细胞自噬通路激活剂作为egfr tki类药物增敏剂的应用
阅读说明：本技术 细胞自噬通路激活剂作为egfr tki类药物增敏剂的应用 (Application of autophagy pathway activator as EGFR TKI drug sensitizer ) 是由 黄来强 刘昱宏 蒋盛威 木兰 代小勇 冯春燕 刘可为 武光燕 王丽君 于 2021-08-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种细胞自噬通路激活剂作为EGFR TKI类药物增敏剂的应用。将细胞自噬通路激活剂和EGFR TKI类药物联用可以实现对EGFR TKI类药物耐药的非小细胞肺癌细胞的清除,降低药物剂量从而减少靶向药物的毒副作用。(The invention discloses application of a cell autophagy pathway activator as an EGFR TKI medicament sensitizer. The combination of the autophagy pathway activator and the EGFR TKI medicines can remove drug-resistant non-small cell lung cancer cells of the EGFR TKI medicines, and reduce the dosage of the medicines, thereby reducing the toxic and side effects of targeted medicines.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种细胞自噬通路激活剂作为EGFR TKI类药物增敏剂的应用。
背景技术
肺癌是发病于支气管上皮粘膜或肺泡的恶性肿瘤，在中国乃至全球的癌症死亡病例中高居榜首。近年来随着吸烟人群的扩增，肺癌已成为男性中全球发病率和死亡率排名第一，女性中仅次于乳腺癌的排名第二的癌症类型。通过对肺癌组织的形态学与组织学分析，我们将肺癌初步划分为了小细胞肺癌(SCLC)与非小细胞肺癌(NSCLC)。其中NSCLC占据了75％-80％的肺癌病例，主要包括肺腺癌(AD)和肺鳞状细胞癌(SCC)。在现阶段的肺癌的临床治疗中，手术切除仍是首选的治疗手段，其次是根据不同病理组织情况进行化学治疗，放射治疗。外科手术切除适用于癌细胞无远处转移的患者，放疗与化疗对于早期的小细胞肺癌有缓解效果，但根据发病位置以及病人身体状况不同疗效差异显著，且对癌细胞的杀伤没有特异性，会对病人身体造成诸如肝肾损伤等诸多副作用。近年来，随着信息技术与生物技术的不断进步，结合大数据统计下临床治疗的样本与经验，对癌细胞基因层面的基础研究不断完善，肺癌的个性化治疗如靶向治疗与免疫治疗逐渐受到关注。
EGFR的高表达为细胞传递过分增殖的信号，促进癌细胞恶化，但也为NSCLC的治疗提供了新的思路，将EGFR作为NSCLC的生物标志物便是NSCLC治疗研究中的重要发现。基于EGFR的靶向药物与免疫治疗都是NSCLC个性化治疗的研究热点，其中EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的开发便是其中之一。人体内分泌的表皮细胞生长因子(EGF)是EGFR的主要配体，刺激EGFR的激活与下游信号转导。EGFR与EGF结合后的激活过程中，静息状态下的EGFR单体位于细胞膜表面，细胞膜外有EGF结合位点，膜内有酪氨酸激酶片段。当存在EGF与EGFR结合后，两个EGFR相互靠近形成二聚体，使得EGFR的胞内酪氨酸激酶(TK)相互磷酸化。
EGFR TKI旨在通过EGFR TKI与EGFR TK特异性的结合以抑制酪氨酸激酶活性，阻滞EGFR自身磷酸化，进而干扰EGFR下游相关信号通路的正常转导。2002年，名为吉非替尼(Gefitinib)的EGFR TKI第一个被FDA批准上市，之后的几年内，厄洛替尼，拉帕替尼等第一代EGFR TKI陆续上市，分别针对不同类型的具有EGFR突变的NSCLC或其他类型癌症。其中吉非替尼针对最常见的NSCLC中EGFR突变类型(外显子19的缺失或外显子21的Leu858Arg替换)，但吉非替尼可能引起肝损伤，腹泻，皮肤反应等诸多副作用，并且在治疗中存在原发性和获得性耐药现象。第二代EGFR TKI主要为了解决耐药问题，但却收效甚微。如达克替尼，同样是针对EGFR的外显子19的缺失或外显子21的Leu858Arg替换的EGFR TKI，但由于其不可逆的抑制未突变的野生型EGFR，在27％的NSCLC临床实验中发现具有更加严重的毒性作用，在其他癌型中的临床试验仍在进行中。第三代的EGFR TKI在近五年中陆续进入临床试验阶段，部分药物药效正在评估过程中，而部分也以失败告终。
