一种基于三维DNA Walker和滕氏蓝的双信号miRNA-21检测方法
阅读说明：本技术 一种基于三维DNA Walker和滕氏蓝的双信号miRNA-21检测方法 (Double-signal miRNA-21 detection method based on three-dimensional DNA Walker and Turnbull's blue ) 是由 汤娟 程宏丽 刘丽萍 高珊 于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于三维DNA Walker和MOF-Fe(II)诱导滕氏蓝生成的双信号miRNA-21检测方法。该方法是将亲和素修饰的MB与生物素修饰的发夹链H-(1)混合孵育后,再与发夹链H-(2)-Au NP-GOx探针及miRNA-21溶液混合孵育,得到DNA Walker产物；在葡萄糖溶液中加入DNA Walker产物进行催化反应,磁性分离,得到含过氧化氢的溶液；再利用MOF-Fe(II)与含过氧化氢的溶液反应并在电极诱导TB生成,以实现电化学检测,或者利用MOF-Fe(II)含过氧化氢的溶液并在溶液中诱导TB生成,以实现光热检测,从而可以用于miRNA的双信号检测,且对miRNA目标物检测下限低、选择性高。(The invention discloses a double-signal miRNA-21 detection method for inducing generation of Turnbull's blue based on three-dimensional DNA Walker and MOF-Fe (II). The method is to combine the MB modified by the avidin and the hairpin chain H modified by the biotin 1 After mixed incubation, the mixture is further mixed with hairpin chain H 2 Mixing and incubating an-Au NP-GOx probe and a miRNA-21 solution to obtain a DNA Walker product; adding a DNA Walker product into a glucose solution for catalytic reaction, and performing magnetic separation to obtain a solution containing hydrogen peroxide; then MOF-Fe (II) is used for reacting with a solution containing hydrogen peroxide and inducing TB generation at an electrode to realize electrochemical detection, or MOF-Fe (II) solution containing hydrogen peroxide is used for inducing TB generation in the solution to realize photothermal detection, so that the method can be used for double-signal detection of miRNA, has low detection lower limit on miRNA target substances, and is selectedThe performance is high.)
技术领域
