一种西番莲无菌外植体的培育方法
阅读说明：本技术 一种西番莲无菌外植体的培育方法 (Method for cultivating sterile passion flower explants ) 是由 管艳 李玲 刘世红 殷振华 桂明春 粱国平 唐敏 田海 于 2021-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种西番莲无菌外植体的培育方法,涉及植物组培技术领域,包括以下步骤：采集西番莲幼嫩茎段作为外植体,冲洗后采用饱和洗衣粉液浸泡,漂洗,得预处理外植体；采用利福平溶液对预处理外植体进行无菌预培养,得到预培养外植体；将所述预培养外植体剪切成茎段后进行消毒处理,得到无菌茎段；将所述无菌茎段在MS基本培养基中进行培养,获得无菌西番莲外植体。本发明所述的培育方法通过外植体的两次预处理方法,升汞杀菌方法及时间等结合,在降低污染率的同时也降低了因消毒灭菌导致的褐化率和死亡率,从而大大提高了外植体的存活率,降低了组培的生产成本。(The invention provides a method for cultivating a sterile passion flower explant, which relates to the technical field of plant tissue culture and comprises the following steps: collecting tender stem segments of passion flower as explants, soaking the tender stem segments by using saturated laundry powder liquid after washing, and rinsing to obtain pretreated explants; carrying out aseptic pre-culture on the pretreated explant by adopting a rifampicin solution to obtain a pre-cultured explant; shearing the pre-culture explant into stem sections and then carrying out disinfection treatment to obtain sterile stem sections; and culturing the sterile stem section in an MS minimal medium to obtain a sterile passion flower explant. The cultivation method of the invention combines the two pretreatment methods of the explant, the mercuric chloride sterilization method and time, and the like, reduces the pollution rate and the browning rate and the death rate caused by disinfection and sterilization, thereby greatly improving the survival rate of the explant and reducing the production cost of tissue culture.)
技术领域
本发明涉及植物组培技术领域，尤其涉及一种西番莲无菌外植体的培育方法。
背景技术
西番莲(Passifloracaerulea L.)是典型的热带、亚热带浆果类果树，属于西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(Passiflora L.)，是一种多年生常绿藤本植物。西番莲果实具有独特而浓郁的芳香气味，酸甜可口，是著名的果汁用热带水果，有“果汁之王”的美誉。西番莲的组培技术到目前为止还难以推广应用于种苗繁育，其中主要原因之一就是外植体消毒难，尤其是从野外田间采集的外植体，由于表面和内部都携带一定数量的细菌和真菌，尤其是内生菌。目前开展的西番莲组织培养技术的研究以西番莲茎段为外植体，消毒均采用2％次氯酸钠、0.1％～0.2％升汞两种消毒剂，消毒时间为10～20min。结果是升汞的消毒效果明显优于次氯酸钠。所以，现有西番莲外植体消毒灭菌技术中通常选用0.1％～0.2％的升汞进行10～20min的消毒灭菌。但是，其仍存在下述缺点：1.随着消毒剂浓度或消毒时间的增加，污染率呈下降趋势，而死亡率和褐化率呈上升趋势，存活率呈下降趋势。2.内生菌很难根除，随着继代次数的增加，内生菌污染也随之严重。
