具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于现有检测人参皂苷Rg3的方法存在设备复杂仪器维护成本高和样品前处理过程繁琐耗时等缺点，本发明提出了一种电化学传感器及制备方法与其在检测人参皂苷Rg3中的应用。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种电化学传感器，包括电极，所述电极表面附着复合材料和分子印迹聚合物，所述复合材料为多壁碳纳米管与碳化钛的复合物，所述分子印迹聚合物的模板为人参皂苷Rg3。

本发明采用多壁碳纳米管与碳化钛进行复合，产生了协同快速电子转移能力、电化学面积大、良好的催化活性等优势，有利于放大电化学信号，从而提高传感器的灵敏度。

本发明采用模板为人参皂苷Rg3的分子印迹聚合物增加电化学传感器对人参皂苷Rg3的特异性。

本发明通过多壁碳纳米管与碳化钛复合材料与模板为人参皂苷Rg3的分子印迹聚合物进行配合协同，使形成的电化学传感器具有较高的再生能力，有利于电化学传感器的重复利用，进一步降检测低成本。

分子印迹聚合物的聚合单体，可以为邻苯二胺、吡咯、酚类等，其中采用邻苯二胺的效果更好。该实施方式的一些实施例中，所述复合材料为多壁碳纳米管、碳化钛与邻苯二甲酸二甘醇二丙烯酸酯的复合物。研究表明，当复合材料中增加邻苯二甲酸二甘醇二丙烯酸酯时，能够对复合材料起到分散稳定的作用，从而能够进一步增加电化学传感器对人参皂苷Rg3的检测性能。

该实施方式的一些实施例中，所述分子印迹聚合物为聚邻苯二胺。

该实施方式的一些实施例中，多壁碳纳米管与碳化钛的质量比为2.5～3.5:1。

该实施方式的一些实施例中，电极表面依次覆盖复合材料层和分子印迹聚合物。

本发明的另一种实施方式，提供了一种电化学传感器的制备方法，将多壁碳纳米管与碳化钛加入至含有邻苯二甲酸二甘醇二丙烯酸酯的溶剂中进行复合获得多壁碳纳米管、碳化钛与邻苯二甲酸二甘醇二丙烯酸酯的复合材料，采用复合材料对电极表面进行修饰形成修饰电极；以邻苯二胺为功能单体，以人参皂苷Rg3为模板分子，在修饰电极表面进行电聚合形成分子印迹聚合物，即获得电化学传感器。

研究表明，相比单壁碳纳米管，多壁碳纳米管具有独特的表面效应、良好的机械强度、导电能力和较强的催化性能，更易于功能化，使得获得的电化学传感器的检测效果更好。

本发明采用电聚合(电化学聚合)，具有可控性好、重复性优良、印迹空穴不易变形等优点。本发明制备分子印迹聚合物具有更好的选择性和吸附能力。

该实施方式的一些实施例中，复合方法为超声处理。有利于多壁碳纳米管与碳化钛的复合，同时能够将邻苯二甲酸二甘醇二丙烯酸酯插入至多壁碳纳米管内及碳化钛的层间，增加材料的活性。

该实施方式的一些实施例中，复合后进行离心洗涤，然后添加水制成复合材料溶液。能够将未复合的材料去除，并增加复合材料对电极修饰的便捷性。

在一种或多种实施例中，采用乙醇与水的混合溶液进行离心洗涤。离心洗涤的转速为13000～15000rpm。

该实施方式的一些实施例中，对电极修饰前，先对电极进行抛光、清洗。有利于电极的修饰效果。

该实施方式的一些实施例中，电聚合的缓冲溶液为醋酸溶液。

该实施方式的一些实施例中，电聚合在0～1.2V电位范围内进行，扫描速率为50～150mV·s^-1。聚合循环圈数也会影响电化学传感器的检测性能，当聚合循环圈数为10圈时，分子印迹聚合物的膜厚度更为合适，检测性能更好。

该实施方式的一些实施例中，电聚合才采用甲醇与乙酸的混合溶液将模板洗脱。经过研究表明，洗脱时间也会影响电化学传感器的检测性能，当洗脱时间为11.5～12.5min时，响应电流更高，检测性能更好。

