富含黄精多糖及多种活性成分的黄精提取物制备方法 (Preparation method of polygonatum sibiricum extract rich in polygonatum sibiricum polysaccharide and various active ingredients ) 是由 刘常青 宋力飞 黄伟明 刘乡乡 于 2021-06-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种富含黄精多糖及多种活性成分的黄精提取物制备方法,包括如下步骤：富含黄精多糖及多种活性成分的黄精提取物制备方法,包括如下步骤：(1)酶解；(2)低温瞬提：将步骤(1)得到的黄精酶解液加水混匀后,采用高效高压差低温连续式提取设备在提取压力20-40MPa,提取温度20-30,℃提取速率5-60L/min的条件下提取1-3次,得黄精提取液；(3)分离精制：将步骤(2)得到的黄精提取液经离心、微滤后得微滤清液；(4)浓缩；(5)除菌过滤；即得黄精提取物。本发明以水为提取媒介,采用连续式高压低温瞬提方式,使得黄精多糖、黄精皂苷和黄酮等主要成分有较高的提取率。(The invention provides a preparation method of a polygonatum sibiricum extract rich in polygonatum sibiricum polysaccharide and various active ingredients, which comprises the following steps: the preparation method of the polygonatum extract rich in polygonatum polysaccharide and various active ingredients comprises the following steps: (1) carrying out enzymolysis; (2) low-temperature instantaneous extraction: adding water into the rhizoma polygonati enzymatic hydrolysate obtained in the step (1), uniformly mixing, and extracting for 1-3 times by adopting high-efficiency high-pressure-difference low-temperature continuous extraction equipment under the conditions that the extraction pressure is 20-40MPa, the extraction temperature is 20-30, and the extraction rate at DEG C is 5-60L/min to obtain a rhizoma polygonati extracting solution; (3) separation and refining: centrifuging and microfiltering the sealwort extracting solution obtained in the step (2) to obtain a microfiltered clear solution; (4) concentrating; (5) sterilizing and filtering; to obtain the sealwort extract. The invention takes water as an extraction medium, and adopts a continuous high-pressure low-temperature instant extraction mode, so that the extraction rate of the main components such as polygonatum polysaccharide, polygonatum saponin, flavone and the like is higher.)
技术领域
本发明涉及中药提取技术领域，尤其涉及一种富含黄精多糖及多种活性成分的黄精提取物制备方法。
背景技术
黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricum Red.或多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根茎。按形状不同，习称“大黄精”、“鸡头黄精”、“姜形黄精”。《中国药典》2020版记载，黄精有补气养阴，健脾，润肺，益肾等功效，用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴。
黄精含有多糖、皂苷、三萜、生物碱、木脂素、黄酮、植物甾醇及挥发油等多种化学成分，其中多糖和皂苷类成分在黄精中量较大，为其主要药效成分。据相关文献报道，黄精多糖是黄精主要的生物学活性成分之一，具有增强免疫功能、抗肿瘤、抗辐射等多种生物学活性。黄精中含有的中性皂苷为甾体皂苷，皂苷类成分主要有薯蓣皂苷元、毛地黄糖苷和菝葜皂苷元。现代药理研究表明，甾体皂苷具有调节血糖、防治心脑血管疾病、抗肿瘤、改善学习记忆等多种药理活性。另外，黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、防衰老、抗菌消炎、防动脉粥样硬化以及保护心脑血管等功能。
黄精在2002年被列入卫健委公布的既是食品又是药品的中药名单上，在大健康产业急速发展的背景下，黄精提取物在功能性食品的开发应用将得到广泛应用。
目前，市面上含有黄精的功能性食品中，大多将黄精原材直接粉碎添加，使得黄精的有效利用率大大降低。黄精提取方法大部分只针对黄精多糖、黄精皂苷等其中的某一个单一成分，未综合考虑其他功能性成分。目前针对黄精多糖、黄精皂苷等黄精主要生物学活性成分的提取，大多采用热水提取法或超声波提取法等提取方式，具有生产周期较长、能耗较高等局限性，且热提温度较高，容易改变黄精的风味和其中的天然活性成分。现有的提取工艺较为繁杂，耗时较长，生产成本较高。另外，黄精在功能性食品应用中大多直接粉碎添加，有效利用率较低。
因此，急需开发一种耗时短、提取效率高、富含黄精多糖、总皂苷和黄酮等功能性成分的黄精提取物制备方法。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种富含黄精多糖及多种活性成分的黄精提取物制备方法，目的是实现黄精的低温高效提取，且提取物中富含黄精多糖、总皂苷和黄酮等功能性成分。
基于上述目的，本发明提供了一种富含黄精多糖及多种活性成分的黄精提取物制备方法，包括如下步骤：
(1)酶解：将干黄精粉碎得黄精细碎料，加入黄精细碎料4-6倍量的纯化水和黄精细碎料重量0.5-1％的复合酶，先加热至25-35℃酶解0.5-1h，之后加热至40-55℃酶解0.5-1h；
(2)低温瞬提：将步骤(1)得到的黄精酶解液加水混匀后，采用高效高压差低温连续式提取设备在提取压力20-40MPa，提取温度20-30℃，提取速率5-60L/min的条件下提取1-3次，得黄精提取液；
(3)分离精制：将步骤(2)得到的黄精提取液经离心、微滤后得微滤清液；
(4)浓缩；
(5)除菌过滤；即得黄精提取物。
所述复合酶包括纤维素酶和淀粉酶，纤维素酶与淀粉酶的重量比为2-3:1。
所述步骤(2)中加水量为黄精原材投料量的20-40倍。此合理倍量水的添加，便于黄精原料的充分浸润的同时，调节合适的混合比，便于高压差低温连续式提取设备更好的进料提取，有效保证提取效率。
所述步骤(3)中离心的转速为5000-8000r/min，微滤是采用300-600nm孔径陶瓷膜过滤器微滤，微滤的温度≤25℃，微滤压力为0.15-0.28MPa，微滤清液滤速：1.5-20L/min。采用此条件下的陶瓷膜过滤器微滤，能够实现更好的精制效果，并且能够有效除去部分不需要的杂质成分，有一定的提高黄精风味的效果。
所述浓缩采用反渗透浓缩，所述反渗透浓缩的温度≤25℃，浓缩压力为0.5-2.0MPa。采用此浓缩方式，能够实现最终黄精浓缩液达到9-12Bé，浓缩方式简单高效。
所述除菌过滤是将步骤(4)得到的黄精浓缩液经100-200nm孔径陶瓷膜微滤除菌，微滤温度≤25℃，微滤压力为0.15-0.5MPa。采用此种微滤除菌的方式，避免了传统高温杀菌对黄精风味的破坏，进一步除去部分不需要的杂质成分，保证提取物的纯度。
所述除菌过滤是将步骤(4)得到的黄精浓缩液进行板框过滤除菌。优选使用0.22μm孔径PES聚醚砜微孔滤膜。
所述步骤(1)中干黄精粉碎前还包括除杂、清洗的方法是将黄精原材中霉变、虫变的部位挑拣除去，用提取用水清洗除去黄精原材表面杂质。
所述制备方法还包括对步骤(5)除菌过滤后的黄精提取物进行干燥的步骤，所述干燥采用真空干燥，真空干燥温度≤65℃，真空度<-0.07Mpa。有效保证黄精提取物的干燥，提高干燥效率。