发明内容
本发明的目的在于提供一种西番莲无菌外植体的培育方法，在降低污染率的同时也降低了因消毒灭菌导致的褐化率和死亡率，大大提高了外植体的存活率，降低了组培的生产成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种西番莲无菌外植体的培育方法，包括以下步骤：
采集西番莲幼嫩茎段作为外植体，冲洗后采用饱和洗衣粉液浸泡，漂洗，得预处理外植体；
采用利福平溶液对预处理外植体进行无菌预培养，得到预培养外植体；
将所述预培养外植体剪切成茎段后进行消毒处理，得到无菌茎段；
将所述无菌茎段在MS基本培养基中进行培养，获得无菌西番莲外植体。
优选的，所述外植体的长度为12～15cm，保留有3～4个腋芽、顶芽及顶芽上端的1～2片叶。
优选的，所述外植体浸泡的时间为10～30min。
优选的，所述漂洗的次数为2～4次。
优选的，所述利福平溶液的浓度为80～120mg/L，外植体浸入利福平溶液中2～3cm。
优选的，所述预培养温度为22～30℃，光照时间为8～12h/d，时间为2～4d。
优选的，所述无菌茎段长为0.8～2.0cm，带有1～2个腋芽。
优选的，无菌茎段消毒处理的具体方式为：采用体积分数为75～90％的酒精消毒处理10～60s，再采用质量浓度为0.05～0.15％的升汞表面消毒10～12min，冲洗3～5次。
优选的，在MS基本培养基中培养8～12d，培养温度为25～28℃，光照强度为1000～2000lux，光照时间为8～12h/d。
优选的，所述每接种一个茎段需要25～30ml MS基本培养基。
本发明提供了一种西番莲无菌外植体的培育方法，大幅度提高了消毒灭菌的效果，表面真、细菌的污染降低到8％以下，内生菌的污染降低到30％左右，同时随着继代增殖的次数增加也不会加剧内生菌的严重。并通过外植体的两次预处理方法，升汞杀菌方法及时间等结合，在降低污染率的同时也降低了因消毒灭菌导致的褐化率和死亡率，从而大大提高了外植体的存活率，降低了组培的生产成本。
具体实施方式
本发明提供了一种西番莲无菌外植体的培育方法，包括以下步骤：
采集西番莲幼嫩茎段作为外植体，冲洗后采用饱和洗衣粉液浸泡，漂洗，得预处理外植体；
采用利福平溶液对预处理外植体进行无菌预培养，得到预培养外植体；
将所述预培养外植体剪切成茎段后进行消毒处理，得到无菌茎段；
将所述无菌茎段在MS基本培养基中进行培养，获得无菌西番莲外植体。
在本发明中，外植体的长度优选为12～15cm，进一步优选为13～14cm，更进一步优选为13.5cm；腋芽保留数量优选为3～4个，进一步优选为3个；顶芽及顶芽上端叶的数量优选为1～2片，进一步优选为1片。
在本发明中，外植体浸泡时间优选为10～30min，进一步优选为15～25min，更进一步优选为20min。
在本发明中，漂洗次数优选为2～4次，进一步优选为2～3次，更进一步优选为3次。
在本发明中，利福平溶液的浓度优选为80～120mg/L，进一步优选为90～110mg/L，更进一步优选为100mg/L；外植体浸入到利福平溶液中长度优选为2～3cm，进一步优选为2.5cm。
在本发明中，预培养温度优选为22～30℃，进一步优选为24～28℃，更进一步优选为25～27℃，再进一步优选为26℃；光照时间优选为8～12h/d，进一步优选为9～11h/d，更进一步优选为10h/d；预培养时间优选为2～4d，进一步优选为3～4d，更进一步优选为3d。
本发明中，所述无菌茎段长优选为0.8～2.0cm，进一步优选为1～1.8cm，更进一步优选为1.5cm；带有的腋芽数量优选为1～2个，进一步优选为1个。
本发明无菌茎段消毒处理步骤中，酒精的体积分数优选为75～90％，进一步优选75％；酒精消毒处理时间优选为10～60s，进一步优选为20～50s，更进一步优选为30s；升汞的质量浓度优选为0.05～0.15％，进一步优选为0.1％；表面消毒时间优选为10～12min，进一步优选为10～11min，更进一步优选为11min；冲洗次数优选为3～5次，进一步优选为4～5次，更进一步优选为4次。
本发明中，MS培养基中培养时间优选为8～12d，进一步优选为9～11d，更进一步优选为10d；培养温度优选为25～28℃，进一步优选为26～27℃，更进一步优选为26℃；光照强度优选为1000～2000lux，进一步优选为1250～1750lux，更进一步优选为1500lux。
本发明中，每接种一个茎段需要MS基本培养基优选为25～30ml，进一步优选为26～29ml，再进一步优选为27ml。
下面结合实施例对本发明提供的西番莲无菌外植体的培育方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