本发明涉及一种miRNA-21的检测方法，具体是一种基于三维DNA Walker和MOF-Fe(II)诱导滕氏蓝即时生成的双信号miRNA-21检测方法，属于电化学和光热生物分析领域。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类短的非编码序列，长度为18～25个核苷酸，其在各种生物过程中发挥着至关重要的作用，例如：基因表达、转录、细胞增殖、分化、凋亡和造血作用。此外，miRNA的异常表达将导致癌症的形成、侵袭和转移。近年来，报道的许多与生物分析相结合的分析方法已成功用于miRNA快速定量或半定量分析，包括电化学、荧光、比色、表面等离子体共振和基于电化学发光的生物分析等。与其他方法相比，基于电化学和温度型的传感平台具有简单、低成本和高灵敏度等明显的优势，可实现miRNA的灵敏检测，但是现有技术中利用三维DNA Walker和MOF-Fe(II)诱导滕氏蓝生成同时实现miRNA-21电化学和光热检测方法还未见报道。
发明内容
为克服现有技术的不足与缺陷，本发明的目的是在于提供一种基于三维DNAWalker和 MOF-Fe(II)诱导滕氏蓝生成的双信号miRNA-21检测方法，该方法基于miRNA-21与发夹链H1的杂交反应，巧妙设计了DNA Walker信号扩增、GOx催化葡萄糖生成H2O2以及借助 MOF-Fe(II)的自牺牲原位生成滕氏蓝(TB)的信号转导策略，以实现对miRNA-21的高灵敏度、高选择性的双信号检测。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于三维DNA Walker和MOF-Fe(II)诱导滕氏蓝生成的双信号miRNA-21检测方法，可以通过电化学检测方法实现或者通过光热检测方法实现；
电化学检测方法包含以下步骤：
1)将亲和素修饰的MB与生物素修饰的发夹链H1混合孵育后，所得产物与发夹链H2-Au NP-GOx探针及miRNA-21溶液混合孵育，得到DNA Walker产物；在葡萄糖溶液中加入所述DNA Walker产物进行催化反应，磁性分离DNA Walker产物，得到含过氧化氢的溶液；
2)在电极表面滴加MOF-Fe(II)分散液，干燥，再在电极表面滴加所述含过氧化氢的溶液，进行孵育，再在电极表面滴加铁氰化钾溶液，进行反应，反应完成后，将电极置于缓冲溶液中进行电化学检测，得到电流响应值；
3)将一系列不同浓度的标准miRNA-21溶液替换步骤1)中的miRNA-21溶液进行步骤 1)和步骤2)，得到一系列电流响应值，并构建miRNA-21浓度与电流响应值之间的标准曲线；
4)将待测miRNA-21溶液替换步骤1)中的miRNA-21溶液进行步骤1)和步骤2)，获得相应电流响应值，并根据标准曲线计算待测miRNA-21溶液的浓度；
或者，
光热检测方法包含以下步骤：
I)将亲和素修饰的MB与生物素修饰的发夹链H1混合孵育后，所得产物与发夹链H2-Au NP-GOx探针及miRNA-21溶液混合孵育，得到DNA Walker产物；在葡萄糖溶液中加入所述DNA Walker产物进行催化反应，磁性分离DNA Walker产物，得到含过氧化氢的溶液；
II)在MOF-Fe(II)分散液中所述含过氧化氢的溶液，进行孵育，再加入铁氰化钾溶液，进行反应，反应完成后，进行光热检测，得到温度响应值；
III)将一系列不同浓度的标准miRNA-21溶液替换步骤I)中的miRNA-21溶液进行步骤I)和步骤2)，得到一系列温度响应值，并构建miRNA-21浓度与温度响应值之间的标准曲线；
IV)将待测miRNA-21溶液替换步骤I)中的miRNA-21溶液进行步骤I)和步骤II)，获得相应温度响应值，并根据标准曲线计算待测miRNA-21溶液的浓度；
作为一个优选的方案，亲和素修饰的MB与生物素修饰的发夹链H1混合后，在30～40℃温度，孵育20～40min，所得产物与发夹链H2-Au NP-GOx探针及miRNA-21溶液混合后，在 30～40℃下继续孵育1.0～2h。通过混合孵育可以使得miRNA-21充分打开发夹链H1，触发 DNA Walker机制，使得更多的发夹链H2-Au NP-GOx探针与发夹链H1配对结合，达到信号扩增效果。