所述高效高压差低温连续式提取设备采用广州泽力医药科技有限公司专利提取设备(ZL200920304058.X)，提取压力20-60Mpa，提取温度不高于35℃。其过程便捷高效、能耗低、有效成分保留度高。
本发明的有益效果：
1、本发明以水为提取媒介，采用连续式高压低温瞬提方式，使得黄精多糖、黄精皂苷和黄酮等主要成分有较高的提取率，同时克服工序繁杂、生产周期长和能耗高等问题，具备连续高效生产可行性。
2、本发明通过酶解、低温瞬提、分离精制、浓缩、除菌过滤、干燥等组合工序，合理布局黄精提取物的提取过程，能够有效提取黄精的多糖、皂苷和黄酮等主要活性成分，提取效果较好，对黄精提取物的连续化生产具有重要指导意义。
3、本发明制备黄精提取物的工艺中，除酶解、浓缩和干燥工序外，其余工序温度均控制在30℃以内，有效提取黄精多糖、黄精皂苷和黄酮等主要成分，并最大限度保留了黄精其余天然活性成分，提高黄精有效利用率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1测定多糖的标准曲线图；
图2为本发明实施例1测定皂苷的标准曲线图；
图3为本发明实施例1测定黄酮的标准曲线图；
图4为本发明实施例1所得黄精原材与提取物薄层色谱对比图。
其中图4编号1、2色谱带分别为实施例1工序中的离心渣、微滤截留液，编号3色谱带为实施例1中黄精提取物，编号4色谱带为实施例1中用于制备黄精提取物原料。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例1
将黄精原材中霉变、虫变等部位挑拣除去，取8kg黄精原材清洗干净后，用直线往复式切药机将黄精原材切至小片，黄精片材烘干后，通过粉碎机粉碎成黄精细碎料，加入黄精细碎料5倍量的纯化水和黄精细碎料重量0.6％的复合酶(纤维素酶和淀粉酶的重量比为2:1)，先加热至30℃酶解1h，之后加热至50℃酶解1h；之后将黄精酶解液补足35倍纯化水搅拌混匀后，用高效高压差低温连续式提取设备进行低温瞬提，提取压力为25MPa，提取速率8L/min，温度为25℃，提取次数为1次；收集提取液进行离心，离心的转速为6000r/min，将离心液进行500nm陶瓷膜微滤(微滤的温度20℃，微滤压力为0.2MPa，微滤清液滤速：2L/min)得清滤液；将清滤液反渗透浓缩(反渗透浓缩的温度20℃，浓缩压力为1.0MPa)得浓缩液，浓缩液经100nm孔径陶瓷膜微滤(微滤温度20℃，微滤压力为0.2MPa)除菌，得黄精提取物(液体)28.86kg。之后将黄精提取物(液体)进行真空干燥(真空干燥温度50℃，真空度为-0.1MPa)，得黄精提取物(固体)。
实施例2
将黄精原材中霉变、虫变等部位挑拣除去，取8kg黄精原材清洗干净后，用直线往复式切药机将黄精原材切至小片，将切片的黄精原材用4倍纯化水过1.2mm筛网进行湿法粉碎(采用高效涡轮式粉碎机粉碎)，得细碎浆，黄精细碎浆补足31倍纯化水搅拌混匀后，用高效高压差低温连续式提取设备进行低温瞬提，提取压力为25MPa，提取速率8L/min，温度为28℃，提取次数为1次；收集提取液进行离心，离心的转速为5000r/min，将离心液进行500nm陶瓷膜微滤(微滤的温度20℃，微滤压力为0.2MPa，微滤清液滤速：2L/min)得清滤液；将清滤液反渗透浓缩(反渗透浓缩的温度20℃，浓缩压力为1.0MPa)得浓缩液，浓缩液经100nm孔径陶瓷膜微滤(微滤温度20℃，微滤压力为0.2MPa)除菌，得黄精提取物(液体)28.04kg。
对比例1
将黄精原材中霉变、虫变等部位挑拣除去，取8kg黄精原材清洗干净后，用直线往复式切药机将黄精原材切至小片，将切片的黄精原材用粉碎机粉碎，得细碎料，加入黄精细碎料5倍量的纯化水和黄精细碎料重量0.6％的复合酶(纤维素酶和淀粉酶的重量比为2:1)，先加热至30℃酶解1h，之后加热至50℃酶解1h；之后将黄精酶解液补足31倍纯化水搅拌混匀后，加热回流提取4h、过滤；将清滤液反渗透浓缩(反渗透浓缩的温度20℃，浓缩压力为1.0MPa)得浓缩液，浓缩液经100nm孔径陶瓷膜微滤(微滤温度20℃，微滤压力为0.2MPa)除菌，得黄精提取物(液体)27.43kg。之后将黄精提取物(液体)进行真空干燥(真空干燥温度50℃，真空度为-0.1MPa)，得黄精提取物(固体)。
对比例2
将黄精原材中霉变、虫变等部位挑拣除去，取8kg黄精原材清洗干净后，用直线往复式切药机将黄精原材切至小片，将切片的黄精原材用粉碎机粉碎，得细碎料，黄精细碎料补足31倍纯化水搅拌混匀后，加热回流提取2h、过滤；将清滤液反渗透浓缩(反渗透浓缩的温度20℃，浓缩压力为1.0MPa)得浓缩液，浓缩液经100nm孔径陶瓷膜微滤(微滤温度20℃，微滤压力为0.2MPa)除菌，得黄精提取物(液体)27.58kg。之后将黄精提取物(液体)进行真空干燥(真空干燥温度50℃，真空度为-0.1MPa)，得黄精提取物(固体)。