在上午10点采取外植体，选取顶芽及3个腋芽，长约13.5cm，顶芽上端的1片叶的西番莲新抽的嫩茎段作为外植体，用饱和洗衣粉液浸泡外植体20min后，在自来水漂洗干净，再用无菌水漂洗3次。采用浓度为100mg/L的利福平溶液，外植体浸入利福平溶液中2.5cm，在温度为26℃，光照时间为10h/d的条件下，预培养3d，得预培养外植体。将预培养外植体剪切成长为1.5cm，带有1个腋芽的茎段。采用体积分数为75％的酒精对茎段消毒30s，再采用质量浓度为0.1％的升汞表面消毒11min，冲洗4次得无菌茎段。再将每个无菌茎段接种在不添加任何激素的27ml MS基本培养基中，在培养温度26℃，光照强度1500lux，光照时间10h/d的条件下培养10d，获得无菌西番莲外植体。
实施例2
在上午12点采取外植体，选取顶芽及3个腋芽，长约12cm，顶芽上端的1片叶的西番莲新抽的嫩茎段作为外植体，用饱和洗衣粉液浸泡外植体10min后，在自来水漂洗干净，再用无菌水漂洗2次。采用浓度为80mg/L的利福平溶液，外植体浸入利福平溶液中2cm，在温度为22℃，光照时间为8h/d的条件下，预培养2d，得预培养外植体。将预培养外植体剪切成长为0.8cm，带有1个腋芽的茎段。采用体积分数为75％的酒精对茎段消毒10s，再采用质量浓度为0.05％的升汞表面消毒10min，冲洗3次得无菌茎段。再将每个无菌茎段接种在不添加任何激素的25ml MS基本培养基中，在培养温度25℃，光照强度1000lux，光照时间8h/d的条件下培养8d，获得无菌西番莲外植体。
实施例3
在下午16点采取外植体，选取顶芽及4个腋芽，长约15cm，顶芽上端的2片叶的西番莲新抽的嫩茎段作为外植体，用饱和洗衣粉液浸泡外植体30min后，在自来水漂洗干净，再用无菌水漂洗4次。采用浓度为120mg/L的利福平溶液，外植体浸入利福平溶液中3cm，在温度为30℃，光照时间为12h/d的条件下，预培养4d，得预培养外植体。将预培养外植体剪切成长为2.0cm，带有2个腋芽的茎段。采用体积分数为90％的酒精对茎段消毒60s，再采用质量浓度为0.15％的升汞表面消毒12min，冲洗5次得无菌茎段。再将每个无菌茎段接种在不添加任何激素的30ml MS基本培养基中，在培养温度为28℃，光照强度为2000lux，光照时间12h/d的条件下培养12d，获得无菌西番莲外植体。
实施例4
在下午14点采取外植体，选取顶芽及4个腋芽，长约13cm，顶芽上端的1片叶的西番莲新抽的嫩茎段作为外植体，用饱和洗衣粉液浸泡外植体15min后，在自来水漂洗干净，再用无菌水漂洗3次。采用浓度为90mg/L的利福平溶液，外植体浸入利福平溶液中2.2cm，在温度为24℃，光照时间为9h/d的条件下，预培养3d，得预培养外植体。将预培养外植体剪切成长为1.0cm，带有1个腋芽的茎段。采用体积分数为75％的酒精对茎段消毒20s，再采用质量浓度为0.1％的升汞表面消毒11min，冲洗4次得无菌茎段。再将每个无菌茎段接种在不添加任何激素的26ml MS基本培养基中，在培养维度为26℃，光照强度为1250lux，光照时间为9h/d的条件下培养9d，获得无菌西番莲外植体。
实施例5
在下午14点采取外植体，选取顶芽及3个腋芽，长约14cm，顶芽上端的1片叶的西番莲新抽的嫩茎段作为外植体，用饱和洗衣粉液浸泡外植体25min后，在自来水漂洗干净，再用无菌水漂洗3次。采用浓度为110mg/L的利福平溶液，外植体浸入利福平溶液中2.8cm，在温度为28℃，光照时间为11h/d的条件下，预培养3d，得预培养外植体。将预培养外植体剪切成长为1.8cm，带有1个腋芽的茎段。采用体积分数为75％的酒精对茎段消毒50s，再采用质量浓度为0.1％的升汞表面消毒11min，冲洗4次得无菌茎段。再将每个无菌茎段接种在不添加任何激素的27ml MS基本培养基中，在培养温度为27℃，光照强度为1750lux，光照时间为11h/d的条件下培养11d，获得无菌西番莲外植体。
对比例1
采用现有技术常规的西番莲外植体消毒方式，0.1％的升汞消毒处理11min。
对比例2
采用现有技术常规的西番莲外植体消毒方式，2％次氯酸钠消毒处理11min。
表1对比例1、2与实施例1对西番莲外植体消毒的效果比较
实验组
污染率(％)
内源污染率(％)
死亡率(％)
存活率(％)
对比例1
33.33
37.50
0
29.17
对比例2
38.45
53.85
7.7
0
实施例1
8.33
29.17
0
62.5
由以上实施例可知，本发明提供了一种西番莲无菌外植体的培育方法，本申请所述的无菌西番莲外植体的培育方法相比于现有的对比例2所述2％次氯酸钠消毒处理的方式减少了近1/3的污染率，内源污染率缩小一半，死亡率可控制为零，存活率提高到了62.5％；相比于对比例1所述的0.1％的升汞消毒处理的方式，也达到了降低污染率、降低内源污染率，提供近存活率将近一倍的技术效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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