作为一个优选的方案，亲和素修饰的MB与生物素修饰的发夹链H1的比例为4～6g:1～3μmol。进一步优选的方案，生物素修饰的发夹链H1浓度为2μM，亲和素修饰的MB的浓度为5mg mL-1。
本发明的DNA Walker产物主要是催化葡萄糖反应，利用GOx(葡萄糖氧化酶)催化葡萄糖转化成葡萄糖酸和过氧化氢(H2O2)。
作为一个优选的方案，所述MOF-Fe(II)通过以下方法制备得到：将醋酸亚铁水溶液加入到2-氨基对苯二甲酸的DMF溶液中混合均匀后，转入高压釜内，进行溶剂热反应。通过该方法制备的MOF-Fe(II)具有纳米级别，且颗粒均匀的米粒形状结构形貌，具有较大的表面积，且含有丰富的Fe2+，具有较高的反应活性，可以双氧水及K3[Fe(CN)6]反应生成具有强电活性的滕氏蓝。
作为一个优选的方案，醋酸亚铁与2-氨基对苯二甲酸的摩尔比为1:1～1.2。
作为一个优选的方案，所述溶剂热反应的条件为：在40～60℃温度下，反应0.5～1.5小时。
作为一个优选的方案，在葡萄糖溶液中加入DNA Walker产物进行催化反应的时间为 20～40min。
作为一个优选的方案，步骤2)中，在电极表面滴加含过氧化氢的溶液，进行孵育0.5～1.5min(能够将Fe(II)被氧化成Fe(III))，再在电极表面滴加铁氰化钾溶液，进行反应20～40 min(原位生成TB)。
作为一个优选的方案，步骤II)中，在MOF-Fe(II)分散液中含过氧化氢的溶液，进行孵育2～8min，再加入铁氰化钾溶液，进行反应10～20min。
本发明涉及的发夹链H2-Au NP-GOx探针通过以下方法合成：将金胶体采用Na2CO3溶液调节pH调节至9.0～9.5，形成稳定的金胶体溶液，再将包含发夹链H2和GOx的混合物添加至金胶体溶液中，孵育过夜后，离心分离，即得发夹链H2-Au NP-GOx探针。更具体的制备方法：使用Na2CO3水溶液将金胶体溶液pH调节至9.0～9.5，以防止其聚沉；在轻微震荡下，将包含发夹链H2和GOx(均为1.0mg mL-1)的混合物添加至的金胶体溶液(0.2mM) 中，4℃下孵育过夜后，将混合物在14000rpm下离心20分钟以分离未结合的发夹链H2和 GOx，将所得沉淀(即，发夹链H2-Au NP-GOx)重新分散于0.1M的PBS(pH 7.4)缓冲溶液中，该PBS溶液包含1.0wt％的BSA，并在4℃下储存以备使用。
本发明涉及的三维DNA Walker产物合成过程：先利用miRNA-21与发夹链H1的杂交反应，使得磁珠(MB)上的发夹链H1被打开；与此同时，加入可与发夹链H1发生碱基互补配对复合探针发夹链H2-Au NP-GOx，使目标miRNA-21被竞争释放，参与到下一个循环，如此不断重复，最终在磁珠上形成多条DNA双链体，反应结束后，磁性洗涤分离，去除多余的探针。
本发明涉及的DNA Walker产物催化葡萄糖溶液反应转化成H2O2的过程：将DNAWalker 产物与葡萄糖溶液混合孵育约30min，GOx发挥催化作用，生成H2O2和葡萄糖酸，磁性分离后，得到含双氧水的溶液。进一步优选，葡萄糖溶液的浓度为4mM。
本发明涉及的MOF-Fe(II)通过以下方法制备得到：将醋酸亚铁与2-氨基对苯二甲酸 (BDC-NH2)通过水热反应合成米粒状的MOF-Fe(II)。更具体的方案，先配置10mL 0.57M的FeAc2水溶液；随后，准确称取0.9g的BDC-NH2，加入30mL的DMF中，超声处理10 min左右，使其充分溶解；在搅拌的情况下，将FeAc2水溶液加入至BDC-NH2的DMF溶液中，搅拌15min后，转入高压釜内，使其在50℃下反应1小时；冷却至环境温度后，通过离心收集产物，并用DMF和无水乙醇分别洗涤3次；最后，将获得的红棕色产物在真空烘箱中干燥过夜。