该实施方式的一些实施例中，邻苯二胺与人参皂苷Rg3的质量比为1:0.9～1.1。经过研究表明邻苯二胺与人参皂苷Rg3的质量比影响电化学传感器的检测效果，当其质量比为1:0.9～1.1时，识别位点更合适，检测效果更好。

本发明的第三种实施方式，提供了一种上述电化学传感器在检测人参皂苷Rg3中的应用。

本发明的第四种实施方式，提供了一种人参皂苷Rg3的检测方法，以上述电化学传感器作为工作电极，以铁氰化钾作为电化学活性探针，对含有人参皂苷Rg3的待测溶液进行电化学检测。

该实施方式的一些实施例中，采用三电极电化学检测。

该实施方式的一些实施例中，采用循环伏安法(CV)/或差分脉冲伏安法(DPV)进行电化学检测。

CV检测的电压范围为-0.4V～0.8V,扫描速率为40～60mV·s^-1。DPV的电压范围为从-0.2～0.7V，扫描速率为40～60mV·s^-1。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

电化学传感器的制备方法，如图1所示，步骤如下：

1.称量1.5mg MWCNT(购买于南京先丰纳米材料科技有限公司)和0.5mg Ti₃C₂T_x(购买于南京先丰纳米材料科技有限公司)分散在1mL 0.5wt％PDDA溶液中。超声处理2h，搅拌120min，然后用水和乙醇(v/v,1:1)在14000rpm条件下离心洗涤4次，每次洗涤5min。弃去上清液，等量加水至1mL得到均匀的纳米复合材料悬浮液，纳米复合材料记为MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA，在4℃下保存备用。

2.用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉对裸GCE进行预抛光，得到光滑的镜面，然后用超纯水和乙醇的混合溶液超声3min，去除物理吸附物质。对电极进行修饰前，将清洗后的电极在N₂下干燥。

3.将7μL的MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA悬浮液(2mg·mL^-1)小心滴入GCE表面，将修饰电极在空气中干燥约40min，得到MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE。然后将MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE浸于5mL含1mg·mL^-1o-PD、1mg·mL^-1人参皂苷Rg3的0.1mol·L^-1醋酸缓冲液(ABS,pH 5.2)中。电聚合过程在0～1.2V电位范围内进行，扫描速率为100mV·s^-1，循环10次。

4.将电聚合后的电极在甲醇-乙酸溶液(v/v,9:1)中洗脱12min，以去除人参皂苷Rg3模板。所得电极用去离子水洗涤，37℃干燥，获得MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA传感器(记为MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE)。

实施例2

本实施例与实施例1相同，不同之处在于：步骤3中，在电聚合过程中没有添加人参皂苷Rg3，获得NIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA传感器(记为NIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE)。

实施例3

本实施例与实施例1相同，不同之处在于：省略步骤1，步骤3中未采用MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA对GCE进行修饰。获得MIP传感器(记为MIP-GCE)。

实施例4

本实施例与实施例1相同，不同之处在于：步骤1中为添加MWCNT，步骤3中，直接采用Ti₃C₂T_x-PDDA对GCE进行修饰。获得MIP-Ti₃C₂T_x-PDDA传感器(记为MIP-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE)。

实施例5

本实施例与实施例1相同，不同之处在于：步骤1中为添加Ti₃C₂T_x，步骤3中，直接采用MWCNT-PDDA对GCE进行修饰。获得MIP-MWCNT-PDDA传感器(记为MIP-MWCNT-PDDA/GCE)。

对于制备的电化学传感器进行性能检测如下。

电化学分析：

电化学检测采用标准的三电极电化学测试装置，以纳米材料和分子印迹聚合物修饰的玻碳电极作为工作电极，银/氯化银(Ag/AgCl)、铂丝分别作为参比电极和对电极。选用铁氰化钾K₃[Fe(CN)₆]作为电化学活性探针，采用循环伏安法和差分脉冲伏安法对传感器的电化学性能进行评价。观察到电化学探针可以通过腐蚀腔到达电极表面。当人参皂苷Rg3分子重新附着在这些空腔上时，它们会阻碍探针的到达和电子的转移。因此，电化学信号的减少与人参皂苷Rg3分子重新吸附在MIP上的数量成正比。氧化还原探针电流响应的变化(ΔI)计算为人参皂苷Rg3重吸附前后测定的氧化峰电流的差值。所有的电化学实验都是在含0.5mol·L^-1KCl的10mM K₃[Fe(CN)₆]溶液中进行的。CV检测的电压范围为-0.4V～0.8V,扫描速率为50mV·s^-1。DPV的电压范围为从-0.2～0.7V，扫描速率为50mV·s^-1。所有电化学实验均在室温下进行。