现阶段的NSCLC的靶向治疗中，吉非替尼上市时间久，在临床治疗中作为一线药物效果显著，吉非替尼仍是使用最广泛的EGFR TKI，却也并不完美。首先，吉非替尼耐药现象始终存在，主要分为原发性耐药与获得性耐药。有20％-30％的病人即使经病理学的检测发现具有EGFR突变，但仍然对吉非替尼不敏感，这样在治疗初期便表现出的耐药被称为原发性耐药。而更多的患者会对吉非替尼产生获得性耐药，即在吉非替尼治疗后期(10-14个月后)发生耐药。EGFR TKI获得性耐药常常归结于靶向药物对肿瘤细胞产生的选择性压力。最初NSCLC细胞大多具有EGFR突变并高表达于细胞表面，细胞会在吉非替尼等EGFR TKI的处理下死亡。以吉非替尼为例，在吉非替尼的筛选作用下，有少数细胞由于本身EGFR TK区具有基因突变，区域结构发生变化，无法与吉非替尼结合，EGFR功能不受EGFR TKI影响，在长期的药物处理下被筛选出来，导致肿瘤对吉非替尼的耐受性不断升高。同时还有一些细胞虽然可以与吉非替尼结合，但一些与EGFR信号类似的旁路信号发生变化或EGFR下游信号通路中的蛋白调节失衡，也会导致吉非替尼的药效不断降低。其次，吉非替尼虽是具有特异性的靶向药，也仍存在毒副作用。吉非替尼与EGFR的结合位点位于TK区，对野生型与突变型的EGFR并没有选择性，虽然NSCLC中EGFR的表达量高于正常组织，吉非替尼对正常细胞的毒性作用仍不可避免。加之获得性耐药现象的存在，吉非替尼的使用剂量会在治疗后期不断加大，随之毒副作用也不容忽视。第二代与第三代的EGFR TKI致力于解决以上两个问题，却仍没有重大进展。因此，吉非替尼治疗NSCLC中的耐药以及与之相伴随的毒副作用问题仍亟待解决。
发明内容
为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种细胞自噬通路激活剂作为EGFR TKI类药物增敏剂的应用。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一方面，本发明提供了一种细胞自噬通路激活剂作为EGFR TKI类药物增敏剂的应用。
另一方面，本发明提供了一种细胞自噬通路激活剂在制备提高非小细胞肺癌对EGFR TKI类药物敏感性的药物中的应用。
另一方面，本发明提供了一种细胞自噬通路激活剂与EGFR TKI类药物联用在制备清除非小细胞肺癌的药物中的应用。
再一方面，本发明提供了一种EGFR TKI类药物增敏剂，包括细胞自噬通路激活剂。
再一方面，本发明提供了一种清除非小细胞肺癌的药物组合物，包含至少一种EGFR TKI类药物，以及至少一种细胞自噬通路激活剂。
再一方面，本发明提供了一种清除对EGFR TKI类药物耐药的非小细胞肺癌的药物组合物，包含至少一种EGFR TKI类药物，以及至少一种细胞自噬通路激活剂。该药物组合物可以增强EGFR TKI类药物对耐药细胞的杀伤性，简洁且易于操作，在对具有EGFR高表达的耐药肺癌细胞治疗方面具有巨大的应用价值。
进一步地，所述细胞自噬通路激活剂为有效显著激活细胞自噬靶向药。
进一步地，所述细胞自噬通路激活剂包括雷帕霉素、放线菌素D、伊马替尼。
进一步地，所述EGFR TKI类药物为针对EGFR TK区域几种突变类型(G719X、T790M、外显子19缺失、L858R)的抑制剂。
进一步地，所述EGFR TKI类药物包括吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、达克替尼。
进一步地，所述细胞自噬通路激活剂和EGFR TKI类药物，采用已通过FDA批准上市应用与临床的药物。
进一步地，所述药物组合物中所用药物应为2种，不超过4种为宜。且两类药物应同时使用。