本发明涉及的DNA Walker介导的TB原位生成方法：(a)将MOF-Fe(II)超声分散至溶液中，再滴加至GCE电极表面，室温下干燥；(b)将DNA Walker产物溶液滴加在MOF-Fe(II)/GCE上，孵育数分钟；(c)洗涤后，将K3[Fe(CN)6]滴至上述电极表面，并在室温下反应。进一步优选，MOF-Fe(II)分散液的浓度为0.5mg mL-1。DNA Walker产物溶液与 MOF-Fe(II)/GCE反应时间为1min。K3[Fe(CN)6]浓度为2mM。最优选的DNA Walker介导的TB原位生成方法：(a)将1mg的MOF-Fe(II)超声分散在2mL甲醇中，取4.5μL滴加至GCE电极表面，室温下干燥；(b)将DNA Walker反应所得的产物溶液滴加在MOF-Fe (II)/GCE上，孵育1min；(c)洗涤后，将浓度为2mM的K3[Fe(CN)]滴至上述电极表面，并在室温下反应，以原位生成TB。
本发明涉及的电化学检测过程中，采用含有KCl的磷酸缓冲液(PBS)为电解液，采用三电极系统检测电流值，即：GCE为工作电极；铂丝为对电极；Ag/AgCl为参比电极。所述的PBS的浓度为0.01M，pH为6.0。光热检测时，由于MOF-Fe(II)量的增加，与H2O2的反应时间延长至5min，激光波长为800nm，功率密度为2.63W·cm-2，照射时间为2min。
本发明合成的金属有机框架MOF-Fe(II)具有典型的米粒结构，且具有较大的特异性表面积，并含有大量的Fe2+，为TB的生成提供了丰富的原材料。当无目标物时，MOF-Fe(II)与K[Fe(CN)]反应生成大量的TB，具有较强的背景信号。而目标物的存在会使DNA 反应过程中生成H2O2，使得MOF-Fe(II)中的Fe(II)被氧化成Fe(III)，抑制了TB的生成，从而电化学信号降低。
本发明基于三维DNA Walker和MOF-Fe(II)诱导滕氏蓝生成的双信号miRNA-21检测方法具体的检测原理为：首先，当目标物存在时，MB上结合的大量发夹链H1被打开；随后，当加入发夹链H2-Au NP-GOx探针时，其可与H1竞争结合，在MB上负载GOx，并释放miRNA-21，被释放的目标物可参与下一个循环，经过一段时间反应，磁珠上将通过发夹链 H1与发夹链H2的碱基互补配对而负载更多的GOx，以达到信号扩增的效果。当向磁性复合物中加入葡萄糖时，其中的GOx可催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢(H2O2)。反应结束后，将含有H2O2的上清液滴加到MOF-Fe(II)修饰的玻碳电极(GCE)，使得Fe(II)被氧化成Fe(III)，从而抑制TB在MOFs表面形成，电化学信号降低。同样地，由于生成TB的量减少，因而光热效应降低，温差小，从而实现目标物的双信号检测。两种检测方法的信号响应值都与miRNA-21浓度在一定范围内成线性相关关系。因此，这种具有卓越的检测性能和优异的可行性的生物传感平台为miRNA-21的检测提供了一条新途径。
本发明提出的一种基于三维DNA Walker和MOF-Fe(II)诱导滕氏蓝生成的双信号miRNA-21检测方法，包含以下步骤：
(1)电化学生物传感器的构建：将10μL亲和素修饰的MB(Strep-MB，5mg mL-1) 与10μL生物素修饰的发夹链H1(2μM)混合，在37℃下孵育30min。磁性分离，磁性产物用Tris-HCl缓冲液(5mM，pH 7.4)洗涤三遍后，加入30μL的发夹链H2-Au NP-GOx探针(其中，发夹链H2浓度约为1.8μM，混合液中发夹链H2与发夹链H1的摩尔比约为2.5:1) 和浓度为0.001～100pM的目标miRNA-21，并用含有MgCl2(50mM)和KCl(1mM)的 Tris-HCl(10mM，pH 7.4)缓冲液定容至50μL；在37℃下混合孵育90min，使miRNA-21 充分打开发夹链H1，触发DNA Walker机制，使得更多的发夹链H2-AuNP-GOx探针与发夹链H1配对结合，达到信号扩增效果；随后，磁性洗涤后，加入50μL浓度为4mM的葡萄糖溶液(0.5mM，pH 7.0的PBS配置)继续反应30min，使GOx催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢(H2O2)，而H2O2可将MOF-Fe(II)中的Fe(II)被氧化成Fe(III)，抑制TB的生成；