实际样品分析：

选择人参Rg3片、人参浸膏粉和人参压片糖果3种真实样品进行测定。检测过程为：研磨后称量样品，用去离子水稀释成1000μg·mL^-1样品溶液。在样品中加入规定浓度的人参皂苷Rg3进行回收率试验；将600μL样品溶液和400μL1000μg·mL^-1人参皂苷Rg3标准溶液混合至1000μL后，在分子印迹电极中加入8μL混合溶液进行标准回收率测定。

结果分析

1、MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA的表征。

如图2A所示，观察到多壁碳纳米管为空心管状结构。如图2B所示，可以清晰地看到Ti₃C₂T_x-PDDA约为数百纳米的薄层状结构。图2C为Ti₃C₂T_x附着在MWCNT管状结构表面的示意图。可以看出，合成产物具有尺寸为200nm的MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA的结构特征。由图1D可知，扫描电镜图像显示MWCNT为管状结构。从图1E中可以看到一个典型的类似手风琴的Ti₃C₂T_x多层结构。如图1F所示，Ti₃C₂T_x被弯曲的MWCNT包裹，并逐渐交联形成纳米多孔网络，促进电子和质子的转移，表明碳化钛有效地包裹在碳纳米管中，分布均匀。根据上述表征，确定了MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA纳米复合材料已成功构建。

2、工作电极的修饰。

为了提高工作电极的电化学性能，将MWCNT-PDDA、Ti₃C₂T_x-PDDA和MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA对工作电极进行修饰。在10mM K₃[Fe(CN)₆]溶液中进行了CV实验，研究了裸电极和改性电极的电化学性能。如图2G所示，可以观察到裸电极和修饰电极均有一个明显的归属于铁氰化物离子氧化还原峰。结果表明，随着电极的修饰，氧化还原的峰值电流逐渐增大。MWCNT-PDDA/GCE(曲线c)和MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE(曲线d)的氧化还原峰显著高于GCE(曲线a)和Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE(曲线b)，其中MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE的氧化还原峰最大。这可能是因为MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA显著提高了电极的电导率，从而促进了电子转移。另外，记录了基于不同修饰电极的传感器的DPVs(图2H)，可以观察到MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE的峰值电流大于其他修饰电极。结果表明，MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA修饰的GCE显著提高了电极的电化学性能。因此，在后续的实验中，该复合材料被用来修饰工作电极。

3、MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA电极的制备与形貌表征。

MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE在人参皂苷Rg3和o-PD(m/m,1:1)的聚合物溶液中进行电聚合，在电极表面形成MIP膜。MIP膜的厚度受聚合循环次数的控制。得到的CV曲线如图3所示。曲线显示，随着扫描次数的增加，峰值电流急剧下降，扫描10次后保持不变，这是因为合成的MIP膜阻止了氧化还原标记物进入电极表面。这些结果表明MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE成功制备。

采用扫描电镜对电极的形貌进行了表征。如图4A所示，在MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE上电聚合后，观察到分子印迹膜均匀光滑。随后，人参皂苷Rg3分子被洗脱后导致修饰电极表面孔穴增多(图4B)，表明模板分子从聚合物中被成功洗脱。对于图4C中人参皂苷Rg3在MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE上的重吸收，可以观察到粗糙表面上的印迹空腔被有效填充，表明MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE有特定的印迹位点。与MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE相比，图4D的SEM图像显示NIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE表面更加模糊和致密。结果表明，MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA纳米复合材料表面成功合成了分子印迹膜。