对比例3
将黄精原材中霉变、虫变等部位挑拣除去，取8kg黄精原材清洗干净后，用直线往复式切药机将黄精原材切至小片，将切片的黄精原材用粉碎机粉碎，得细碎料，黄精细碎料补足10倍95％乙醇搅拌混匀后，回流提取4h、过滤；将清滤液真空浓缩(真空浓缩的温度40℃，真空度为-0.1MPa)得浓缩液，浓缩液经板框过滤(使用0.22μm孔径PES聚醚砜微孔滤膜)除菌，得黄精提取物(液体)26.16kg。之后将黄精提取物(液体)进行真空干燥(真空干燥温度50℃，真空度为-0.1MPa)，得黄精提取物(固体)。
对比例4
将黄精原材中霉变、虫变等部位挑拣除去，取8kg黄精原材清洗干净后，用直线往复式切药机将黄精原材切至小片，将切片的黄精原材用粉碎机粉碎，得细碎料，加入黄精细碎料5倍量的纯化水和黄精细碎料重量0.6％的复合酶(纤维素酶和淀粉酶的重量比为2:1)，先加热至30℃酶解1h，之后加热至50℃酶解1h；之后将黄精酶解液补足10倍95％乙醇搅拌混匀后，回流提取4h、过滤；将清滤液反渗透浓缩(反渗透浓缩的温度20℃，浓缩压力为1.0MPa)得浓缩液，浓缩液经100nm孔径陶瓷膜微滤(微滤温度20℃，微滤压力为0.2MPa)除菌，得黄精提取物(液体)26.56kg。之后将黄精提取物(液体)进行真空干燥(真空干燥温度50℃，真空度为-0.1MPa)，得黄精提取物(固体)。
对比例5
将黄精原材中霉变、虫变等部位挑拣除去，取8kg黄精原材清洗干净后，用直线往复式切药机将黄精原材切至小片，黄精片材烘干后，通过粉碎机粉碎成黄精细碎料，加入黄精细碎料5倍量的纯化水和黄精细碎料重量0.6％的复合酶(纤维素酶和淀粉酶的重量比为2:1)，先加热至30℃酶解1h，之后加热至50℃酶解1h；之后将黄精酶解液补足35倍纯化水搅拌混匀后，用高效高压差低温连续式提取设备进行低温瞬提，提取压力为25MPa，温度为25℃，提取次数为1次；收集提取液进行离心，离心的转速为6000r/min，将离心液真空浓缩(真空浓缩的温度50℃，真空度为-0.1MPa)得黄精提取物(液体)。
一、黄精多糖测定方法
参照中国药典2020版测定
A.对照品溶液的制备
取经105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品33mg，精密称定，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水葡萄糖0.33mg)。
B.标准曲线的制备
精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml，分别置10ml具塞刻度试管中，各加水至2.0ml，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0.2％蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温10分钟，取出，立即置冰水浴中冷却10分钟，取出，以相应试剂为空白。照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在582nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
C.测定法
取60℃干燥至恒重的本品细粉约0.25g，精密称定，置圆底烧瓶中，加80％乙醇150ml，置水浴中加热回流1小时，趁热滤过，残渣用80％热乙醇洗涤3次，每次10ml，将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150ml，置沸水浴中加热回流1小时，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10ml，合并滤液与洗液，放冷，转移至250ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml具塞干燥试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加水至2.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含无水葡萄糖的重量(mg)，计算，即得。
二、黄精皂苷测定方法
A.标准曲线制备
称取人参皂苷Rbl标准品10.0mg于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为标准液。吸取该标准液60、120、180、240、300、360、420μL，置于具塞刻度试管中，挥尽溶剂，显色，经TU-1900双束光紫外可见分光光度计在200～800nm范围内扫描，结果显示在550nm处吸收峰最大，并于550nm处测定吸光值(A)，以皂苷含量对A值作标准曲线。