步骤(1)所述的三维DNA Walker反应形成接有大量GOx的双链DNA由下述步骤进行：
先利用miRNA-21与发夹链H1的杂交反应，使得磁珠上的发夹链H1被打开；与此同时，加入可与发夹链H1发生碱基互补配对复合探针发夹链H2-Au NP-GOx，使目标miRNA-21被竞争释放，参与到下一个循环，如此不断重复，最终在磁珠上形成多条DNA双链体；反应结束后，磁性洗涤分离，去除多余的探针。
步骤(1)所述的H2O2的生成过程及其与MOF-Fe(II)的反应由下述步骤进行：
向上述产物中加入浓度为4mM的葡萄糖溶液，混合孵育约30min，GOx发挥催化作用，生成H2O2和葡萄糖酸；磁性分离后，将上清液滴加至修饰有MOF-Fe(II)的电极表面，继续孵育1min，使MOF-Fe(II)中的Fe(II)被氧化成Fe(III)。
步骤(1)所述的MOF-Fe(II)的制备方法及TB的原位生成由下述步骤制备：
(a)先配置10mL 0.57M的FeAc2水溶液；随后，准确称取0.9g的BDC-NH2，加入 30mL的DMF中，超声处理10min左右，使其充分溶解；在搅拌的情况下，将FeAc2水溶液加入至BDC-NH2的DMF溶液中，搅拌15min后，转移至高压反应釜内，使其在50℃下反应1小时；冷却至环境温度后，通过离心收集产物，并用DMF和无水乙醇分别洗涤3次；最后，将获得的红棕色产物在真空烘箱中干燥过夜。
(b)将1mg的MOF-Fe(II)超声分散在2mL甲醇中，取4.5μL滴加至GCE电极表面，室温下干燥；将DNA Walker反应所得的产物溶液滴加在MOF-Fe(II)/GCE上，孵育 1min；洗涤后，将浓度为2mM的K[Fe(CN)]滴至上述电极表面，并在室温下反应，以原位生成TB。
(2)miRNA-21电化学检测：取4.5μL的MOF-Fe(II)(0.5mg/mL)滴至GCE，在室温下干燥。之后，取10μL DNA Walker反应所得的上清液于MOF-Fe(II)/GCE电极，在室温下孵育1min，随后用超纯水轻轻冲洗电极表面。最后，将10μL 2mM的K[Fe(CN)] 滴至上述电极表面，并在室温下反应30min，使得没有被H2O2氧化的MOF-Fe(II)可与 K[Fe(CN)]充分反应生成滕氏蓝(TB)，产生电化学信号。采用三电极系统，以0.01M的 PBS为电解液，利用差分脉冲伏安法(DPV)检测电化学响应。由于步骤(1)中加入的 miRNA-21的浓度各不相同，所以在磁珠上生成的DNA双链体的数量也不同，即含有不同数量的GOx，致使生成的H2O2量也不同，从而MOF-Fe(II)被氧化的Fe(II)的数量也不同，导致生成的TB的量也不同，所以电化学响应降低的幅度也不同。重复以上操作，即可根据电流响应值对标准样浓度的对数绘制标准曲线；用待测液代替miRNA-21标准溶液进行上述检测，通过标准曲线获得浓度结果。
(3)miRNA-21光热检测：DNA反应过程与步骤(2)相同，在含有40μL浓度为100 mgL-1的MOF-Fe(II)中加入50μL含有H2O2的DNA反应的上清液，孵育5min。随后，加入10μL浓度为2mM的K[Fe(CN)]溶液。反应结束后，将混合溶液用波长为808nm 的激光持续照射2min。记录照射前后的温差，即可根据温差对标准样浓度的对数绘制标准曲线；用待测液代替miRNA-21标准溶液进行上述检测，通过标准曲线获得浓度结果。
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：