4、修饰电极的电化学性能。

利用循环伏安法分析了不同改性层的电化学行为和特性。以含0.5mol·L^-1KCl的10mM K₃[Fe(CN)₆]溶液为支撑电解质，用CV分析了改性层的电子传递容量。实验结果如图5A所示，可以看出MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA纳米复合材料在GCE上改性后的氧化还原峰电流达到了120μA左右(曲线a)，可以大大提高传感器的电导率。与MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE相比，MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA(曲线b)的峰值电流明显降低，这可能是由于MIP膜的形成阻碍了电子的传导。去除模板后，会产生一些三维的印迹空腔，增强了电子扩散，加速了氧化还原反应。因此，信号显著增强是由于有效的模板移除(曲线c)。此外，当人参皂苷Rg3添加到MIP电极的表面，其峰值电流大幅下降(曲线d)，表明人参皂苷Rg3在MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE表面有特异性吸附。曲线e显示，NIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE在没有模板分子的情况下聚合，由于在电极表面形成致密膜，因此电信号最低。

为了提高传感器的灵敏度，制备了4种不同的传感界面(实施例1、实施例3～5)并比较了其对不同浓度人参皂苷Rg3的电流响应情况。如图6所示，MIP-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE电极(图6A)的电流响应ΔI明显高于MIP-GCE电极(图6B)，这是由于Ti₃C₂T_x-PDDA修饰后GCE的比表面积增加所致。令人惊讶的是，MIP-MWCNT-PDDA/GCE(图6C)的ΔI值是GCE的40倍。推测碳管加速了GCE表面电化学反应的电子传递，有效地放大了电流信号。与MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE相比(图6D)，可以发现MIP-MWCNT-PDDA/GCE对人参皂苷Rg3的响应电流从人参皂苷Rg3浓度1mg·mL^-1到1.5mg·mL^-1、1.5mg·mL^-1到2mg·mL^-1时降低了约40μA。此外，该传感界面对2mg·mL^-1人参皂苷Rg3的响应电流很小，说明不适合在较大的浓度范围内检测。因此，综合考虑后，选择MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE为最佳传感界面。

通过分析扫描速率对氧化还原电流的影响，研究了分子印迹电化学传感器的动力学。在10mM铁氰化钾溶液中，随着扫描速率从10mV·s^-1增加到150mV·s^-1，检测了MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE的电化学性能。从图5B可以看出，扫描速率的平方根与峰值电流密度之间存在良好的线性关系。随着扫描速率的增加，氧化还原反应的最大电流呈线性增加。此外，氧化还原峰之间的距离越来越远。基于这些结果，对氧化峰(Ipa)和还原峰(Ipc)的峰值电流与扫描速率的平方根(v^1/2)进行了线性拟合。最终的线性回归方程为Ipa＝21.69v^{1 /2}－40.29，Ipc＝-23.24v^1/2+28.29，相关系数分别为0.9991和0.9986(图5C)。计算结果表明，电化学信号是扩散控制的表面催化反应的结果。

5、实验条件的优化。

为了提高MIP电化学传感器的选择性和灵敏度，考察了聚合循环圈数、功能单体与模板分子的比例、洗脱时间等因素对其性能的影响。采用DPV技术研究了分子印迹电化学传感器对1mg·mL^-1人参皂苷Rg3的电化学响应，并对其电化学性能进行了评价。分子印迹膜的厚度往往影响人参皂苷Rg3的印迹腔的数量和扩散速率，这可以通过调节电聚合的聚合循环圈数来控制。图7A显示了聚合圈数对电流响应的影响。研究发现，人参皂苷Rg3的氧化峰的响应电流随着聚合循环圈数的增加而相应增大，表明有更多的印迹位点的形成。在10圈时，响应电流最大。这是由于膜太薄，无法形成稳定的膜，而聚合物膜太厚，无法抑制人参皂苷Rg3的扩散速率。因此，在接下来的测定中，选择10圈为最佳聚合循环圈数。

模板分子与功能单体的比例对聚合物基质中印迹位点的数量有重要影响，而印迹位点的数量又会影响MIP传感器的性能。制备人参皂苷Rg3与o-PD不同配比(3:1、2:1、1:1、1:2、1:3)的MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA传感器。如图7B所示，随着功能单体的增加，电流响应ΔI不断增加。这可能是因为较少的单体不能结合足够的模板分子，导致MIP膜上的识别位点较少。当比值大于1:1时，ΔI开始下降，可能是单体过量导致识别位点或结合腔减少的原因。结果表明，人参皂苷Rg3与o-PD的最佳配比为1:1。