进一步地，所述药物组合物的给药方式灵活，可通过口服、注射给药，也可对给药顺序与时间进行调整。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种对耐药的肺癌细胞进一步清除的联合用药方案，所述的方案能够在EGFR TKI持续治疗，细胞产生耐药后进一步清除肿瘤。
(2)本发明所述的联合用药方案可以降低化疗药物剂量，降低毒副作用。能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例中药物对2D培养细胞的细胞毒性结果图。
图2为本发明实施例中药物对3D培养细胞的细胞毒性结果图。
图3为本发明实施例中药物对荷瘤裸鼠细胞毒性结果图，其中图(a)(b)为药物处理15天后荷瘤小鼠中的肿瘤组织，图(c)为药物处理下的肿瘤15天生长曲线图。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1使用吉非替尼与雷帕霉素两种药物，测试其在具有T790M二次突变的非小细胞肺癌H1975中的药效
具体如下：
引入2D、3D培养细胞，裸鼠三个层面的研究模型，以吉非替尼与雷帕霉素为例进行细胞毒性检测：
1)2D、3D培养细胞的实验
2D培养细胞的细胞活力检测用到了CCK8细胞活力检测试剂盒，3D培养细胞的细胞活力检测使用了“3D培养细胞活力检测试剂盒”。大致步骤与试剂盒说明书一致，其中关于细胞接种密度，药物处理步骤，药物处理时间等具体操作稍有变动。
2D培养细胞活力检测具体步骤如下：
(1)贴壁细胞消化后以5000个/孔的密度接种在96孔板中。
(2)待24小时细胞贴壁后移除培养基，改换为100μL由RPMI 1640培养基稀释溶解的不同浓度的雷帕霉素(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM)以及雷帕霉素(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM)+吉非替尼(5μM)，并置于培养箱中。
(3)连续培养48小时后每孔添加10μL CCK8溶液，培养箱中孵育一小时后用酶标仪检测450nm处的吸光度值，并通过吸光度计算不同处理下细胞相对于对照组(雷帕霉素与吉非替尼两者药物浓度同时为0)细胞活力。
药物对2D培养细胞的细胞毒性结果如图1所示，从图1可以看出，当雷帕霉素与吉非替尼(浓度为5μM)联合使用时，细胞活力相比于单独使用雷帕霉素或吉非替尼(浓度为5μM)进一步降低，表明两种药物具有协同作用。
3D培养细胞活力检测具体步骤如下：
(1)将3D培养细胞以1个/孔的密度接种于96孔板中。
(2)添加100μL由RPMI 1640培养基稀释溶解的不同浓度的雷帕霉素(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM)以及雷帕霉素(0μM、5μM、10μM、20μM、40μM)+吉非替尼(5μM)并置于培养箱中。
(3)连续培养48小时后添加3D培养细胞活力检测试剂100μL，室温静置30分钟后用酶标仪检测化学发光强度，并通过光强计算不同处理下细胞相对于对照组(雷帕霉素与吉非替尼两者药物浓度同时为0)细胞活力。
药物对3D培养细胞的细胞毒性结果如图2所示，从图2可以看出，当雷帕霉素与吉非替尼(浓度为5μM)联合使用时，细胞活力相比于单独使用雷帕霉素或吉非替尼(浓度为5μM)进一步降低，表明两种药物具有协同作用。
2)动物的实验
实验动物为4-6周的雌性裸鼠。将培养在培养皿中的H1975细胞用胰蛋白酶消化为分散细胞后，计数5×106个细胞并离心收集于200μL PBS中。收集的细胞在一小时内于小鼠后臀部皮下注射种瘤。待7天后将动物根据肿瘤大小随机分为四组：对照组(PBS)，吉非替尼(150mg/kg口服)，雷帕霉素(2mg/kg腹腔注射)，吉非替尼(150mg/kg口服)+雷帕霉素(2mg/kg腹腔注射)处理组，动物给药频率为每两天一次，测量肿瘤大小(肿瘤体积＝0.5×长×宽2)，从给药第一天算起第十五天后将肿瘤剥离，拍照。
药物处理15天后荷瘤小鼠中的肿瘤组织如图3(a)、3(b)所示，药物处理下的肿瘤15天生长曲线图如图3(c)所示，从图3(a)、3(b)中可以看出，联合用药处理下的肿瘤体积小于其他药物处理方式；从图3(c)中可以看出，联合用药处理下的肿瘤生长速度明显降低。