1)本发明采用自牺牲法，利用MOF-Fe(II)与K[Fe(CN)]反应生成同时具有强电活性和光热效应的滕氏蓝来产生信号，可实现对目标物的双信号检测，极大地体现了此生物传感器的多功能性。
2)本发明的MOF-Fe(II)通过水热反应一步合成，合成方法简单，成本低，且获得的MOF-Fe(II)具有纳米级别的米粒形状，表面积较大，且含有丰富的Fe2+，反应活性较高。
3)本发明通过基于生物分子的扩增策略来提高检测灵敏度，三维DNA Walker信号扩增反应由目标物触发，且释放的目标物可进行循环扩增，因而大量修饰有GOx的H2与H1杂交，生成含有大量GOx的DNA双链体。加入葡萄糖后，可催化产生大量的H2O2，以氧化 MOF-Fe2 +中的Fe(II)，抑制TB的生成，达到信号放大的目的；
4)本发明构建的用于miRNA-21检测的信号降低型双信号传感策略，在1fM-100pM浓度范围内，电流和温度差与目标物浓度对数存在良好的线性关系，具有线性范围宽、检测线低的优点。
附图说明
图1为一种基于三维DNA Walker和MOF-Fe(II)诱导滕氏蓝即时生成的双信号MicroRNA-21 检测方法的原理示意图。
图2(A)和(C)分别为米粒状MOF-Fe(II)的扫描电镜图和透射电镜图；图2(B)和(D)分别为TB的的扫描电镜图和透射电镜图。
图3为实施例1对标准样检测结果，A：实施例1检测目标物浓度与对应的电化学响应曲线图；B：实施例1电化学响应值与检测目标物浓度对数线性图；C：实施例1检测目标物浓度与对应的热成像图；D：实施例1温度差值与检测目标物浓度对数线性图。
图4为实施例1的选择性和重现性考察结果。
图5中A和B分别为合成DNA Walker产物过程中反应时间和孵育温度对DNA Walker扩增程度的影响；C和D分别为DNA Walker产物催化葡萄糖产生双氧水的时间以及TB形成时间对电化学信号强度的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。
实施例1
(1)先配置10mL 0.57M的FeAc2水溶液；随后，准确称取0.9g的BDC-NH2，加入 30mL的DMF中，超声处理10min左右，使其充分溶解；在搅拌的情况下，将FeAc2水溶液加入至BDC-NH2的DMF溶液中，搅拌15min后，转入高压釜内，使其在50℃下反应1 小时；冷却至环境温度后，通过离心收集产物，并用DMF和无水乙醇分别洗涤3次；最后，将获得的红棕色产物在真空烘箱中干燥过夜。
(2)将1mg步骤(1)制得的MOF-Fe(II)粉末超声分散在2mL的甲醇中，并取4.5L 滴加在GCE表面。室温下干燥后，得到MOF-Fe(II)/GCE电极。
(3)将10μL亲和素修饰的MB(Strep-MB，5mg mL-1)与10μL生物素修饰的发夹链H1(2μM)混合，在37℃下孵育30min。磁性分离，磁性产物采用Tris-HCl缓冲液(5mM， pH 7.4)洗涤三遍后，加入30μL的发夹链H2-Au NP-GOx探针(其中，发夹链H2浓度约为 1.8μM，混合液中发夹链H2与发夹链H1摩尔比约为2.5:1)和浓度为1pM的目标miRNA-21，并用含有MgCl2(50mM)和KCl(1mM)的Tris-HCl(10mM，pH 7.4)缓冲液定容至50μL；在37℃下混合孵育90min，使miRNA-21充分打开发夹链H1，触发DNA Walker机制，使得更多的发夹链H2-AuNP-GOx探针与发夹链H1配对结合，达到信号扩增效果；
(4)将步骤(3)所得的DNA Walker产物磁性洗涤后，加入50μL浓度为4mM的葡萄糖溶液(0.5mM，pH 7.0的PBS配置)继续反应30min，使GOx催化葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢(H2O2)；磁性分离，将所得的上清液在4℃下储存。