考察了洗脱时间对去除模板分子的影响，如图7C所示。随着洗脱时间的延长，电流响应增加，说明模板分子逐渐被去除。在甲醇-乙酸混合溶液(v/v,9:1)中，从印迹部位提取人参皂苷Rg3再生MIP传感器。MIP传感器的最大响应电流在12min时达到，因此选择12min为最佳洗脱时间。

6、电分析传感器性能特性。

为评价所制备传感器的性能，在最佳条件下使用MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA对不同浓度人参皂苷Rg3进行DPV试验。如图8A所示，MIP传感器的峰值电流随着人参皂苷Rg3浓度的增加而减小，在10-2000μg·mL^-1范围内，电流响应(ΔI)与人参皂苷Rg3浓度呈线性关系。回归方程为:ΔI＝0.042c+2.499，检出限(S/N＝3)为0.34μg·mL^-1(图8B)。式中ΔI为人参皂苷Rg3孵育前后的氧化峰电流强度的差值，c为人参皂苷Rg3浓度。根据曲线拟合，我们计算出该传感器的灵敏度为0.5945μA·μg·mL^-1·cm^-2，表明新制备的MIP传感器具有较高的灵敏度。由于目前针对人参皂苷Rg3含量测定的检测方法较少，因此该传感器有望成为一种基于电化学信号响应的新的检测方法。

7、重复性、选择性和抗干扰性研究。

电化学传感器的可重复性是影响分子印迹电化学传感器适用性的主要参数。图9A记录了相同条件下MIP电极洗脱模板分子时五根修饰电极的峰值电流。5根电极的相对标准偏差(RSD)为2.67％，结果令人满意。采用DPV对人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re等结构类似物进行了研究，探讨其传感器选择性。图9B所示，所构造的传感器对人参皂苷Rg3有很强的信号响应,响应电流是人参皂苷Rb1的60倍(a)和人参皂苷Rg1的4.5倍(c)。抗干扰性是评估MIP传感器性能的一个重要的指标。本文研究了人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re等物质在1mg mL^-1人参皂苷Rg3存在时的潜在干扰。图9C的结果显示，加入5倍干扰物质后没有明显的影响。上述结果证实了MIP传感器具有良好的选择性和特异性，这可以归因于聚合物基体中丰富的空腔与模板在尺寸、形状和功能上是互补的。

8、真实样品中人参皂苷Rg3的检测。

为进一步证明该方法的可行性，采用MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE对人参皂苷Rg3片(每片含23.7mg Rg3)、人参浸膏粉(每袋含25mg Rg3)、人参压片糖果(每片含20mg Rg3)3个样品进行了检测。样品研磨后，用去离子水配制1000μg·mL^-1样品溶液。将600μL样品溶液和400μL 1000μg·mL^-1人参皂苷Rg3标准溶液混合至1000μL后，在分子印迹电极中加入8μL混合溶液进行标准回收率测定。表1显示了可测量的结果。

表1人参皂苷Rg3实际样品分析结果(n＝3)

表1显示该方法加标回收率为96.93～105.35％，表明该分子印迹电化学传感器对复杂样品中人参皂苷Rg3具有较好的定量分析能力。

讨论

基于表面分子印迹技术和MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA纳米材料扩增技术，建立了一种特异性高、灵敏度高的检测人参皂苷Rg3的分子印迹电化学传感器。多孔MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA纳米复合材料有效地提供了大的电化学活性区域和优良的导电性。人参皂苷Rg3分子的MIP层特异性空腔可以同时识别和定量Rg3，因此具有高选择性和抗干扰性能。此外，MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA与MIP组合对人参皂苷Rg3的电催化氧化具有良好的协同作用。所制备的MIP-MWCNT-Ti₃C₂T_x-PDDA/GCE具有较高的再生能力。人参皂苷Rg3在10～2000μg·mL^-1浓度范围内与响应电流呈现良好的线性关系，检出限为0.34μg·mL^-1。建立的电化学检测方法已成功应用于实际食品样品中人参皂苷Rg3的检测，回收率良好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。