B.供试液制备
称取干燥至恒重的黄精粉末1.00g，加入15倍量80％乙醇，60℃超声提取30min，提取2次，合并滤液至50mL容量瓶中，加80％无水乙醇溶解并稀释到刻度，摇匀。在提取工艺研究中，改变相应参数。
C.样品测定
吸取供试液100μL，挥干，加入0.2mL5％香草醛-冰醋酸溶液(现配)，冰浴时加入0.8mL高氯酸，摇匀，60℃水浴加热15min后，冰浴2min，加入5mL冰醋酸，摇匀，静置5min，于550nm波长处测定ABS，再根据标准曲线计算总皂苷含量(mg·g-1)。
三、黄酮测定方法
A.样品制备
精密称取样品2.0000g于具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇25mL，称定重量，超声处理30min，再称定重量，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，即得。
B.标准曲线制备
准确吸取芦丁标准溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00mL分别置于25mL棕色容量瓶中，加水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1mL，使混匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加4.3％氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，用分光光度计在510nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
C.测定
精密量取供试品溶液1mL，置于25mL棕色容量瓶中，加水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1mL，使混匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加4.3％氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应的试剂作空白，在510nm波长测定吸光值。
四、薄层色谱对比
A.黄精原材样品制备
取本品粉末1g，加70％乙醇20ml，加热回流1小时，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
B.黄精提取物(固体)样品制备
取提取物粉末1g，加水10ml使溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
C.黄精提取物(液体)样品制备
取提取物(液体)样品1g，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10ml使溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(5︰2︰0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
通过记录数据分析，得到各实施例和对比例三种有效成分提取率如下：
表1不同提取工艺制备的黄精提取物有效成分提取率对比
由上表对比可知，本发明实施例1中的方法对三种有效成分提取效果最好，实施例2的三种有效成分提取效率略差，但相差不多，对比例1-3有效成分提取时所花费时间相对较多，且三种有效成分提取率相对较低。对比例4和对比例5的方案与实施例1的方案相比，本发明对黄精多糖、黄精皂苷、黄酮等主要有效成分的提取效果明显优于乙醇回流提取方法。而采用本发明的高压差低温连续式提取设备进行低温瞬提后，采用常规的浓缩灭菌处理，虽然得到的产物较多，但是所含杂质成分较多。本发明分离精制工序能有效截留提取物中的悬浮物及胶粒，若仅用普通离心过滤装置处理，黄精提取物(液体)会发生沉淀，黄精提取物(固体)存在溶解不完全等现象，极大限制了黄精提取物后续的产品开发及综合利用。经过最终试验结果验证，通过酶解、低温瞬提、分离精制、浓缩、除菌过滤、干燥等组合工序，合理布局黄精提取物的提取过程，能够有效提取黄精的多糖、皂苷和黄酮等主要活性成分，提取效果较好，对黄精提取物的连续化生产具有重要指导意义。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。