(5)取10L步骤(4)所得的产物溶液滴加在步骤(2)的电极上，室温下孵育1min，以氧化电极表面修饰的MOF-Fe(II)中的Fe(II)；将浓度为2mM的K[Fe(CN)]滴至上述电极表面，并在室温下反应，以原位生成TB。洗涤后，以0.01M PBS(pH 6.0)为电解液，采用差分脉冲伏安法(DPV)检测电化学响应。同样地，将混合溶液用波长为808nm的激光持续照射2min进行光热检测，记录照射前后的温差。由于DNAWalker的信号放大作用，使得电流响应值和温差显著降低，且电流响应值和温差都与miRNA-21浓度具有确定的关系，从而实现对miRNA-21的灵敏检测；用待测液代替miRNA-21标准液进行上述检测，通过标准曲线获得浓度结果。
实施例1所用DNA序列如下：
图1为本发明所涉及的一种基于三维DNA Walker和MOF-Fe(II)诱导滕氏蓝生成的双信号miRNA-21检测方法的原理及过程示意图。图2为MOF-Fe(II)和原位生成的TB的扫描电镜图和透射电镜图。扫描电镜图显示MOF-Fe(II)呈典型的米粒状形貌，直径大约在 250～300nm之间。生成TB后，MOF-Fe(II)米粒表面生成了小颗粒，且原有形貌部分破碎，但是分布更加均匀，证明生成的TB的分散性更好。图3为实施例1对标准样检测结果，随 miRNA-21浓度的增加，电流和温度均呈减低趋势。如图3B和3D显示，在1fM-100pM的 miRNA-21浓度范围内，电流响应值和温差与目标物浓度对数存在良好的线性关系。此外，为了证明此发明在生活中的实际应用性，我们还考察了该方法对miRNA-21的选择性和重现性。实验结果表明(图4A)，高浓度干扰物的电流值与单独的目标物的电流大小相近。此外，五个平行传感器检测结果的相对标准偏差(RSD)都小于5％，具有良好的重现性(图4B)。因此，此种用于miRNA-21检测的方法具有良好的选择性和重现性。
条件优化实验：
1、对合成DNA Walker产物条件的优化(包括反应时间和孵育温度)。
为了实现电化学生物传感平台对miRNA-21的灵敏检测，通过使用差分脉冲伏安法对相关实验条件及参数进行了优化。首先，在含有0.1M KCl的PBS(0.01M，pH 6.0)溶液中探究合成三维DNA Walker的反应条件对传感平台的影响。如图5(A)所示，DPV信号随反应时间从20min增加到90min而减小，而当反应时间进一步延长到110min时，信号达到平稳状态。因此，合成三维DNA Walker的最佳反应时间选用90min。此外，如图5(B)所示，在孵育温度逐渐增加到37℃时，DPV信号逐渐减小，而当孵育温度从37℃继续上升到47℃时，信号逐渐增大。这种现象说明当温度超过37℃时，DNA Walker扩增的程度受到影响，仅有部分H1和H2杂交，产生少量的H2O2，导致信号降低的幅度减小。因此，DNA Walker反应最佳孵育温度为37℃。
2、对DNA Walker产物催化葡萄糖产生双氧水的时间以及TB形成时间的优化：
GOx对葡萄糖的催化时间以及TB的形成时间对传感器的检测效果也很关键。图5(C) 表明，DPV响应电流值随GOx对葡萄糖的催化时间的增加而减小，30min时电流值最低，30min之后电流值逐渐趋于稳定，即葡萄糖可以在一定时间内被GOx氧化为葡萄糖酸和H2O2，所以催化时间的长短直接决定产生H2O2的量。因此，选择30min作为GOx对葡萄糖的最佳催化时间。对于TB形成时长，随着时间的增加，K[Fe(CN)]会争夺MOF-Fe(II) 中更多的Fe2+，即越来越多的TB在电极表面生成，从而产生更强的电化学信号。从图5(D) 可以看出，当反应时间为30min时，DPV信号达到最低值并保持稳定，这表明电极表面 K[Fe(CN)]与MOF-Fe2+的反应达到一个饱和状态。因此，选择30min作为TB生成的最佳反应时长。
以上所述仅为本发明的最佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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